本發(fā)明屬于食品生物的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定腸膜明串珠菌腸膜亞種的引物及其方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，通過分離篩選的方法獲得的腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesensteroides)是一種植物附生菌，常見于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和泡菜中。因其能發(fā)酵產(chǎn)生乳酸及雙乙酰類物質(zhì)，被認(rèn)為對這些傳統(tǒng)食品的風(fēng)味有重要貢獻。2012年衛(wèi)生部將腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostoc mesensteroides subsp.mesenteroides)列入可用于食品的菌種目錄(衛(wèi)生部公告2012年第8號)，關(guān)于腸膜明串珠菌的發(fā)酵特性及其特殊生理活性的研究逐步深入。已有研究證實，腸膜明串珠菌能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，具有高產(chǎn)酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。目前腸膜明串珠菌腸膜亞種在食品領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用于風(fēng)味劑；并且因其特殊的生理活性，未來有望成為新型微生態(tài)制劑。

特性的腸膜明串珠菌菌株是未來功能性食品開發(fā)的一個重要方向。已有很多學(xué)者從傳統(tǒng)食品中分離到具有良好發(fā)酵特性及生理活性的菌株。然而，目前對于腸膜明串珠菌腸膜亞種的鑒定尚缺少十分高效的技術(shù)手段。傳統(tǒng)的生化鑒定方法繁瑣、耗時；經(jīng)典的分子生物學(xué)方法基于16S rDNA序列進行鑒定，但這種方法只能實現(xiàn)種水平的鑒定，對于亞種水平的鑒定無能為力。有研究者以某些看家基因，如gyrB的序列作為鑒定依據(jù)，但同樣只適用于種水平的鑒定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對目前腸膜明串珠菌腸膜亞種的鑒定繁瑣、耗時等問題，提供一種新的鑒定腸膜明串珠菌腸膜亞種的引物及其方法與應(yīng)用。

本發(fā)明鑒定腸膜明串珠菌腸膜亞種的引物是利用GH70糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因中高度保守的GH70結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)設(shè)計成的，該引物對其高度變異的區(qū)域進行擴增，通過對擴增所得的片段進行測序及隨后的序列比對分析來實現(xiàn)腸膜明串珠菌在腸膜亞種水平上的鑒定。本發(fā)明的鑒定方法比傳統(tǒng)的生化鑒定更簡單有效，同時解決了現(xiàn)用靶標(biāo)(如16S rDNA及gyrB等)不能實現(xiàn)亞種水平鑒定的難題，為腸膜明串珠菌腸膜亞種的鑒定提供了一種高效的分子生物學(xué)方法，促進具有優(yōu)良特性的腸膜明串珠菌菌株的篩選及其在食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種鑒定腸膜明串珠菌腸膜亞種的引物，該引物的上游引物和下游引物如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

進一步的，該引物是根據(jù)GH70糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因設(shè)計得到的。該引物是利用GH70糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因中高度保守的GH70結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)設(shè)計成的，該引物對其高度變異的區(qū)域進行擴增，

本發(fā)明還提供了一種腸膜明串珠菌腸膜亞種的鑒定方法，該方法包括以下步驟：

(1)提取待測菌株樣品的基因組DNA；

(2)以菌株樣品的基因組DNA為模板，采用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的引物，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；

(3)對PCR擴增產(chǎn)物進行雙向測序，獲得整個擴增片段的序列；

(4)對擴增片段的序列進行Blastn分析，通過比對得到相似度最高的序列所對應(yīng)的物種，從而判斷待測菌株為哪種腸膜明串珠菌腸膜亞種。

本發(fā)明通過對PCR擴增所得的片段進行測序及隨后進行Blastn序列比對分析來實現(xiàn)腸膜明串珠菌在腸膜亞種水平上的鑒定。BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或DNA數(shù)據(jù)庫中進行相似性比較的分析工具。BLAST程序能迅速與公開數(shù)據(jù)庫進行相似性序列比較。BLAST結(jié)果中的得分是對一種對相似性的統(tǒng)計說明。

進一步的，步驟(2)中，PCR擴增的反應(yīng)體系為：2ng/μl DNA模板2μl、0.5μmol/L引物1μl、0.2mmol/LdNTP 2μl、1.5mmol/L的MgSO₄1μl、10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl、5U/μl rTaq DNA聚合酶0.5μl，加水至20μl。

進一步的，步驟(2)中，PCR擴增的反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s、48℃退火30s、72℃延伸120s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

進一步的，步驟(2)中，將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，以確定待測菌株是否為腸膜明串珠菌。

進一步的，步驟(2)中，取PCR擴增產(chǎn)物5μL在1％瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20-30min，使用EB染色，電泳結(jié)果在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

進一步的，步驟(3)中，雙向測序所用的引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

進一步的，步驟(3)中，將兩條引物測序結(jié)果進行拼接后，獲得整個擴增片段的序列。

本發(fā)明的上述引物在鑒定腸膜明串珠菌腸膜亞種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明公開的引物能對腸膜明串珠菌實現(xiàn)亞種水平上的鑒定，該引物對GH70糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因中高度變異的區(qū)域進行擴增，通過對擴增所得的片段進行測序及隨后的序列比對分析來實現(xiàn)腸膜明串珠菌在腸膜亞種水平上的鑒定。利用該引物的鑒定方法相比傳統(tǒng)的生化鑒定方法更加高效，可用于對食品行業(yè)中潛在的發(fā)酵劑菌株進行快速、簡便的鑒定，從而為新的菌株在食品中的應(yīng)用提供依據(jù)，加速新的菌種資源在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明用于腸膜明串珠菌腸膜亞種鑒定方法中的基因gtf1的示意圖；

圖2為本發(fā)明鑒定引物對已知的腸膜明串珠菌腸膜亞種的數(shù)字PCR擴增圖；

圖3為本發(fā)明基于鑒定引物數(shù)字?jǐn)U增所得片段構(gòu)建的進化樹；

圖4為本發(fā)明基于基因組序列構(gòu)建的進化樹；

圖5為本發(fā)明待測菌株BD1710亞種鑒定的電泳結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和說明書附圖對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

用于腸膜明串珠菌腸膜亞種水平鑒定的引物設(shè)計及其驗證：

對已有的腸膜明串珠菌基因組序列(各菌株及其基因組序列提取碼見附表1)進行比較分析，鑒定出一個普遍存在的GH70糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因，將其命名為gtf1。gtf1基因上包含兩段編碼GH70結(jié)構(gòu)域的高度保守的堿基序列，在這兩段高度保守的序列之間，有一段高度變異的序列，該段序列在不同菌株中表現(xiàn)出高度多態(tài)性(polymorphism)。

表1腸膜明串珠菌全基因組信息

gtf1基因及其編碼產(chǎn)物的示意圖如附圖1所示，我們通過在高度保守的GH70編碼區(qū)域設(shè)計引物實現(xiàn)對中央高度變異的區(qū)域進行擴增，通過擴增產(chǎn)物的序列測定實現(xiàn)對菌株的鑒定。

根據(jù)表1中所示的各基因組序列信息，對各菌株中GH70編碼區(qū)DNA序列進行比對分析，在此基礎(chǔ)上設(shè)計具有一定簡并度的通用引物。

上游引物：5'-AAAATYAMASAATGGTC-3'(SEQ ID No.1)

下游引物：5'-AAGTAACGYAAHTKRCC-3'(SEQ ID No.2)

使用上述引物，以數(shù)字PCR(in silico PCR)擴增的方法對已經(jīng)基因組測序的腸膜明串珠菌進行數(shù)字?jǐn)U增，結(jié)果如附圖2所示，菌株DSM20484沒有得到特異性條帶，為陰性對照組；菌株KM20是與腸膜明串珠菌相近的菌種檸檬明串珠菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，菌株KM20研究得比較成熟，這里用作對照。對數(shù)字?jǐn)U增所得的片段進行比對分析，構(gòu)建進化樹(如附圖3所示)，所得結(jié)果與基于基因組序列的進化關(guān)系相似，基于基因組序列的進化樹如附圖4所示。上述結(jié)果顯示，四株腸膜明串珠菌腸膜亞種能和相近菌株區(qū)分開來。因此，利用該鑒定引物對腸膜明串珠菌腸膜亞種進行鑒定在理論上是可行的。

實施例2

傳統(tǒng)食品中分離到的腸膜明串珠菌在腸膜亞種水平的鑒定方法，該方法包括以下步驟：

(1)以本實驗室從傳統(tǒng)食品中分離到的腸膜明串珠菌BD1710為待測菌，對待測試菌株進行基因組DNA抽提，所得DNA作為模板進行PCR擴增。

(2)以從上述菌株提取的待測基因組DNA為模板，PCR擴增反應(yīng)體系如下：2ng/μl DNA模板2μl、0.5μmol/L引物1μl、0.2mmol/L dNTP 2μl、1.5mmol/L的MgSO₄1μl、10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl、5U/μl rTaq DNA聚合酶0.5μl，加至20μl。

(3)PCR擴增的反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性10min；95℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸2min，循環(huán)35次；72℃延伸15min，4℃保存。

(4)瓊脂糖凝膠電泳：將得到的PCR擴增產(chǎn)物5μl于1％瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20-30min，EB染色，電泳結(jié)果在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照。所得結(jié)果見附圖5。從圖5可以看出，本發(fā)明所提供的鑒定引物能擴增出特異性條帶，能擴增出腸膜明串珠菌。

(5)對上述擴增產(chǎn)物進行DNA測序，分別以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2作為上下游引物進行雙向測序，所得結(jié)果進行拼接，拼接完成的序列如SEQ ID No.3所示。拼接完成的序列進行BLAST分析，結(jié)果顯示，匹配度最高的兩個分別為Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides ATCC8293(100％覆蓋率，100％相似度)和Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides J18(100％覆蓋率，99％相似度)，因此，證實了BD1710為腸膜明串珠菌腸膜亞種ATCC8293。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容上所作的任何修改、等同替換和簡單改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 光明乳業(yè)股份有限公司

<120> 鑒定腸膜明串珠菌腸膜亞種的引物及其方法與應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaatyamas aatggtc 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagtaacgya ahtkrcc 17

<210> 3

<211> 1920

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcaacaaat caatacttta atgtttcaag tggtagtgaa tttttaccta agcaactgtt 60

aggcgaaaaa acaagtacag ggtttaccaa cgtggacaat ggcaagactg agttttattc 120

tacgagtggc taccaagcaa agaatacatt tattcaagat aatgacaatt ggtattattt 180

tgataatgat ggctatatgg ttgttggcgg tcaagaaatt aatggtaaaa aatattattt 240

cctaccaaat ggtgtagagt tacaagatgc ttatttgtct gatgggacta gtgagtatta 300

ctacagtagt gatggtcgtc aaatttctaa tcaatattat caaggatcag acaacaactg 360

gcgttatttc tttgcagatg gtcatatggc tgtagggtta gcaacaatta ctacagaaaa 420

tggtacaaca aatcaacaat atttcgatgc aaatggtatg caacttaagg gcgtagctat 480

aaaggatact gatggcaatg tgcactattt tgatggtaag acaggaaaca tggttataaa 540

ttcctggggc aaaataagcg atggttcatg gttatactta aatgatagcg gtgtagcggt 600

cacaggaccg caaaatatta acggtcaaaa tctttacttc aacgaagacg gtattcaagt 660

aaagggtgaa gccattactg ataatagtgg aaacatacat tattatgatc gcagcacagg 720

aaatatggtt gtgaactcat ggggtgaaac gaataatggt tcatggctat acttgaacga 780

caagggtgat gccgttacag gagaacaagt tattgacggt caaaaactat atttcagtag 840

taatggaatc caacttaaaa atacattcaa gaagctatcc gatggttcat ggctatattt 900

gaacgataaa ggtcttccag tgacaggagc acaggtcatt gatggacaaa acttgtattt 960

cgaccaagat gggaagcaag tcaaaggtga cgttgctaca gatggacaag gtaacactca 1020

ttattatgac ggcaacacag gaaatatggt tactaattca tgggcagagt tagcggacgg 1080

ttcatggatg tatctagata atgatggcaa tcctttaaca ggaccgcaaa agattgatgg 1140

ccagtcactc tactttaatg atgctggtaa gcaaatcaaa aacgcattgg ttaaactaga 1200

tgatgggtca acaatttacc tcgatgataa aggtgtttca tcaaccggta ttcaaagaat 1260

tgatgataag atatattatt ttgatcctga tggtaaacaa gtagtatgtc gttttgaaga 1320

attaccagat ggttcatgga tgtatctaga tgatgacggt gttgctgcta cgggcgctca 1380

aaaaattaat ggccaggaat tatatttcga caataacggg aaacaagtca aaaatgacaa 1440

agtaattaat gacgatggaa caataaacta ttacacaggt atgagcggtg aaaaactaaa 1500

aaatgatttt ggtgaattac cagacggttc atggatgtac ttggataatc aaggtaatgc 1560

tgtaataggt gcccaaaaaa ttaatggcca gaatctttac ttcaagacag acggacgaca 1620

ggttaagggt gaagcaaatg ttgattcatc gggtgaaatg cacttctatg atcctgattc 1680

tggcgagcta attacaaata gatttgaaca agttgctagt ggtgtatggg cttactttga 1740

tgccaacggt gttgctgtaa ctggtgagca acgcattggt aagcaaaatt tattttttga 1800

tccaactggt tatcaagtta aaggcgacaa acgaacaatt gacggcgttc tctatacctt 1860

tgataaagaa agtggtgaga gaaagggttt agattctata tcggtattac ccaccaatgg 1920