一株產(chǎn)細(xì)菌素的腸膜明串珠菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一株能夠抑制單增李斯特菌生長的產(chǎn)細(xì) 菌素的乳酸菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 食品的保藏問題至今為止仍是食品行業(yè)中一個亟待解決的關(guān)鍵問題，食品中的腐 敗菌、病原菌在保藏過程中需要嚴(yán)格控制，因此防腐劑是食品中不可缺少的。但是近年來， 食品安全惡性事件不斷發(fā)生，大部分是食品添加劑過量使用而帶來的新的食品安全問題， 化學(xué)防腐劑作為一類食品添加劑具有一定的安全隱患，對人體健康不利，因此迫切需要尋 找即可以抑菌，又無毒副作用、無殘留的天然食品防腐劑。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在這方面具 有獨(dú)特的優(yōu)勢。細(xì)菌素是細(xì)菌通過核糖體合成的一類蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)，因其具有抑菌活 性而受到廣泛關(guān)注。與化學(xué)防腐劑相比，細(xì)菌素作為一種蛋白類物質(zhì)，可被蛋白酶水解而不 會殘留于人或動物體內(nèi)，不易產(chǎn)生耐藥性，因此具有較高的安全性，可廣泛應(yīng)用于天然食品 防腐劑、抗菌劑及醫(yī)藥領(lǐng)域。
[0003] 乳酸菌是人和動物體內(nèi)以及一些環(huán)境中存在的一類重要的微生物，其中絕大部分 是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的益生菌，廣泛存在于人體腸道中。乳酸菌作為 益生菌在食品領(lǐng)域中已經(jīng)應(yīng)用多年。乳酸菌能分泌乳酸，使PH值降低，從而能抑制其它細(xì) 菌的生長。而一些乳酸菌還產(chǎn)生其它的抗菌成分，其中最重要的就是細(xì)菌素。乳酸菌產(chǎn)生 的細(xì)菌素能夠抑制單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等食品腐敗菌、病原菌，其中由乳酸乳球 菌產(chǎn)生的細(xì)菌素 Nisin已被FDA批準(zhǔn)用于食品生物保鮮中。但由于Nisin僅對部分革蘭氏 陽性菌有抑制作用，且在中性條件下溶解性差，穩(wěn)定性較低，因而限制了 Nisin在食品防腐 保鮮中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本申請人提供了一株產(chǎn)細(xì)菌素的腸膜明串珠菌及 其應(yīng)用。本發(fā)明從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜中篩選并提供了一株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，可以有 效控制食源性病菌單增李斯特菌的生長并有效控制食品體系中的單增李斯特菌污染，相對 于化學(xué)防腐劑和抗生素而言，具有無殘留、不產(chǎn)生抗藥性和安全等特點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明提供的乳酸菌為腸膜明串珠菌K7 (Leuconostoc mesenteroides K7)，其特 征在于保藏號為：CCTCC NO :M 2015639,保藏日期為2015年10月23日，保藏地點(diǎn)為中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，中國，武漢，武漢大學(xué)。
[0007] 這株乳酸菌為能夠產(chǎn)生細(xì)菌素的乳酸菌，從韓式泡菜中分離得到，為兼性厭氧型， 在MRS固體培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)48h后，菌落扁平，革蘭氏染色呈陽性，經(jīng)16S rDNA鑒定為腸膜 明串珠菌。
[0008] 這株菌于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的發(fā)酵上清液即為細(xì)菌素粗品，對單增李斯特 菌具有良好的抑菌活性。將細(xì)菌素粗品通過陽離子交換層析純化后，得到較純的細(xì)菌素產(chǎn) 品。經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥后，得到粉末狀細(xì)菌素粗品和較純品。
[0009] 由這株菌制備的細(xì)菌素粗品和較純品具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。80°C加 熱30min后保留全部活性，100°C加熱30min后仍能保留一半活性；在pH2~6下保存2h保 留全部活性，在pH 7~10下保存2h仍能保留一半活性。由這株菌制備的細(xì)菌素粗品和較 純品對蛋白酶敏感，能夠被胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解而完全失去活性。該細(xì) 菌素產(chǎn)品隨食品攝入人體后，可以被消化道內(nèi)的酶類降解，并吸收、再利用，不會對人體產(chǎn) 生任何毒副作用。
[0010] 當(dāng)細(xì)菌素粗產(chǎn)品以不低于1.0 AlVlO7Cfu的添加量添加到單增李斯特菌溶液中，可 使單增李斯特菌的〇D_值降低1. 9~2. 3,對其它細(xì)菌則沒有影響；當(dāng)以不低于2AU/10 6Cfu 的添加量添加到染菌食品中，在1天內(nèi)可將單增李斯特菌的數(shù)量降低1~2個數(shù)量級，抑菌 效果明顯。純的細(xì)菌素產(chǎn)品以不低于20 μ g/mL的濃度添加到單增李斯特菌培養(yǎng)物中，能夠 有效抑制其生長。
【附圖說明】
[0011] 圖1為腸膜明串珠菌細(xì)菌素對單增李斯特菌的抑制效果。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 本乳酸菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢、武漢大學(xué)，保藏編號： CCTCC NO :M 2015639,分類學(xué)命名：腸膜明串珠菌 K7 (Leuconostoc mesenteroides K7)。 下列所述實(shí)施例中各原料和操作儀器均為普通市售。
[0013] 實(shí)施例1 :產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選和鑒定
[0014] MRS培養(yǎng)基的配制：將蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸鈉 5g，梓檬酸氫二銨2g，磷酸氫二鉀2g，七水硫酸鎂0. 58g，一水硫酸猛0. 25g，吐溫_801mL，加 蒸餾水至1L，pH 6. 4。
[0015] TSBYE培養(yǎng)基的配制：將Tryptone soya broth (TSB) 30g，酵母提取物6g，加蒸餾 水至 1L，pH 7. 2 ~7. 4。
[0016] 固體培養(yǎng)基的配制：在液體培養(yǎng)基中添加 1. 5%~2. 0%瓊脂。
[0017] (1)乳酸菌的分離與純化
[0018] 本發(fā)明所用泡菜材料均為內(nèi)蒙古通遼市科爾沁左翼中旗?？垫?zhèn)農(nóng)村家庭自制，其 制作方法為：將蔬菜（白菜、豆角、白蘿卜）洗干凈，與食鹽、辣椒、香料混勻，放入泡菜缸中 密封，置于陰涼干燥處，20°C左右發(fā)酵約一周，即得到泡菜。在無菌條件下，吸取IOOyL泡 菜汁，進(jìn)行梯度稀釋，得到10 5、10 6、10 7的梯度稀釋液。取不同梯度的稀釋液100 μ L，分別 加入到MRS固體平板上，并將菌懸液均勻涂布于平板表面，置于30°C培養(yǎng)48h。根據(jù)菌落形 態(tài)的差異，用槍頭挑取各種典型菌落，在另一 MRS固體平板上進(jìn)行劃線，置于30°C培養(yǎng)48h。 挑取單菌落重新劃線兩次，直至菌落完全純化。
[0019] (2)產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選
[0020] 將步驟（1)得到的純菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于30°C靜置培養(yǎng)24h， 得到發(fā)酵液，經(jīng)20°C、1000 Orpm離心10min，得到發(fā)酵上清液。用5M NaOH將發(fā)酵上清液pH 值調(diào)至5. 5~6. 0,置于80°C水浴加熱lOmin，得到乳酸菌待測樣品。
[0021] 將過夜培養(yǎng)的單增李斯特菌稀釋到106cfu/mL，取100 μ L涂布于TSBYE固體平板， 在表面放入幾個牛津杯，在每個牛津杯中各加入100 μ L乳酸菌待測樣品或MRS液體培養(yǎng) 基，37°C下靜置培養(yǎng)12h，通過牛津杯擴(kuò)散法篩選出能夠產(chǎn)生抑菌圈的乳酸菌待測樣品，并 保存對應(yīng)的乳酸菌菌株。對于篩選出的乳酸菌待測樣品，用終濃為2mg/mL的胰蛋白酶于 37°C處理2h，再通過牛津杯擴(kuò)散法檢測處理后樣品是否產(chǎn)生抑菌圈，若抑菌圈消失，則說明 該菌株為產(chǎn)細(xì)菌素的菌株。
[0022] (3)產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定
[0023] 將篩選出的一株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株K7培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取其基因 組DNA。利用細(xì)菌16S rDNA通用引物（正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTC AG ;反向引物 ACGGCTACCTTGTTACGACTT)擴(kuò)增出它的16S rDNA片段，連接到pMD19-T載體，測序，序列全長 為1473bp (見序列表）。通過序列比對，證明為腸膜明串珠菌，命名為腸膜明串珠菌K7。
[0024] 實(shí)施例2 :腸膜明串珠菌K7細(xì)菌素的生化特性
[0025] 細(xì)菌素活力的測定方法為連續(xù)二倍稀釋法，指示菌為單增李斯特菌。一個活力單 位（AU)定義為能使指示菌產(chǎn)生清晰透明圈的最少細(xì)菌素量。溶液的細(xì)菌素活力（AU/mL) =2 nX (1000/x)。η表示使指示菌產(chǎn)生抑菌圈的細(xì)菌素溶液的最大連續(xù)二倍稀釋的次數(shù)；X 表示每孔中