一種腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制 備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水不溶性葡聚糖（Insoluble glucan，IG)是一類(lèi)不溶于水、以葡萄糖為單一組分 聚合而成的一種糖類(lèi)多聚物，這類(lèi)理化性質(zhì)特殊的碳水化合物不但來(lái)源廣泛，在植物、真菌 以及細(xì)菌的代謝產(chǎn)物中均有報(bào)道，而且種類(lèi)繁多。目前報(bào)道較多的IG有dextran、curdlan和 cellulose三種，從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)看，已報(bào)道的這些IG的分支僅由α-(1，2)、α-(1，3)或α-(1，4) 糖苷鍵中的一種將支鏈與主鏈連接起來(lái)，極少涉及2種或以上糖苷鍵的分支結(jié)構(gòu)。因此，新 構(gòu)型IG的篩選與發(fā)現(xiàn)不僅為IG家族增添了新的成員，而且極大地推動(dòng)了IG結(jié)構(gòu)有關(guān)研究的 前沿領(lǐng)域。
[0003] 此外，目前IG的獲得都來(lái)自合成培養(yǎng)基，此類(lèi)培養(yǎng)基成分多樣，配方復(fù)雜，配制過(guò) 程繁瑣具有潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，再者，制備的成本相對(duì)較高、IG的來(lái)源相對(duì)有限，上述問(wèn)題 很大程度上限制了 IG的開(kāi)發(fā)和利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了解決目前水不溶性葡聚糖的制備使用的是成分多樣，配方復(fù)雜的合成 培養(yǎng)基存在的成本較高，培養(yǎng)基配制繁瑣，存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，提供了一種腸膜明串 珠菌的水不溶性胞外多糖的制備方法。該制備方法所用番茄汁蔗糖培養(yǎng)基安全純天然，配 制簡(jiǎn)單，原料來(lái)源廣泛，成本低。
[0005] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)保藏號(hào)為CGMCC No. 100064的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenter〇id es)BD3749在番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)冷凍干燥，堿液浸 提，離心得到的上清液，再經(jīng)酸液調(diào)節(jié)pH至7,離心取沉淀，冷凍干燥可獲得具有特殊結(jié)構(gòu)的 水不溶性胞外多糖，從而完成了本發(fā)明。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種腸膜明串珠菌的水不溶性 胞外多糖的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0007] 1)將腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD3749接種于番前汁鹿糖培養(yǎng) 基中，發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；
[0008] 2)將步驟1)所得發(fā)酵液冷凍干燥后，取粉末用堿液浸提，取上清，調(diào)節(jié)上清pH值至 7,取沉淀，冷凍干燥即得。
[0009] 本發(fā)明制備方法步驟1)為：將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides) BD3749接種于番茄汁蔗糖培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液。
[0010] 本發(fā)明步驟1)腸膜明串珠菌BD3749已于2014年11月26日保藏在中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵 編：100101。該菌株的建議的分類(lèi)命名為:腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，該菌 株的保藏編號(hào)為:CGMCC如.10064，所保藏的培養(yǎng)物名稱(chēng)為403749。
[0011] 其中，本發(fā)明所述腸膜明串珠菌BD3749的制備方法為常規(guī)的，較佳地還包括該腸 膜明串珠菌BD3749活化獲得腸膜明串珠菌種子的步驟。所述腸膜明串珠菌種子為常規(guī)方法 獲得，較佳地為包括以下步驟的方法:將腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(所 述腸膜明串珠菌的保藏編號(hào)為CGMCC No. 10064)的凍干粉用少量無(wú)菌蒸餾水溶解，用接種 環(huán)取一環(huán)劃線于含5%蔗糖的M17固體培養(yǎng)基(購(gòu)買(mǎi)自0X0ID Co.，英國(guó)），30°C好氧培養(yǎng)48h 取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入10mL含5%蔗糖的M17液體培養(yǎng)基（購(gòu)買(mǎi)自0X0ID Co.，英 國(guó)），運(yùn)用渦旋振蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，30°C，180rpm振蕩培養(yǎng)24h取出，以 2%(v/v)接種量接種于含5%蔗糖的M17液體培養(yǎng)基（購(gòu)買(mǎi)自0X0ID Co.，英國(guó)），30°C， 180rpm振蕩培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)物15，OOOrpm離心10分鐘，棄去上清，菌體用無(wú)菌蒸餾水洗滌 2次后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子。所述腸膜明串珠菌BD3749的 凍干粉由以下方法制備:挑取2個(gè)菌落，接種于300mL的10%(w/w)的脫脂乳溶液里30°C培養(yǎng) 4h，-80°C預(yù)凍過(guò)夜，_20°C冷凍干燥。
[0012] 本發(fā)明步驟1)所述的番茄汁蔗糖培養(yǎng)基配制方法為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地由包括以 下步驟的方法制備:番茄榨汁，將所得榨汁過(guò)濾后煮沸，離心取上清液，加入蔗糖加熱溶解 后冷卻，調(diào)節(jié)pH值，滅菌后冷卻即得。其中，所述過(guò)濾的方法為常規(guī)的，較佳地為利用80~ 120目紗布過(guò)濾取汁;所述煮沸的時(shí)間為常規(guī)的，較佳地為1~10分鐘(min)，更佳地為3~8 分鐘，最佳地為5分鐘;所述離心為常規(guī)的，離心的速度較佳地為4，000~12，000g，更佳地為 6，000~10，000g，最佳地為8，000g，離心的時(shí)間較佳地為8~12分鐘，更佳地為9~11分鐘， 最佳地為10分鐘;所述蔗糖的加入量較佳地為5~30%，更佳地為10~20%，最佳地為10% ; 所述滅菌為常規(guī)的，滅菌的溫度較佳地為110~135°C，更佳地為115~125°C，最佳地為121 °C，滅菌的時(shí)間較佳地為10~30分鐘，更佳地為15~25分鐘，最佳地為20分鐘;所述pH值的 調(diào)節(jié)方法為本領(lǐng)域常規(guī)的調(diào)節(jié)方法，較佳地為加入食品級(jí)堿調(diào)節(jié)pH值，所述食品級(jí)堿為本 領(lǐng)域常規(guī)，較佳地是:Na 2C03、NaHC03和NaOH中的一種或多種;所述pH值為常規(guī)的，較佳地為5 ~8，更佳地為6~7，最佳地為7。
[0013] 本發(fā)明步驟1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)為常規(guī)的，所述發(fā)酵菌種的接種量較佳地為1%~ 5%，更佳地為2%~4%，最佳地為3%，所述百分比為體積百分比。所述的發(fā)酵培養(yǎng)較佳地 為振蕩發(fā)酵培養(yǎng)，所述振蕩的速度較佳地為100~300rpm，更佳地為150~250rpm，最佳地為 200rpm;發(fā)酵培養(yǎng)的溫度較佳地為15°C~37°C，更佳地為25~33°C，最佳地為30°C;發(fā)酵培 養(yǎng)的時(shí)間較佳地為24~96小時(shí)(h)，更佳地為48~84小時(shí)，最佳地為72小時(shí)。
[0014] 本發(fā)明制備方法步驟2)為:將步驟1)所得發(fā)酵液冷凍干燥后，取粉末用堿液浸提， 取上清，調(diào)節(jié)上清pH值至7，取沉淀，冷凍干燥即得。
[0015] 本發(fā)明步驟2)所述冷凍干燥為本領(lǐng)域常規(guī)的凍干技術(shù)，只要達(dá)到去除水分，獲得 固形物的目的即可。所述堿液為常規(guī)的，較佳地為NaOH溶液，所述NaOH溶液的濃度為1~5M， 較佳地為2~4M，更佳地為3M。所述浸提為常規(guī)的，所述浸提時(shí)凍干粉末與堿液的比例為lg: lmL~1 g: 5mL，較佳地為1 g: 2mL~1 g: 4mL，更佳地為1 g: 3mL。所述上清為常規(guī)方法取得，較佳 地為離心，所述離心為常規(guī)的，離心的速度較佳地為8,000~15,000g，更佳地為10,000~ 12，000g，離心的時(shí)間較佳地為5~15分鐘，更佳地為8~12分鐘。所述pH使用的常規(guī)方法調(diào) 節(jié)，較佳地為用酸液調(diào)節(jié)，所述酸液為常規(guī)的，較佳地為HC1溶液，所述HC1溶液濃度為1~ 3M，較佳地為1.5~2.5M，更佳地為2M。所述沉淀的取得為常規(guī)方法，較佳地為離心，離心條 件優(yōu)選方案同離心取得所述上清的優(yōu)選方案。
[0016] 由上述制備方法得到的腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖為一種同時(shí)擁有α-(1， 3)和α-(1，4)糖苷鍵的水不溶性葡聚糖，呈白色粉末狀。
[0017] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0018] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0019] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0020] 1、本發(fā)明解決了當(dāng)前水不溶性多糖(尤其是水不溶性葡聚糖)來(lái)源狹隘的現(xiàn)狀，為 水不溶性多糖的來(lái)源提供了另一種的選擇；
[0021] 2、采用本發(fā)明制備的水不溶性多糖具有罕見(jiàn)的兩種支鏈連接鍵并存的形態(tài)，是一 種結(jié)構(gòu)新穎的多糖，根據(jù)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的多糖功能也相對(duì)較多的理論，因此，具有一定的開(kāi)發(fā) 意義。
[0022] 3、常規(guī)多糖的制備步驟中往往涉及了去蛋白的步驟(如SAVAGE法去蛋白），但本發(fā) 明制備方法中發(fā)酵液不調(diào)節(jié)pH直接冷凍干燥，酸性發(fā)酵液被逐步凍干失水時(shí)，pH不斷下降， 造成局部過(guò)酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中的游離蛋白迅速變性，這部分蛋白在堿液浸提時(shí)被離心除去， 從而達(dá)到了去蛋白的目的。
[0023] 4、腸膜明串珠菌屬于乳酸菌范疇，所以與其他來(lái)源菌株產(chǎn)生的不溶性多糖相比， 腸膜明串珠菌的多糖具有更高的食品安全性。本發(fā)明制備所得的胞外多糖可以作為功能性 添加劑替代其他來(lái)源的水不溶性多糖應(yīng)用于食品、制藥和相關(guān)領(lǐng)域中，其應(yīng)用前景十分廣 闊。
[0024] 5、目前IG的制備都依賴(lài)于合成培養(yǎng)基，而運(yùn)用番茄汁蔗糖培養(yǎng)基制備IG的研究尚 未報(bào)道過(guò)，本發(fā)明首次將番茄汁蔗糖培養(yǎng)基作為一種天然的發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)用于IG的制備， 因而其產(chǎn)物具有更高的食品安全性。
[0025] 6、本發(fā)明所述用于制備IG的主要原料為番茄，其來(lái)源廣、成本低，發(fā)酵菌種為腸膜 明串珠菌單一菌種，上述組合有利于產(chǎn)品品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化與工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的成本控制