本發(fā)明屬于養(yǎng)犬業(yè)的病原檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ā?/p>

背景技術(shù)：

犬瘟病毒（Canine distemper virus, CDV）、犬細小病毒（Canine parvovirus, CPV）、狂犬病毒（Rabies virus, RV）是犬病毒性傳染病暴發(fā)和流行的幾個重要病原體，這三種病毒單一或混合感染后臨床致死率可達50%~100%，給養(yǎng)犬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。CDV感染引起的犬瘟主要有呼吸型、消化型、神經(jīng)型和混合型4種，可引起感染動物全身性的免疫抑制，病死率極高。單一CPV感染機體引起的癥狀較輕，與其他病毒、細菌協(xié)同混合感染，引起的臨床癥狀非常明顯，主要引起犬急性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎。RV是人獸共患傳染病—狂犬病的病原體，其感染危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病死率幾乎為100%，至今尚無有效的治療藥物，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病。

目前對CDV、CPV、RV 的臨床診斷方法主要采取血清學(xué)方法，如ELISA、膠體金快速檢測試紙條等，但是非特異性交叉反應(yīng)而影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且該方法的敏感性不夠高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，最近國內(nèi)外建立了PCR/多重PCR、熒光定量PCR等檢測方法。雖然PCR技術(shù)具有特異性強、敏感度高的優(yōu)點，但結(jié)果判定需要電泳，費時費力，且反應(yīng)產(chǎn)物容易產(chǎn)生污染而導(dǎo)致假陽性。熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR的多種優(yōu)點，具有更高的敏感性和特異性并且大大縮短了檢測時間。建立兩重或三重?zé)晒舛縋CR方法比較復(fù)雜，除了對試劑、引物有特殊要求外，同時也要求儀器有多個檢測通道，大大增加了實驗難度，并且仍不能滿足樣品較多但樣本量較少的檢測需求。目前，尚未見有應(yīng)用多重免疫熒光分析方法對犬瘟病毒、犬細小病毒、狂犬病毒進行檢測的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲆铩?/p>

本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖小?/p>

本發(fā)明的再一目的在于提供一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ā?/p>

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲆?，所述引物核苷酸序列如下所示?/p>

引物CDV1：AACAGATGGGTGAAACAGCA（SEQ ID NO：1），

引物CDV2：GCATAACTCCAGAGCAATGGGTAG（SEQ ID NO：2）；

引物CPV1：CAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTC（SEQ ID NO：3），

引物CPV2：TTGTGTAGACGCCTCAAAAGAATAA（SEQ ID NO：4）；

引物RV1：CAGGACTGGTATCATTTACTGGGTT （SEQ ID NO：5），

引物RV2：GAAGTGGATGAAATAAGAGTGAGG （SEQ ID NO：6）。

進一步的，所述引物CDV1和CDV2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物CPV1和CPV2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物RV1和RV2其中一條引物的5’端被生物素化。

進一步的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補配對。

進一步的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2這3組引物對中連接的tag序列選自SEQ ID NO:7~9所示的tag序列，且該3組引物對中連接的tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?，該試劑盒中含有上述任一所述引物?/p>

進一步的，該試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、3種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

進一步的，所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補配對的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ǎㄈ缦虏襟E：

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用上述任一所述的引物進行PCR擴增；

3）將上步擴增產(chǎn)物、3種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對雜交產(chǎn)物進行檢測分析，確定其病原的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

進一步的，步驟2）中PCR擴增的反應(yīng)體系為：

5×One-step RT-PCR buffer 5μL

dNTP 1μL

引物混合液 4μL

酶 1μL

模板 2μL

ddH₂O 12μL

Total 25μL；

進一步的，步驟2）中PCR擴增的反應(yīng)程序為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性15min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

進一步的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序為：

3種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；45℃孵育30min。

本發(fā)明的有益效果是：

1）本發(fā)明實現(xiàn)了同時對犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒進行檢測，本發(fā)明通過RT-PCR獲得目標(biāo)擴增片段，再將擴增產(chǎn)物、熒光編碼微球和鏈霉親和素-藻紅蛋白（SAPE）進行雜交，然后通過檢測儀讀取MFI值時，分辯不同類型的病原。

2）本發(fā)明方法能夠同時對犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒進行準(zhǔn)確檢測，而且特異性強，靈敏度高，重復(fù)性好。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本發(fā)明方法實現(xiàn)了對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行檢測，樣本用量少，操作簡單、快速，可大大降低檢測成本。本發(fā)明能保證相同的復(fù)性溫度和雜交效率，且有效避免不同檢測物標(biāo)記的微球之間交叉雜交。

附圖說明

圖1是犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒3種病原PCR的電泳圖；1：DM2000 DNA marker；2：CDV；3：CPV；4：RV；5：NTC（PCR空白對照）；6：對CDV+CPV+RV進行的三重PCR；

圖2是犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒3種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測實驗結(jié)果圖；

圖3是犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒3種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測特異性實驗結(jié)果圖；圖中的“Rabies”即為RV；

圖4是犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒3種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測靈敏度實驗結(jié)果圖；

圖5是犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒3種病原的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ㄅR床檢測實驗結(jié)果圖，NTC表示陰性對照，PC表示陽性對照。

具體實施方式

一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲆?，所述引物核苷酸序列如下所示?/p>

引物CDV1：AACAGATGGGTGAAACAGCA（SEQ ID NO：1），

引物CDV2：GCATAACTCCAGAGCAATGGGTAG（SEQ ID NO：2）；

引物CPV1：CAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTC（SEQ ID NO：3），

引物CPV2：TTGTGTAGACGCCTCAAAAGAATAA（SEQ ID NO：4）；

引物RV1：CAGGACTGGTATCATTTACTGGGTT （SEQ ID NO：5），

引物RV2：GAAGTGGATGAAATAAGAGTGAGG （SEQ ID NO：6）。

優(yōu)選的，所述引物CDV1和CDV2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物CPV1和CPV2其中一條引物的5’端被生物素化；

所述引物RV1和RV2其中一條引物的5’端被生物素化。

優(yōu)選的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2中未被生物素化的引物的5’端連接有tag序列，所述tag序列能與熒光編碼微球中帶有的anti-tag序列互補配對。

優(yōu)選的，所述引物CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2這3組引物對中連接的tag序列選自SEQ ID NO:7~9所示的tag序列，且該3組引物對中連接的tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?，該試劑盒中含有上述任一所述引物?/p>

優(yōu)選的，該試劑盒中還含有鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物、3種編碼不同熒光色的熒光編碼微球。

優(yōu)選的，所述熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補配對的anti-tag序列，編碼不同熒光色的熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?，包括如下步驟：

1）從樣品中提取病毒核酸；

2）以提取的病毒核酸為模板，用上述任一所述的引物進行PCR擴增；

3）將上步擴增產(chǎn)物、3種編碼不同熒光色的熒光編碼微球、鏈霉親和素-藻紅蛋白進行雜交；

4）雜交結(jié)束后，通過Luminex系統(tǒng)對雜交產(chǎn)物進行檢測分析，確定其病原的類型；

上述方法用于非疾病的診斷和治療。

優(yōu)選的，步驟2）中PCR擴增的反應(yīng)體系為：

5×One-step RT-PCR buffer 5μL

dNTP 1μL

引物混合液 4μL

酶 1μL

模板 2μL

ddH₂O 12μL

Total 25μL；

優(yōu)選的，步驟2）中PCR擴增的反應(yīng)程序為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性15min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s；循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

優(yōu)選的，步驟3）中所述雜交的反應(yīng)體系和程序為：

3種熒光編碼微球 20μL

鏈霉親和素-藻紅蛋白 75μL

擴增產(chǎn)物 5μL

總體積 100μL；45℃孵育30min。

優(yōu)選的，步驟3）中3種編碼不同熒光色的熒光編碼微球中還含有與引物中tag序列互補配對的anti-tag序列，3種熒光編碼微球中含有的anti-tag序列互不相同。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1 引物

經(jīng)過對所設(shè)計的大量引物進行篩選后，發(fā)現(xiàn)引物對CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2對多重?zé)晒饷庖邫z測犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的效果最好，其堿基序列如下所示。

引物CDV1：AACAGATGGGTGAAACAGCA（SEQ ID NO：1），

引物CDV2：GCATAACTCCAGAGCAATGGGTAG（SEQ ID NO：2）；

引物CPV1：CAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTC（SEQ ID NO：3），

引物CPV2：TTGTGTAGACGCCTCAAAAGAATAA（SEQ ID NO：4）；

引物RV1：CAGGACTGGTATCATTTACTGGGTT （SEQ ID NO：5），

引物RV2：GAAGTGGATGAAATAAGAGTGAGG （SEQ ID NO：6）。

本發(fā)明采用多重?zé)晒饷庖叻治龅姆椒▽Ψ秩敛《?、犬細小病毒和狂犬病毒進行區(qū)分，故將上述引物作進一步的修飾，以滿足相應(yīng)的操作要求。其中引物CDV1、CPV1和RV的5’端連接有tag序列，所連接的tag序列分別為：

引物CDV1的tag序列為：ATCTCAATTACAATAACACACAAA（SEQ ID NO：7）；

引物CPV1的tag序列為：CAAACAAACATTCAAATATCAATC（SEQ ID NO：8）；

引物RV1的tag序列為：TACTACTTCTATAACTCACTTAAA （SEQ ID NO：9）。

另外，引物CDV2、CPV2和RV2的5’端還添加有生物素標(biāo)記。

實施例 2：快速區(qū)分CDV、CPV和RV的多重?zé)晒饷庖叻治鲈噭┖?/p>

試劑盒包括以下組分：

（1）實施例1所設(shè)計的用于多重?zé)晒饷庖叻治龅囊铮?/p>

（2）3種編碼不同熒光色的包含有anti-tag序列的熒光編碼微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與多重?zé)晒饷庖叻治鲆镏械膖ag序列互補配對；3種微球均購自luminex公司，其中CDV、CPV和RV分別對應(yīng)的熒光編碼微球號為MTAG-A067、MTAG-022和MTAG-034。

（3）鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物。

（2）3種編碼不同熒光色的包含有anti-tag序列的熒光編碼微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與多重?zé)晒饷庖叻治鲆锝M上游引物上的tag序列互補配對；三種微球均購自luminex公司，具體的CDV、CPV和RV分別對應(yīng)的熒光編碼微球號為MTAG-A067、MTAG-022和MTAG-034。

（3）鏈霉親和素-藻紅蛋白復(fù)合物。

實施例3 CDV、CPV和RV的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒z測方法的建立

（1）CDV、CPV和RV質(zhì)粒的構(gòu)建

用天根的核酸自動抽取儀分別提取CDV、CPV和RV的核酸，分別用引物對CDV1和CDV2、CPV1和CPV2、RV1和RV2進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠純化，將純化后的cDNA分別連接至pMD-19T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細胞，挑選單克隆，進行菌落PCR鑒定，將鑒定為陽性菌的菌落進行質(zhì)粒抽提，送測序。

（2）質(zhì)粒PCR擴增

用實施例1所述的引物分別對CDV、CPV和RV進行單重、三重PCR擴增。

上游引物混合液的制備：將CDV1、CPV1和RV1以摩爾比1:1:1:1比例進行混合；下游引物混合液的制備：將CDV2、CPV2和RV2以摩爾比1:1:1:1比例進行混合。利用CDV、CPV和R三種病原的特異性模板，以及CDV、CPV和RV三重混合模板，對上述三種病原的特異性區(qū)域進行擴增。其中三重模板的制備：將三種質(zhì)粒以以體積比1:1:1:1的比例進行混合。

PCR擴增反應(yīng)體系如下：

5×One-step RT-PCR buffer 5μl

Enzyme 1μl

dNTP 1μl

上游引物混合液 2μl （各引物終濃度為0.2μM）

下游引物混合液 2μl（各引物終濃度為0.2μM）

模板 2 μl (< 500ng)

ddH₂O 12μl

Total 25μl。

擴增的反應(yīng)程序為：50℃逆轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性15min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，循環(huán)35次；72℃終延伸10min。

電泳檢測結(jié)果：將上述PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，其電泳圖如圖1所示。1：DM2000 DNA marker；2：CDV；3：CPV；4：RV；5：NTC（PCR空白對照）；6：對CDV+CPV+RV進行的三重PCR。從圖1中可以看出，CDV的擴增產(chǎn)物大小約為151bp，CPV的擴增產(chǎn)物大小約為163bp，RV的擴增產(chǎn)物大小約為155bp，由于這三種病原的擴增產(chǎn)物大小相近，所以三重PCR 擴增產(chǎn)物的電泳條帶無法分辨。

（3）將所得的PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球工作液、鏈霉親和素藻紅蛋白（SAPE）工作液雜交，包括以下步驟：

分別包被有特異的anti-tag序列的3種微球，其中anti-tag序列能相應(yīng)地與CDV、CPV和RV三種病原引物上的tag序列互補配對。三種微球均購自luminex公司，具體的CDV、CPV和RV分別對應(yīng)的熒光編碼微球號為MTAG-A067、MTAG-022和MTAG-034。

熒光編碼微球工作液的制備：將2500個/μl熒光編碼微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到1μl約含有125個/種熒光編碼微球。

SAPE工作液制備：將1mg/ml SAPE用1×Tm Hybrdization Buffer稀釋到10μg/μl。

充分重懸熒光編碼微球工作液，每個樣品孔和背景孔加入微球工作液20μl，樣品孔中加入5μl PCR產(chǎn)物，背景孔中加入5μl NTC產(chǎn)物，再加入75μl的SAPE工作液，充分混勻，于金屬加熱器中45℃孵育30min。

依照檢測儀Luminex 200儀器的說明將雜交后的100μl上述反應(yīng)液進行檢測，結(jié)果如圖2所示，雖然三重模板的擴增產(chǎn)物無法用電泳分辨，但用檢測儀Luminex 200儀器讀取MFI值時，可以明顯分辯不同類型的病原。

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)（注：該判斷標(biāo)準(zhǔn)僅供參考，亦可對結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進行調(diào)整）如下：

最低檢測閾值（cutoff值）的確定：選取10份健康犬組織樣品（每個樣品平行重復(fù)3次），分別讀取MFI值并計算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的MIF值設(shè)定其為cutoff值。本發(fā)明所獲得cutoff值為182.5，因此將本發(fā)明的cutoff值定為200。只有檢測樣品的MFI值高于200時，該實驗數(shù)據(jù)才能進行有效分析。

待測樣本的分析判斷：1）當(dāng)待測樣本的MFI值＞200時，判斷為陽性樣本；2）待測樣本的MFI值≤200時，判斷為陰性，需要進行重復(fù)實驗或采取其他檢測方法進一步驗證。

實施例4 CDV、CPV和RV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測特異性實驗

分別用犬瘟病毒（CDV）、犬細小病毒（CPV）、狂犬病毒（RV）、犬腺病毒（CAV）、犬副流感病毒（CPiV）、犬冠狀病毒（CCV）作為模板進行多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測。實驗結(jié)果如圖3所示，只有犬瘟病毒、犬細小病毒、狂犬病毒為陽性，其他均為陰性，說明本檢測體系特異性良好。

實施例5：CDV、CPV和RV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測靈敏性實驗

將制備的質(zhì)粒進行定量，采用10倍稀釋法進行梯度稀釋，稀釋至10¹copies/μl，用上述建立的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒ㄟM行檢測。CDV、CPV和RV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測靈敏性實驗結(jié)果如圖4所示，實驗結(jié)果表明，CDV、CDV和RV的最低檢出量分別為為10²copies/μl、10²copies/μl和10³copies/μl。

實施例6：樣品的檢測

將所收集的犬的拭子、糞便、尿液、唾液等臨床樣品，用核酸自動抽取儀抽提核酸作為反應(yīng)模板，并使用Qiagen的One-Step RT PCR kit進行擴增。采用上述CDV、CPV和RV的多重?zé)晒饷庖叻治鰴z測方法進行檢測，擴增產(chǎn)物與熒光編碼微球和SAPE雜交，在Luminex 200檢測儀上讀取數(shù)據(jù)。具體步驟參照實施例3，實驗結(jié)果如圖5所示。

經(jīng)普通PCR檢測實驗結(jié)果表明，樣品1、3、5、7、8、10均為陰性；2、4、9為CDV陽性樣品；4、6、9為CPV陽性樣品。其中，樣品4、9為CDV、CPV混合感染樣品。通過測序分析，結(jié)果一致。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110> 廣東省實驗動物監(jiān)測所

<120> 一種快速區(qū)分犬瘟病毒、犬細小病毒和狂犬病毒的多重?zé)晒饷庖叻治龇椒?/p>

試劑盒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacagatggg tgaaacagca 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcataactcc agagcaatgg gtag 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caagataaaa gacgtggtgt aactc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgtgtagac gcctcaaaag aataa 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caggactggt atcatttact gggtt 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagtggatg aaataagagt gagg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atctcaatta caataacaca caaa 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaacaaaca ttcaaatatc aatc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tactacttct ataactcact taaa 24