本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)牛HH5單倍型的專用試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

在奶牛育種中，由于后裔測(cè)定、基因組選擇等現(xiàn)代育種技術(shù)的應(yīng)用，在極大地提高了選擇準(zhǔn)確性的同時(shí)，也潛在地提高了選擇強(qiáng)度。由于人工授精(AI)等繁殖生物技術(shù)的應(yīng)用，使個(gè)別優(yōu)秀種公牛得到廣泛使用，增加了群體的近交系數(shù)，降低了有效群體含量，隱性基因純合的概率加大，使不良基因在奶牛群體中不斷出現(xiàn)，隨著基因組學(xué)研究的不斷深入和高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，加快了奶牛隱性遺傳缺陷的挖據(jù)、鑒定與應(yīng)用。

單倍型，在遺傳學(xué)上是指在同一染色體上進(jìn)行共同遺傳的多個(gè)基因座上等位基因的組合。有害單倍型是新近幾年在牛群中出現(xiàn)的隱性遺傳缺陷的新形式，在荷斯坦牛群中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種單倍型，成功進(jìn)行區(qū)間定位的單倍型有15種。當(dāng)這些單倍型隱性純合時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出不同類型的臨床癥狀、胚胎早期死亡等，是影響奶牛群繁殖健康的隱性殺手，嚴(yán)重影響著奶牛養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益。

單倍型5(HH5，olstein Haplotype 5)是在荷斯坦牛群中新發(fā)現(xiàn)的一種隱性有害單倍型，當(dāng)HH5單倍型隱性純合時(shí)，導(dǎo)致奶牛胚胎早期致死，嚴(yán)重影響了奶牛繁殖率，給奶牛養(yǎng)殖者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

HH5的分子遺傳基礎(chǔ)是在牛9號(hào)染色體上有138kb(BTA9:93,233kb-93,371kb)的缺失，線粒體轉(zhuǎn)錄因子B1基因(transcription factor B1mitochondrial，TFB1M)剛好在這個(gè)缺失區(qū)段里，TFB1M基因?qū)€粒體蛋白翻譯啟動(dòng)至關(guān)重要，其主要功能是使線粒體12s rRNA 3'末端的發(fā)夾環(huán)內(nèi)的腺嘌呤殘基甲基化，而12s rRNA是線粒體小核糖體亞基合成和發(fā)揮功能所必需的，所以TFB1M是引起HH5致死單倍型的致因基因，已通過小鼠模型得到驗(yàn)證。德國(guó)荷斯坦牛群中HH5攜帶者比例為5.5％，在牛群中具有較高的比例。

牛冷凍精液和人工授精技術(shù)的普及和廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致優(yōu)秀種公牛的影響和使用范圍是世界性的。一頭優(yōu)秀種公牛一生可以生產(chǎn)幾十萬劑甚至上百萬劑冷凍精液，其遺傳影響可想而知。由于優(yōu)秀種公牛冷凍精液在全世界范圍內(nèi)的流通和廣泛使用，荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)的有害單倍型帶來的都是世界性的問題。這導(dǎo)致近年來奶牛育種工作者在重視優(yōu)秀種公牛生產(chǎn)性能表現(xiàn)的同時(shí)，更加重視優(yōu)秀種公牛是否攜帶一些不良隱性基因的影響。因此，建立一種有效的檢測(cè)HH5單倍型的分子生物學(xué)方法，制定合理選種選配方案，是降低HH5純合子的最好方法。目前，我國(guó)尚未開展相關(guān)的研究和檢測(cè)工作，HH5單倍型在我國(guó)荷斯坦牛群中的攜帶情況尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是一種檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的成套引物。

本發(fā)明提供的成套引物由引物1、引物2和引物3組成；

所述引物1為序列1所示的單鏈DNA分子；

所述引物2為序列2所示的單鏈DNA分子；

所述引物3為序列3所示的單鏈DNA分子。

上述成套引物中，所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩爾量比為1:1:1。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的PCR試劑。

本發(fā)明提供的PCR試劑包括上述成套引物。

上述PCR試劑中，所述引物1、所述引物2、所述引物3在所述PCR試劑中的終濃度均為20pmol/L。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的試劑盒。

本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的試劑盒包括上述成套引物或上述PCR試劑。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒的新用途。

本發(fā)明提供了上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒在如下1)或2)中任一種中的應(yīng)用：

1)檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型；

2)制備檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的產(chǎn)品。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的方法。

本發(fā)明提供的檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的方法包括如下步驟：

以待測(cè)奶牛的基因組DNA為模板，采用上述成套引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判斷待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型：

若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為442bp的條帶，則待測(cè)奶牛不攜帶HH5單倍型；

若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為442bp和256bp的條帶或僅含有大小為256bp的條帶，則待測(cè)奶牛攜帶HH5單倍型。

上述方法中，若奶牛的基因型為HH5純合單倍型時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為256bp的條帶，但基因型為HH5純合單倍型的奶牛在胚胎期的時(shí)候就會(huì)流產(chǎn)，所以在實(shí)際檢測(cè)中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一般為如下兩種情況：(1)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為442bp的條帶；(2)含有大小為442bp和256bp的條帶。

上述方法中，所述PCR的退火溫度為58℃。

上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒或上述應(yīng)用或上述方法中，

所述HH5單倍型為HH5純合單倍型或HH5雜合單倍型；

所述HH5純合單倍型是指牛個(gè)體9號(hào)染色體上的兩條同源染色體的第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子均發(fā)生缺失的基因型；

所述HH5雜合單倍型是指牛個(gè)體9號(hào)染色體上的一條同源染色體的第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子發(fā)生缺失，且另一條同源染色體的第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子未發(fā)生缺失的基因型。

上述成套引物或上述PCR試劑或上述試劑盒或上述應(yīng)用或上述方法中，

所述奶牛為荷斯坦牛。

本發(fā)明建立了一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的方法，為奶牛HH5單倍型的分子篩查提供一種方法和思路，為在今后的育種工作中有計(jì)劃地降低HH5單倍型頻率提供了技術(shù)支撐，為奶牛場(chǎng)進(jìn)行科學(xué)的選種選配提供了依據(jù)。

附圖說明

圖1為梯度PCR退火溫度的凝膠電泳圖。其中，泳道3：53.1℃；泳道4：54.6℃；泳道5：56.4℃；泳道6：58.5℃；泳道7：60.7℃；泳道8：62.9℃；泳道9：64.9℃；泳道10：66.6℃；泳道11：67.8℃；泳道12：68.5℃；M：100bp DNA ladder Marker。

圖2為檢測(cè)牛HH5單倍型攜帶者的PCR電泳圖。其中，第一泳道和第二泳道：健康的牛(不攜帶HH5單倍型)；第三泳道：HH5單倍型攜帶者；第四泳道：100bp DNA ladder Marker。

圖3為健康的牛和HH5單倍型攜帶者的測(cè)序峰圖。其中，圖3A為健康的牛個(gè)體的測(cè)序峰圖；圖3B為HH5單倍型攜帶者的測(cè)序峰圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的HH5單倍型是指在牛個(gè)體9號(hào)染色體上第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子發(fā)生缺失而引起等位基因的組合，當(dāng)牛個(gè)體9號(hào)染色體上的兩條同源染色體的第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子均發(fā)生缺失時(shí)，牛個(gè)體的基因型稱為HH5純合單倍型；當(dāng)牛個(gè)體9號(hào)染色體上的兩條同源染色體中僅有一條同源染色體的第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子片段發(fā)生缺失時(shí)，牛個(gè)體的基因型稱為HH5雜合單倍型(下述實(shí)施例中的HH5單倍型即為HH5雜合單倍型)，該牛為HH5單倍型攜帶者。

實(shí)施例1、一種檢測(cè)牛HH5單倍型的專用試劑盒及其檢測(cè)方法

一、檢測(cè)牛HH5單倍型的引物

依據(jù)GenBank上牛9號(hào)染色體上93233kb-93371kb區(qū)段上基因序列，并參考Schütz等(2016)設(shè)計(jì)的引物序列，確定了檢測(cè)HH5攜帶者的特異性引物序列：

上游引物HH5-F：5’-AGATATGCTAAAGTTTACCTAGAAGAA-3’(序列1)；

下游引物HH5-R1：5’-CTGAAGCTCCATTCTGAGTCAT-3’(序列2)；

下游引物HH5-R2：5’-TGCTCTATGAATTTTGTGAATGGT-3’(序列3)。

其中，F(xiàn)/R1引物對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為442bp；F/R2引物對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為256bp。

二、檢測(cè)牛HH5單倍型的方法

1、?？侱NA的提取

選擇北京市種公牛站的攜帶HH5單倍型(基因型鑒定為HH5雜合單倍型)的荷斯坦牛和健康的牛為實(shí)驗(yàn)材料，分別從血液中提取總DNA，總DNA也可以從精液(例如，新鮮或冷凍的)、組織樣品(如耳組織等)或含有毛囊的牛毛樣品中提取、分離和純化。

2、PCR擴(kuò)增

以步驟1中的?？侱NA為模板，采用步驟一中的引物HH5-F、HH5-R1和HH5-R2，用不同的退火溫度梯度(10個(gè)梯度：53.1℃；54.6℃；56.4℃；58.5℃；60.7℃；62.9℃；64.9℃；66.6℃；67.8℃；68.5℃)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60±8℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，然后4℃保存。

PCR反應(yīng)體系(總體積25μl)：dNTP混合物(4×2.5mmol/L)2.0μl、HH5-F(20pmol/L)0.5μl、HH5-R1(20pmol/L)0.5μl、HH5-R2(20pmol/L)0.5μl、Taq DNA聚合酶(3U/μl)0.5μl、模板DNA(50ng/μl)0.5μl，ddH₂O 18.0μl。

經(jīng)過PCR擴(kuò)增條件的篩選和優(yōu)化，上述引物的PCR反應(yīng)體系的理想退火溫度范圍為54.5-60.5℃，最佳退火溫度確定為T＝58℃。圖1為梯度PCR退火溫度的凝膠電泳圖。

3、基因型判定

取4μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖如圖2所示，測(cè)序結(jié)果如圖3所示。圖2中，泳道1和泳道2為健康的牛的PCR產(chǎn)物的電泳圖，泳道3為攜帶HH5單倍型的牛的電泳圖。從圖中可以看出：所有健康的牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為442bp的條帶，而所有攜帶HH5單倍型的牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有大小為442bp(核苷酸序列為序列4)和256bp(核苷酸序列為序列5)的條帶。

因此可以用如下方法檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型：

以待測(cè)奶牛的基因組DNA為模板，采用引物HH5-F、HH5-R1和HH5-R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判斷待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型：

若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅含有大小為442bp的條帶，則待測(cè)奶牛不攜帶HH5單倍型；

若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為442bp和256bp的條帶或僅含有大小為256bp的條帶，則待測(cè)奶牛攜帶HH5單倍型。

實(shí)施例2、檢測(cè)牛HH5單倍型的方法的驗(yàn)證

1、基因型檢測(cè)

利用實(shí)施例1中步驟二的檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的方法，對(duì)北京市種公牛站的40頭荷斯坦牛的基因型進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果表明：40頭荷斯坦牛中有2頭荷斯坦牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有大小為442bp和256bp的條帶，是HH5攜帶者(基因型為HH5單倍型)，攜帶率為5％。

2、測(cè)序驗(yàn)證

對(duì)2頭HH5攜帶者的牛個(gè)體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明：2頭HH5攜帶者的9號(hào)染色體上一條同源染色體的第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子發(fā)生缺失，且另一條同源染色體的第93,232,651-93,370,998位核苷酸分子未發(fā)生缺失。說明本發(fā)明檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型的方法準(zhǔn)確、可靠，而且準(zhǔn)確率達(dá)100％，可用于檢測(cè)待測(cè)奶牛是否攜帶HH5單倍型。

序列表

<110>北京奶牛中心

<120>一種檢測(cè)牛HH5單倍型的專用試劑盒及其檢測(cè)方法

<160>5

<210>1

<211>27bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

agatatgcta aagtttacct agaagaa 27

<210>2

<211>22bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ctgaagctcc attctgagtc at 22

<210>3

<211>24bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tgctctatga attttgtgaa tggt 24

<210>4

<211>442bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

agatatgcta aagtttacct agaagaatat ataagcaaga agaagcaaaa aaaaagtgaa 60

aaggaaaaga gaagaaagaa agaaaaaagg agaagaaaga aagaagaaca gaacagaaag 120

aaagagaaga taagaaagag aaaaggaaat tcagcatcca gaagcatcat tgtaaaacct 180

aagatcataa agtaaccaga aagataacac taaattactt acaaataaac aacaataaat 240

ttgacagctg ccttctcaga agcagaagta gagaccaaat gataatgaag taatatcttc 300

aatgtgctga aggaacataa ctataaattg agatttttgt gcttagtgaa gttattgggc 360

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atgactcaga atggagcttc ag 442

<210>5

<211>256bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

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