本發(fā)明屬于生物技術和生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種表達RSV F蛋白重組載體及F蛋白制備方法。

背景技術：

人呼吸道合胞病毒（RSV）是副粘病毒科、肺炎病毒亞科、肺病毒屬的病原性病毒。RSV的基因組是編碼11個蛋白的負鏈RNA分子。RNA基因組與病毒N蛋白緊密關聯(lián)形成包裹在病毒包膜內的核衣殼。根據G糖蛋白的抗原性的不同，已有A和B兩個亞型。RSV主要感染鼻腔以及肺部大、小氣道的上皮細胞，也可能感染肺泡巨噬細胞和肺部其他類型的細胞。機體在對抗RSV感染中起主要作用的是細胞免疫，其中細胞毒性T淋巴細胞（CTL）是清除受病毒感染細胞的關鍵因素。CD4+T細胞和CD8+T細胞在清除上、下呼吸道內的病毒過程中均能發(fā)揮有效的作用。在RSV外膜具有G、F、SH等跨膜糖蛋白，共同參與病毒外膜與宿主細胞膜的融合以及細胞培養(yǎng)過程中合胞體的形成，其中G、F為兩個重要的膜蛋白成分。G蛋白不僅與病毒和細胞的黏附有關，而且RSV病毒的A、B兩亞型的主要差異也存在于G蛋白中，并且G蛋白在亞型間及亞型內變異極大，是RSV逃逸機體免疫攻擊的重要手段。F蛋白與病毒進入細胞并形成特征性的合胞體有關，還具有促使RSV在感染細胞間傳播及溶血的作用。

F和G蛋白是激發(fā)機體產生保護性抗體最主要的病毒抗原。但G蛋白具有較高的亞型特異性及變異性，故不宜制成疫苗，與之相比F蛋白的抗原性比較穩(wěn)定，較少變異，并且F蛋白是誘導機體產生免疫保護的主要蛋白，它誘導產生的抗體能保護機體免受RSV A、B兩亞型病毒的侵襲，而G蛋白抗體僅對同亞型病毒提供保護，所以F蛋白更有研究價值。

雖然已研制過多種形式的RSV疫苗，如福爾馬林滅活疫苗(FI-RSV)、亞單位疫苗和減毒疫苗、冷適應株疫苗、病毒載體疫苗、DNA疫苗等，但至今尚無可用于預防RSV感染的疫苗問世。同時，由于FI-RSV失敗的陰影及RSV疫苗研制中面臨的動物模型局限、免疫接種人群免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟、母傳抗體干擾和存在兩種不同抗原亞型等諸多復雜問題，使學術界及產業(yè)界一度等對成功研制出有效的RSV疫苗產生了懷疑和悲觀情緒。不過，隨著阿斯利康醫(yī)學免疫公司和美國生物制藥Novavx公司疫苗候選物的研發(fā)，特別是Novavx公司的F蛋白納米粒子基因工程呼吸道合胞病毒疫苗已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床實驗，證明肌肉注射該疫苗的耐受性良好，具有較好的免疫原性，因此研究F蛋白基因工程疫苗具有廣闊的前景。

RSV F蛋白由mRNA翻譯為約574個左右氨基酸的蛋白，稱為F0。F0的翻譯后加工包括通過內質網中的信號肽酶移除N端信號肽。轉運高爾基體內的細胞蛋白酶（特別是弗林蛋白酶（furin））還在兩個位置（約109/110和約136/137）切割F0。該切割導致短干擾序列移除并產生兩種仍彼此相關的亞基，稱為F1（約50kDa，C端約為殘基137-574）和F2（約20kDa，N端，約為殘基1-109）。F1在N端含疏水性融合肽以及2個兩性七肽重復區(qū)(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜結構域。3個F1-F2異源二聚體在病毒粒子中組裝為F1-F2同源三聚體。由于RSV F蛋白加工、構造和重折疊的復雜性，比較難以獲得純化的、均質的免疫原性制備物。

RSV F0 在形成具有免疫原性的抗原物之前需要弗林蛋白酶的酶切，在昆蟲細胞表達系統(tǒng)中弗林蛋白酶表達量不足或者活性不高，導致F0不能完全被切割為F2和F1，影響F1-F2同源三聚體的形成，嚴重限制了F蛋白的表達效率。

此外，F(xiàn)蛋白的純化也是極為重要的，現(xiàn)有技術缺乏高效的F蛋白純化方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高效表達RSV F蛋白的重組載體及方法，該表達載體表達的F蛋白在不需要弗林蛋白酶存在的情況下高效剪切為F2和F1。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體，由骨架載體和插入其中的呼吸道合胞病毒F蛋白表達框構成，呼吸道合胞病毒F蛋白表達框位于載體啟動子下游，包括F2蛋白基因序列、F1蛋白基因序列，F(xiàn)2和F1之間由2A序列連接；2A序列為編碼含D-X-E-X-N-P-G-P氨基酸序列的核酸序列。

優(yōu)選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體中，呼吸道合胞病毒F蛋白表達框的序列根據宿主細胞的偏好性進行密碼子優(yōu)化。

優(yōu)選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的宿主細胞為Spodoptera frugiperda草地夜蛾細胞Sf9。

優(yōu)選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的骨架載體選自pFastBac^TM-1和pFastBac^TM-dual。

優(yōu)選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的F1蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示。

優(yōu)選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的F2蛋白基因序列如SEQ ID NO：2所示。

優(yōu)選的，上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體的2A序列如SEQ ID NO：3所示。

一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的方法，包括如下步驟：

1)使用上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體轉化大腸桿菌DH10 multiBac感受態(tài)細胞，培養(yǎng)后提取重組大腸桿菌DH10 multiBac的質粒，獲得重組桿狀病毒載體；

2)使用重組桿狀病毒載體轉染Sf9細胞，培養(yǎng)后得到包含編碼F蛋白基因的重組桿狀病毒；

3)使用包含編碼F蛋白基因的重組桿狀病毒感染宿主細胞，培養(yǎng)至產生足夠的F蛋白；

4)收集宿主細胞并使用裂解液裂解細胞，裂解液的組成為25 mM Tris-Cl (pH 8.0)、50 mM NaCl, 0.1 % NP9；

5)去除細胞碎片，得到的清液分別經過強陰離子柱EMD TMAE、外源凝集素親和介質GST-Sepharose 4B和強陽離子EMD SO3純化，得到純化的呼吸道合胞病毒F蛋白。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的重組載體，同時表達多個基因，表達的蛋白可以高效自剪切為F2和F1，進而形成F1-F2同源三聚體。

本發(fā)明方法可以高效制備得到純化的F蛋白，得到的純化F蛋白可以作為抗原使用，可以誘導高水平的抗體免疫反應。

附圖說明

圖1是Bac- F2-2A-F1免疫熒光和Western blot分析圖；

圖2是Bac- F2-2A-F1 F蛋白SDS-PAGE和Western blot分析圖；

圖3是F蛋白免疫小鼠血清中和RSV A2中和抗體分析；

圖4是不同優(yōu)化序列的蛋白表達情況；

圖5是不同培養(yǎng)基對蛋白表達情況的影響。

具體實施方式

下面結合具體實驗，進一步說明本發(fā)明的技術方案。

1主要材料

病毒：RSV long RSV A2；

細胞：昆蟲細胞Sf9。

1.2 主要試劑

PremerStar DNA聚合酶（大連寶生物）；

Bac重組桿狀質粒提取試劑盒（Omiga生物）；

卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal、IPTG（北京鼎國）；

LB培養(yǎng)基（Sigma）；

Grace's培養(yǎng)基、FBS（Gibco)；

Cellfectinll脂質體（Sigma）；

Palivizumab單抗；

HRP羊抗人二抗（Invitrogen）；

Donkey Anti-human Alexa Fluor 488(Invitrogen)。

表達呼吸道合胞病毒F蛋白載體的構建

根據宿主細胞Spodoptera frugiperda草地夜蛾（Sf9）細胞系的偏愛性進行密碼子蟲源優(yōu)化，得到優(yōu)化后的RSV F1蛋白和F2蛋白的基因序列，分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

設計引物，將F1蛋白和F2蛋白的基因序列通過2A序列（SEQ ID NO：3）（對應的核酸序列為：SEQ ID NO：4）連接，置于pFastBac 1質粒的Ppolh啟動子下，獲得穿梭載體pFastBacTM1-F2-2A-F1，即表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體。

類似的，可以使用其他骨架載體構建得到表達呼吸道合胞病毒F蛋白的載體。

呼吸道合胞病毒F蛋白的表達純化

1)將構建得到的穿梭載體pFastBacTM1-F2-2A-F1通過Invitrogen的Bac-to-Bac 系統(tǒng)，轉化大腸桿菌DH10 multiBac，培養(yǎng)后，篩選提取陽性重組大腸桿菌DH10 multiBac的質粒，獲得重組桿狀病毒載體；

2)將上一步獲得的重組桿狀病毒載體轉染Sf9細胞獲得相應的第一代重組桿狀病毒，即重組呼吸道合胞桿狀病毒，分別命名為Bac- F2-2A-F1-V1，以MOI=0.1對各病毒進行連續(xù)擴增，獲得的第三代病毒Bac- F2-2A-F1-V3；

3)將Bac- F2-2A-F1-V3以MOI=1感染Sf9懸浮細胞，樣品表達2L，培養(yǎng)4天待細胞完全病變后收獲細胞沉淀；

4)將收獲的細胞以10ml/mg加入裂解液25mM phosphate buffer，pH 8.0；50mM NaCl；0.1% NP9；在冰上均勻攪拌2h，然后將裂解產物使用JA-14轉子（Beckman）高速離心收集上清，再將上清液經分別經強陰離子柱EMD TMAE，外源凝集素親和介質GST-Sepharose 4B和強陽離子EMD SO3純化即可獲得呼吸道合胞病毒F蛋白。

重組桿狀病毒蛋白表達Western blot分析

按照Invitrogen說明書，將上述制得的Bac- F2-2A-F1-V3重組桿狀病毒以MOI=1感染Sf9懸浮細胞，以SF900-Ⅱ為懸浮培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天，收集細胞和上清，取細胞和上清樣品進行10%的SDS-PAGE電泳，轉印PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉過夜，PBST漂洗5次，以1:4000稀釋一抗Palivizumab，室溫孵育2h，PBST稀釋5次，HRP標記的二抗羊抗人室溫孵育1.5h，PBST漂洗5次，利用超敏發(fā)光液（A液25ml、B液25ml）進行壓片顯色。檢測結果如圖1（B）所示， 檢測到的目的蛋白為F0和F1蛋白（Palivizumab中和位點集中在F1上，F(xiàn)2檢測不到）。

F蛋白經SDS-PAGE和Western blot分析，檢測結果如圖2所示， SDS-PAGE和Western blot分析，結果表明，F(xiàn)蛋白純度能達到90%以上。

呼吸道合胞病毒F蛋白疫苗效力分析

疫苗的制備和免疫程序

稀釋制備的呼吸道合胞病毒F蛋白，并分別加入1/10體積的AL(OH)₃佐劑（1000mg/ml）混合，使得蛋白濃度為10μg/ml，利用以上純化的F蛋白對六周齡的BALB/c母鼠分別在0， 28天免疫兩次，每次每只分別免疫20μg、5μg、1μg，。同時設置同樣處理的未感染病毒的Sf9細胞作為陰性對照，每組免疫10小鼠。5周后小鼠眼球采血，收集血清，-80℃分裝保存。

免疫小鼠血清中和抗體滴度

取各組小鼠血清樣品，56℃滅活30min，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基成倍比稀釋。

F-20μg、F-5μg和F-1μg免疫小鼠血清中和RSV A2株，將RSV A2用1640培養(yǎng)基稀釋到100 PFU/100μl。稀釋后的病毒液、樣品各取100μl，混合均勻，在37℃細胞培養(yǎng)箱放置2小時。吸去Hep-2細胞培養(yǎng)上清，取200μl混合液加入到6孔板Hep-2細胞中，加入陰性對照，放入37℃繼續(xù)培養(yǎng)2h。每孔加入4 ml 1%的甲基纖維素，放置于CO₂培養(yǎng)箱中5天，去培養(yǎng)基，結晶紫染色，統(tǒng)計出斑情況，能使空斑數(shù)減少50%的血清稀釋度判定為血清的中和抗體滴度，計算各個樣品的中和抗體滴度。

實驗結果如圖3所示，本發(fā)明制備的F蛋白1μg、5μg和20μg免疫小鼠血清中和RSV A2都可以誘導1：256左右的中和效價，免疫劑量達到1μg以后，中和效價沒有明顯變化，說明當免疫劑量達到1ug時，中和效價達到最高；上述結果說明，本發(fā)明制備的呼吸道合胞病毒F蛋白誘導產生的抗體分別對RSV A2有較強的中和作用，因此本發(fā)明制備的呼吸道合胞病毒F蛋白可作為預防呼吸道合胞病毒感染相關疾病的疫苗。

密碼子優(yōu)化對F蛋白表達量的影響

按照上述表達呼吸道合胞病毒F蛋白載體的構建、呼吸道合胞病毒F蛋白的表達純化的操作，使用現(xiàn)有通用方法優(yōu)化得到的密碼子序列F1’（ SEQ ID NO：5）替換SEQ ID NO：1所示的RSV F1蛋白，F(xiàn)2’（SEQ ID NO：6）替換SEQ ID NO：2所示的F2蛋白的基因序列，2A’替換SEQ ID NO：4所示的2A序列，檢測其表達情況。檢測結果如圖4所示，圖中，1為常規(guī)方法優(yōu)化后的密碼子序列的表達結果，2為本發(fā)明方法優(yōu)化后的表達結果，從圖中可以看出，本發(fā)明方法優(yōu)化的密碼子序列具有更高的表達活性，表達出來的F蛋白是常規(guī)方法優(yōu)化序列的近3倍。

SF900-Ⅱ培養(yǎng)基添加不同成分對F蛋白表達量的影響

按上述呼吸道合胞病毒F蛋白的表達純化的方法，分別在SF900-Ⅱ培養(yǎng)基添加不同的成分，其中，組（1）添加SF900-Ⅱ培養(yǎng)基質量的0.3%聚醚F-68，并添加終濃度為5g/L葡萄糖；組（2）添加SF900-Ⅱ培養(yǎng)基質量的0.3%聚醚F-68；組（3）為對照組，為SF900-Ⅱ培養(yǎng)基。實驗結果如圖5所示。從較長可以看出，組（1）的F蛋白表達量顯著高于其他兩組，說明其可以有效促進F蛋白的表達。

<110> 廣東華南聯(lián)合疫苗開發(fā)院有限公司

<120> 一種表達呼吸道合胞病毒F蛋白的重組載體及方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 1

ttcctgggat tcctgctggg agtcggaagc gcaattgcgt ctggagtggc tgtttccaag 60

gtgctccact tggagggtga agtcaacaag atcaaatcag ctctcttgag tacaaacaag 120

gccgtggtct cattgagtaa cggtgtctcg gttctgacct ccaaggtgct ggacctcaaa 180

aactacattg ataagcagct gctccccatc gttaacaaac aaagctgctc catttctaac 240

atcgagactg tgatcgaatt ccagcaaaag aacaacaggt tgctggagat cacaagagaa 300

ttctcggtga acgctggagt taccactccc gtctccacat acatgctgac gaactcagag 360

ctcttgagtc tcattaacga catgccaatc accaacgatc agaagaaatt gatgtcgaac 420

aacgtccaaa tcgttagaca gcaatcgtac tccatcatgt caatcattaa ggaggaagtg 480

ctggcttacg ttgtgcagtt gccactgtac ggtgtcatcg acaccccgtg ctggaaactc 540

catactagcc ctttgtgtac aacgaacaca aaggaaggct ctaacatctg cctgacccgc 600

actgaccgtg gatggtactg tgataacgct ggtagcgtct ctttcttccc acaggccgag 660

acttgcaagg tccaaagcaa ccgcgttttc tgtgacacca tgaactcgct cactttgccg 720

tccgaagtga acctctgcaa cgtcgacatc ttcaacccta agtacgattg taaaatcatg 780

actagcaaga cagacgtttc cagctctgtg attacctcac tgggcgctat cgtgagttgc 840

tacggaaaga cgaaatgtac cgcctctaac aaaaaccgtg gtatcattaa gactttcagc 900

aacggctgcg actacgtttc taacaagggt gtggatacag tgagtgtcgg caacacgctc 960

tactacgtca acaagcagga gggaaaatct ttgtacgtta agggtgaacc gatcattaac 1020

ttctacgacc ctctggtctt cccctcagac gagttcgatg catcaatcag tcaggttaac 1080

gaaaaaatca accaatcact cgcgttcatc aggaagagtg atgagctgct ccacaacgtg 1140

aacgctggca agtctaccac taacattatg atcacaacga tcattatcgt gattatcgtc 1200

attttgctgt cactgatcgc agtgggcctc ttgctgtact gcaaagcgag aagtactcct 1260

gtcacactga gcaaggacca actctctgga attaacaaca tcgccttctc caactaa 1317

<210> 2

<211> 324

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 2

atggagctgc tgattctgaa agccaacgca attactacga ttctcaccgc tgtcacattc 60

tgcttcgcat ctggtcaaaa cattactgag gaattctacc agagtacctg ctcggcagtc 120

tccaagggct acctgagcgc gctccgtacg ggatggtaca cctccgtgat cactatcgag 180

ctgtccaaca tcaaggaaaa caaatgtaac ggcactgacg ccaaggttaa attgatcaag 240

caagagctgg ataagtacaa aaacgcagtg acagaactgc agctgctcat gcaatctact 300

cctgctacca acaacagggc aagg 324

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 5

<211> 1317

<212> DNA

<213> 呼吸道合胞病毒

<400> 5

ttcctgggtt tcctgctggg tgttggttct gctatcgctt ctggtgttgc tgtttctaaa 60

gttctgcacc tggaaggtga agttaacaaa atcaaatctg ctctgctgtc taccaacaag 120

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<210> 6

<211> 324

<212> DNA

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<400> 6

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tgtttcgctt ctggtcagaa catcaccgaa gaattctacc agtctacctg ttctgctgtt 120

tctaaaggtt acctgtctgc tctgcgtacc ggttggtaca cctctgttat caccatcgaa 180

ctgtctaaca tcaaagaaaa caaatgtaac ggtaccgatg ctaaagttaa actgatcaaa 240

caggaactgg ataaatacaa aaacgctgtt accgaactgc agctgctgat gcagtctacc 300

ccagctacca acaaccgtgc tcgt 324

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggttctggtg ctaccaactt ctctctgctg aaacaggctg gtgatgttga agaaaaccca 60

ggtcca 66