本發(fā)明涉及細胞學領域，具體涉及一種提高昆蟲細胞轉染效率的陽離子聚合物PEI法。

背景技術：

細胞轉染方法包括DEAE－葡聚糖法，磷酸鈣法，陽離子脂質體法，陽離子聚合物，病毒介導法，Biolistic顆粒傳遞法(基因槍粒子轟擊法)，顯微注射法以及電穿孔法等，磷酸鈣法操作簡便但重復性差。陽離子脂質體法使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用于各種類型的裸露DNA或RNA，能轉染各種類型的細胞，沒有免疫原性，在體外基因轉染中有很高的效率，但試劑昂貴，現(xiàn)在轉染試劑是1500-3000元/1mL，轉染6孔板每次用每孔10μL，轉染一次的成本為15-30元。陽離子聚合物PEI法除了具有陽離子脂質體的轉染效率高，操作簡單，適用范圍廣，重復性好等特點外，還具有在體內轉染效率高，細胞毒性低等特點，是新一代的轉染試劑。PEI法轉染一孔的成本不到0.1元。但是目前在昆蟲細胞的轉染上，PEI法的轉染效率比不上脂質體法，脂質體法的轉染效率在80-90％，而PEI法轉染昆蟲細胞的轉染效率在45-54％之間，因此需要提高PEI法的轉染效率，以更好的應用于昆蟲細胞的轉染。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中PEI法的轉染效率低的問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種提高昆蟲細胞轉染效率的陽離子聚合物PEI法，其采用低成本的PEI轉染法，且取得了相當于脂質體法和電轉染法的轉染效率。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種提高昆蟲細胞轉染效率的陽離子聚合物PEI法，包括如下步驟：

1)將昆蟲細胞進行懸浮培養(yǎng)；

2)轉染前，將步驟1)中懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞進行貼壁培養(yǎng)；

3)將貼壁狀態(tài)的昆蟲細胞進行陽離子聚合物PEI法轉染。

作為進一步的優(yōu)選，所述步驟1)中，所述懸浮培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。

作為進一步的優(yōu)選，所述步驟2)中，所述貼壁培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為加入10％-20％胎牛血清的無血清培養(yǎng)基。

作為進一步的優(yōu)選，所述無血清培養(yǎng)基選自ESF 921、SF900 II SFM或InsectPro SF9/SF21昆蟲細胞無血清培養(yǎng)基。

作為進一步的優(yōu)選，所述步驟2)中，貼壁培養(yǎng)的時間為轉染前的24小時。

作為進一步的優(yōu)選，所述昆蟲細胞為Sf9或Sf21。

作為進一步的優(yōu)選，所述步驟3)中，所述轉染方法包括：采用轉染培養(yǎng)基稀釋待轉染質粒；將PEI溶液加入轉染培養(yǎng)基中，混合均勻后與所述稀釋的待轉染質粒混勻，靜置后加入到待轉染細胞孔中，完成轉染。

作為進一步的優(yōu)選，所述步驟3)中，所述轉染培養(yǎng)基為Grace's Insect Medium，Supplemented完全培養(yǎng)基或Expression System的Transfection Medium培養(yǎng)基。

作為進一步的優(yōu)選，所述待轉染質粒的質量與PEI分子的質量比例為1：3-1：8。

作為進一步的優(yōu)選，轉染昆蟲細胞濃度是1×10⁶～2×10⁶個細胞/mL。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)現(xiàn)有技術中是用貼壁培養(yǎng)的細胞進行轉染，而本發(fā)明采用懸浮培養(yǎng)的細胞進行貼壁的轉染，即將昆蟲細胞先進行懸浮培養(yǎng)，到轉染前改為貼壁培養(yǎng)一段時間，在貼壁狀態(tài)下進行轉染。由于懸浮細胞跟貼壁細胞相比傳代更方便，細胞密度和活率更好控制且不會像貼壁的昆蟲細胞一樣容易受到因傳代而導致的細胞機械損傷，因此懸浮狀態(tài)的昆蟲細胞狀態(tài)更好，大大提高了轉染效率。因此，本發(fā)明轉染采用低成本的PEI轉染法，取得了相當于脂質體法和電轉染法的轉染效率。

(2)本發(fā)明在無血清培養(yǎng)基中加入含10％-20％胎牛血清以用于昆蟲細胞的貼壁培養(yǎng)。

(3)本發(fā)明轉染培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium，Supplemented完全培養(yǎng)基或Transfection Medium培養(yǎng)基，降低了成本，簡化了步驟。

(4)本發(fā)明中細胞狀態(tài)、轉染方法、細胞密度或濃度以及質粒和PEI的比例等因素的選擇均大大提高了轉染效率。

附圖說明

圖1a、1b為本發(fā)明實施例1的細胞轉染前后對比圖，圖1a是白光下細胞圖，圖1b為GFP熒光圖。

圖2a、2b為本發(fā)明實施例2的細胞轉染前后對比圖，圖2a是白光下細胞圖，圖2b為GFP熒光圖。

圖3a、3b為本發(fā)明實施例4的細胞轉染前后對比圖，圖2a是白光下細胞圖，圖2b為GFP熒光圖。

圖4a、4b為對比實施例的細胞轉染前后對比圖，圖3a是白光下細胞圖，圖3b為GFP熒光圖。

具體實施方式

本發(fā)明通過提供一種提高昆蟲細胞轉染效率的陽離子聚合物PEI法，解決了現(xiàn)有技術PEI法的轉染效率低的問題，本發(fā)明采用低成本的PEI轉染法，且取得了相當于脂質體法和電轉染法的轉染效率。

本發(fā)明實施例提高昆蟲細胞轉染效率的陽離子聚合物PEI法，包括如下步驟：

1)將昆蟲細胞進行懸浮培養(yǎng)；

2)轉染前，將步驟1)中懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞進行貼壁培養(yǎng)；

3)將貼壁狀態(tài)的昆蟲細胞進行陽離子聚合物PEI法轉染。

為了更好的理解上述技術方案，下面將結合說明書附圖以及具體的實施方式對上述技術方案做詳細的說明。

實施例1

一、克隆

設計引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG3'(BamHI)EGFP-下：5'TAGCGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC3'(EcoR I)從pEGFP-N1質粒上擴出EGFP片段后做BamH I和EcoR I雙酶切處理，然后與做同樣雙酶切的pFascBac1載體混合后加入T4 DNA連接酶過夜連接，第二天用DH10Bac菌株轉化。轉化后48小時挑取白色菌落做PCR鑒定。鑒定正確的菌落用質粒抽提試劑盒提取質粒備用。

二、轉染

1、用無血清培養(yǎng)基ESF 921懸浮培養(yǎng)Sf9細胞，置于27℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱，轉速120rpm。

2、轉染前24h用處于對數(shù)生長期的Sf9鋪2×10⁶個細胞于6孔板每個單孔中，每孔約2mL，待細胞完全貼壁后換成加入10％胎牛血清的無血清培養(yǎng)基ESF 921。

3、轉染當天棄去頭一天的培養(yǎng)基，換成不加雙抗的Grace's Insect Medium,Supplemented完全培養(yǎng)基。

4、取5μg質粒(濃度5μg/μL，約1.1μL體積)，用不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋到11μL。

5、取一個無菌的EP管，25μL的PEI儲存溶液加入25μL不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋混合均勻后取50μL與上一步的質粒稀釋液混勻，靜置5分鐘后加入到待轉染細胞孔中。

PEI儲存液(1μg/μL)配制方法如下：稱取50mg PEI粉末溶解于50mL 1×HBS(pH7.4)中，0.2μm濾膜過濾，儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1×HBS(pH7.4)配制方法如下：將8.76g NaCl溶解于900mL超純水，加入20mL 1M的HEPES，調pH值到7.4，定容至1L，過濾(0.2μm濾膜)后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

6、放于27℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48h可以看到10～20顆熒光細胞，72h熒光率達95％，如圖1a、1b中所示。

實施例2

一、克隆

設計引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG3'(BamHI)EGFP-下：5'TAGCGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC 3'(EcoR I)從pEGFP-N1質粒上擴出EGFP片段后做BamH I和EcoR I雙酶切處理，然后與做同樣雙酶切的pFascBac1載體混合后加入T4 DNA連接酶過夜連接，第二天用DH10Bac菌株轉化。轉化后48小時挑取白色菌落做PCR鑒定。鑒定正確的菌落用質粒抽提試劑盒提取質粒備用。

二、轉染

1、用無血清培養(yǎng)基ESF 921懸浮培養(yǎng)Sf21細胞，置于27℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱，轉速120rpm。

2、轉染前24h用處于對數(shù)生長期的Sf21鋪2×10⁶個細胞于6孔板每個單孔中，每孔約2mL，待細胞完全貼壁后換成含15％胎牛血清的無血清培養(yǎng)基ESF921。

3、轉染當天棄去頭一天的培養(yǎng)基，換成不加雙抗的Grace's Insect Medium,Supplemented完全培養(yǎng)基。

4、取5μg質粒(濃度5μg/μL，約1.1μL體積)，用不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋到11μL。

5、取一個無菌的EP管，25μL的PEI溶液加入25μL不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋混合均勻后取50μL與上一步的質粒稀釋液混勻，靜置5分鐘后加入到待轉染細胞孔中。

PEI儲存液(1μg/μL)配制方法如下：稱取50mg PEI粉末溶解于50mL 1×HBS(pH7.4)中，0.2μm濾膜過濾，儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1×HBS(pH7.4)配制方法如下：將8.76g NaCl溶解于900mL超純水，加入20mL 1M的HEPES，調pH值到7.4，定容至1L，過濾(0.2μm濾膜)后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

6、放于27℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72h可以看到熒光細胞，72h熒光率達90％。如圖2a、2b中所示。

實施例3

一、克隆

設計引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG3'(BamHI)EGFP-下：5'TAGCGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC 3'(EcoR I)從pEGFP-N1質粒上擴出EGFP片段后做BamH I和EcoR I雙酶切處理，然后與做同樣雙酶切的pFascBac1載體混合后加入T4 DNA連接酶過夜連接，第二天用DH10Bac菌株轉化。轉化后48小時挑取白色菌落做PCR鑒定。鑒定正確的菌落用質粒抽提試劑盒提取質粒備用。

二、轉染

1、用無血清培養(yǎng)基SF900 II SFM懸浮培養(yǎng)Sf9細胞，置于27℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱，轉速120rpm。

2、轉染前24h用處于對數(shù)生長期的Sf9鋪2×10⁶個細胞于6孔板每個單孔中，每孔約2mL，待細胞完全貼壁后換成加入20％胎牛血清的無血清培養(yǎng)基SF900 II SFM。

3、轉染當天棄去頭一天的培養(yǎng)基，換成不加雙抗的Grace's Insect Medium,Supplemented完全培養(yǎng)基。

4、取5μg質粒(濃度5μg/μL，約1.1μL體積)，用不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋到11μL。

5、取一個無菌的EP管，15μL的PEI溶液加入25μL不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋混合均勻后取40μL與上一步的質粒稀釋液混勻，靜置5分鐘后加入到待轉染細胞孔中。

PEI儲存液(1μg/μL)配制方法如下：稱取50mg PEI粉末溶解于50mL 1×HBS(pH7.4)中，0.2μm濾膜過濾，儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1×HBS(pH7.4)配制方法如下：將8.76g NaCl溶解于900mL超純水，加入20mL 1M的HEPES，調pH值到7.4，定容至1L，過濾(0.2μm濾膜)后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

6、放于27℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48h可以看到熒光細胞，72h熒光率達85％。

實施例4

一、克隆

設計引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG3'(BamHI)EGFP-下：5'TAGCGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC 3'(EcoR I)從pEGFP-N1質粒上擴出EGFP片段后做BamH I和EcoR I雙酶切處理，然后與做同樣雙酶切的pFascBac1載體混合后加入T4 DNA連接酶過夜連接，第二天用DH10Bac菌株轉化。轉化后48小時挑取白色菌落做PCR鑒定。鑒定正確的菌落用質粒抽提試劑盒提取質粒備用。

二、轉染

1、用無血清培養(yǎng)基InsectPro SF21懸浮培養(yǎng)Sf21細胞，置于27℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱，轉速120rpm。

2、轉染前24h用處于對數(shù)生長期的Sf21鋪2×10⁶個細胞于6孔板每個單孔中，每孔約2mL，待細胞完全貼壁后換成加入10％胎牛血清的無血清培養(yǎng)基InsectPro SF21。

3、轉染當天棄去頭一天的培養(yǎng)基，換成不加雙抗的Expression System的Transfection Medium培養(yǎng)基。

4、取5μg質粒(濃度5μg/μL，約1.1μL體積)，用不加雙抗和血清的Expression System的Transfection Medium培養(yǎng)基稀釋到11μL。

5、取一個無菌的EP管，30μL的PEI儲存溶液加入25μL不加雙抗和血清的Transfection Medium培養(yǎng)基稀釋混合均勻后取55μL與上一步的質粒稀釋液混勻，靜置5分鐘后加入到待轉染細胞孔中。

PEI儲存液(1μg/μL)配制方法如下：稱取50mg PEI粉末溶解于50mL 1×HBS(pH7.4)中，0.2μm濾膜過濾，儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1×HBS(pH7.4)配制方法如下：將8.76g NaCl溶解于900mL超純水，加入20mL 1M的HEPES，調pH值到7.4，定容至1L，過濾(0.2μm濾膜)后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

6、放于27℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72h可以看到熒光細胞，72h熒光率達92％，如圖3a、3b中所示。

實施例5

一、克隆

設計引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG3'(BamHI)EGFP-下：5'TAGCGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC 3'(EcoR I)從pEGFP-N1質粒上擴出EGFP片段后做BamH I和EcoR I雙酶切處理，然后與做同樣雙酶切的pFascBac1載體混合后加入T4 DNA連接酶過夜連接，第二天用DH10Bac菌株轉化。轉化后48小時挑取白色菌落做PCR鑒定。鑒定正確的菌落用質粒抽提試劑盒提取質粒備用。

二、轉染

1、用無血清培養(yǎng)基SF900 II SFM懸浮培養(yǎng)Sf9細胞，置于27℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱，轉速120rpm。

2、轉染前24h用處于對數(shù)生長期的Sf9鋪2×10⁶個細胞于6孔板每個單孔中，每孔約2mL，待細胞完全貼壁后換成加入10％胎牛血清的無血清培養(yǎng)基SF900 II SFM。

3、轉染當天棄去頭一天的培養(yǎng)基，換成不加雙抗的Grace's Insect Medium,Supplemented完全培養(yǎng)基。

4、取5μg質粒(濃度5μg/μL，約1.1μL體積)，用不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋到11μL。

5、取一個無菌的EP管，40μL的PEI儲存溶液加入25μL不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented培養(yǎng)基稀釋混合均勻后取65μL與上一步的質粒稀釋液混勻，靜置5分鐘后加入到待轉染細胞孔中。

PEI儲存液(1μg/μL)配制方法如下：稱取50mg PEI粉末溶解于50mL 1×HBS(pH7.4)中，0.2μm濾膜過濾，儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1×HBS(pH7.4)配制方法如下：將8.76g NaCl溶解于900mL超純水，加入20mL 1M的HEPES，調pH值到7.4，定容至1L，過濾(0.2μm濾膜)后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

6、放于27℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)72h可以看到熒光細胞，72h熒光率達90％。

對比實施例

一、克隆

設計引物，EGFP-上：5'TCAGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG3'(BamHI)EGFP-下：5'TAGCGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC 3'(EcoR I)從pEGFP-N1質粒上擴出EGFP片段后做BamH I和EcoR I雙酶切處理，然后與做同樣雙酶切的pFascBac1載體混合后加入T4 DNA連接酶過夜連接，第二天用DH10Bac菌株轉化。轉化后48小時挑取白色菌落做PCR鑒定。鑒定正確的菌落用質粒抽提試劑盒提取質粒備用。

二、轉染

1、4℃溫育生長匯合的Sf9細胞20分鐘，移除培養(yǎng)基，換為6mL加抗菌抗真菌的新鮮FBS/Grace’s培養(yǎng)基，使用培養(yǎng)基沖洗重懸細胞，顯微鏡計數(shù)，在50mL無菌試管中用含雙抗完全Grace’s培養(yǎng)基稀釋懸浮細胞到7×10⁴cells/mL。

2、用10mL血清移液管，分別吸取1mL種子液到24孔細胞培養(yǎng)板各孔，放置10-15min使細胞達到22℃。

3、在1.5mL無菌EP管中稀釋1μg(2μL)待轉染質粒DNA到100μL的150mM NaCl，每個轉染一管，小心渦旋5-10s。

4、DNA管放置到金屬浴72℃ 5-10min進行DNA滅菌，然后冷卻到室溫。

5、加3.3μL PEI試劑到每個DNA溶液中，渦旋10s混勻，短暫離心后室溫溫育10min以生成DNA/PEI復合物。

6、溫育后，每個轉染分別緩慢滴加100μL DNA/PEI復合物并分散到每個細胞上，密封并緩慢來回晃動以分散復合物，細胞培養(yǎng)板280g離心5min。

7、26℃濕盒里溫育轉染細胞72h，觀察熒光細胞，熒光率為30％～35％，如圖2a、2b中所示。

上述本申請實施例中的技術方案，至少具有如下的技術效果或優(yōu)點：

(1)現(xiàn)有技術中是用貼壁培養(yǎng)的細胞進行轉染，而本發(fā)明采用懸浮培養(yǎng)的細胞進行貼壁的轉染，即將昆蟲細胞先進行懸浮培養(yǎng)，到轉染前改為貼壁培養(yǎng)一段時間，在貼壁狀態(tài)下進行轉染。由于懸浮細胞跟貼壁細胞相比傳代更方便，細胞密度和活率更好控制且不會像貼壁的昆蟲細胞一樣容易受到因傳代而導致的細胞機械損傷，因此懸浮狀態(tài)的昆蟲細胞狀態(tài)更好，大大提高了轉染效率。因此，本發(fā)明轉染采用低成本的PEI轉染法，取得了相當于脂質體法和電轉染法的轉染效率。

(2)本發(fā)明在無血清培養(yǎng)基中加入含10％-20％胎牛血清以用于昆蟲細胞的貼壁培養(yǎng)。

(3)本發(fā)明轉染培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為不加雙抗和血清的Grace's Insect Medium,Supplemented完全培養(yǎng)基或Expression System的Transfection Medium培養(yǎng)基，降低了成本，簡化了步驟。

(4)本發(fā)明中細胞狀態(tài)、轉染方法、細胞密度以及質粒和PEI的比例等因素的選擇均大大提高了轉染效率。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內。