相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)主張于2010年11月3日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/409,831的利益，其全部教導(dǎo)通過引用并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于制備包含安絲菌素衍生物和細(xì)胞結(jié)合劑的細(xì)胞毒性偶聯(lián)物的方法。這些偶聯(lián)物當(dāng)以靶向方式被遞送到特定細(xì)胞群體時(shí)具有治療用途。本發(fā)明還涉及用于制備具有連接子半族的安絲菌素衍生物的方法，其可用于制備細(xì)胞毒性偶聯(lián)物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及新型安絲菌素衍生物。

發(fā)明背景

正在將細(xì)胞毒性藥物的抗體偶聯(lián)物開發(fā)成靶特異性治療劑。抗各種癌細(xì)胞-表面抗原的抗體已與不同細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)(參見Chari 1998,Adv.Drug Delivery Revs.,31,p 89-104；Chari,2008,Acc.Chem.Res.,41,p 98-107；Ducry&Stump,2010,Bioconjugate Chem.,21,p 5-13；Senter,2009,Curr Opinions in Chem.Biol.,13,p 235-244；Ojima.等人，2002,J Med.Chem.45,5620-5623；Hamann,P.R.等人，2002,Bioconjug Chem.13,47-58；Bross,P.F..等人，2001Clin Cancer Res.7,1490-6；DiJoseph、J.F.等人,2004,Blood,103:1807-1814；Doronina,S.O.,等人，2003,Nat Biotechnol.21,778-784；Doronina,S.O.,等人，2006,Bioconjug Chem.17,114-24)。

用于抗體-藥物偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性化合物抑制各種必要的細(xì)胞靶，例如微管(美登木素、阿里他汀類(auristatins)、紫杉烷類：美國(guó)專利No.5,208,020；5,416,064；6,333,410；6,441,163；6,340,701；6,372,738；6,436,931；6,596,757；7,276,497；7,301,019；7,303,749；7,368,565；7,473,796；7,585,857；7,598,290；7,495,114；7,601,354、美國(guó)專利申請(qǐng)No.20100092495、20100129314、20090274713、20090076263、20080171865)和DNA(加里剎霉素、阿霉素、CC-1065類似物:美國(guó)專利No.5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,534,660；6,756,397；6,630,579；7,388,026；7,655,660；7,655,661)。在這些偶聯(lián)物中，細(xì)胞毒性半族和抗體經(jīng)由可切割的連接子例如二硫鍵、酸不穩(wěn)定鍵、肽酶不穩(wěn)定性鍵、或酯酶不穩(wěn)定鍵、或經(jīng)由不可切割的連接子、例如硫醚鍵或酰胺鍵連接在一起。具有這些細(xì)胞毒性藥物中的一些的抗體偶聯(lián)物在臨床中正在積極地研究用于癌癥治療(Richart,A.D.,和Tolcher,A.W.,2007,Nature Clinical Practice,4,245-255；Krop等人，2010,J.Clin.Oncol.,28,p 2698-2704)。

各種連接子技術(shù)已被用于制備此類免疫偶聯(lián)物，并研究了可切割的連接子和不可切割的連接子。然而，在大多數(shù)情況下，僅在藥物分子可以在把位點(diǎn)以未被修飾的方式從偶聯(lián)物上被釋放時(shí)，才觀察到藥物的完整的細(xì)胞毒性效力。

已被用于制備抗體-藥物偶聯(lián)物的可切割連接子中的一種是，基于順烏頭酸的酸不穩(wěn)定性連接子，其利用了不同的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的酸性環(huán)境，例如在受體介導(dǎo)的胞吞作用期間遇到的內(nèi)體和溶酶體。Shen和Ryser將此方法引入以制備柔紅霉素和大分子載體的偶聯(lián)物(Biochem.Biophys.Res.Commun.102:1048-1054(1981))。Yang和Reisfeld用同樣的技術(shù)將柔紅霉素偶聯(lián)到抗黑素瘤抗體(J.Natl.Canc.Inst.80:1154-1159(1988))。Dillman等人也以相似的方式應(yīng)用酸不穩(wěn) 定性連接子來制備柔紅霉素和抗T細(xì)胞抗體的偶聯(lián)物(Cancer Res.48:6097-6102(1988))。

由Trouet等人開發(fā)的一種替代方法，涉及通過肽間隔臂將柔紅霉素連接到抗體(Proc.Natl.Acad.Sci.79:626-629(1982))。這是在游離藥物可以經(jīng)溶酶體肽酶的作用從這樣的偶聯(lián)物上被釋放出來的前提下進(jìn)行的。

美登木素是高度細(xì)胞毒性的藥物。美登素(maytansine)首先由Kupchan等人從東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)中分離出來，并且顯示它比傳統(tǒng)的癌癥化療劑如甲氨蝶呤、柔紅霉素和長(zhǎng)春新堿的細(xì)胞毒性強(qiáng)100至1000倍(美國(guó)專利No.3,896,111)。隨后，發(fā)現(xiàn)一些微生物也生成美登木素，例如美登醇和美登醇的C-3酯(美國(guó)專利No.4,151,042)。也報(bào)道了合成的美登醇C-3酯及美登醇的類似物(Kupchan等人J.Med.Chem.21:31-37(1978)；Higashide等人Nature270:721-722(1977)；Kawai等人Chem.Pharm.Bull.32:3441-3451(1984))。用以制備C-3酯的美登醇的類似物的例子包括，在芳族環(huán)上有修飾(例如脫氯)的美登醇或在C-9、C-14(例如羥基化的甲基基團(tuán))、C-15、C-18、C-20和C-4,5處帶有修飾的美登醇。

天然存在的美登醇C-3酯和合成的美登醇C-3酯可以被分為兩組：

(a)具有簡(jiǎn)單羧酸的C-3酯(美國(guó)專利No.4,248,870；4,265,814；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,317,821；4,322,348；以及4,331,598和Chem.Pharm.Bull.1984,12:3441)，以及

(b)具有N-甲基-L-丙氨酸的衍生物的C-3酯(美國(guó)專利No.4,137,230；4,260,608；5,208,020；以及Chem.Pharm.Bull.1984,12:3441)。

已發(fā)現(xiàn)，攜帶乙?；疦-甲基丙氨酸酯的組(b)的酯比組(a)的安絲 菌素酯更具有細(xì)胞毒性。例如，Kupchan等人(J.Med.Chem.,21；31(1978)報(bào)道，安絲菌素類似物(美登醇的簡(jiǎn)單C3酯)例如丙?；ァ逡阴；ァ投辊；ズ腿阴；?IC₅₀＝0.00021-0.01微克/mL)對(duì)癌細(xì)胞的效力比在C3攜帶乙?；疦-甲基-L-丙氨酸酯的酯例如美登素(IC₅₀＝0.0000061微克/mL)低34至1640倍。在該研究中測(cè)試的6種簡(jiǎn)單的安絲菌素酯中僅有2種具有與含有N-甲基丙氨酸的化合物美登素類似的效力。相比之下，不管酰基的性質(zhì)如何，美登醇的N-?；?N-甲基-L-丙氨?；ゾ叨扔行?。其他修飾的安絲菌素已由Kawai等人報(bào)道(Chem.Pharm.Bull.,32；3441,1984)。已報(bào)道，大部分這些化合物在1至4微克/mL下具有抗微生物活性。并未報(bào)道體內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞殺死活性。

美登素是美登醇的N-乙酰基-N-甲基-L-丙氨?；?。其是高度有效的有絲分裂抑制劑。已報(bào)道，用美登素在體內(nèi)處理L1210細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞的67％積累在有絲分裂期。據(jù)報(bào)道，未被處理的對(duì)照細(xì)胞顯示了范圍在3.2％至5.8％之間的有絲分裂指數(shù)(Sieber等人43Comparative Leukemia Research 1975,Bibl.Haemat.495-500(1976))。用海膽卵和蛤卵進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)提示，美登素通過抑制微管蛋白質(zhì)(microtubule)——微管蛋白(tubulin)的聚合而干擾微管的形成，從而抑制有絲分裂(Remillard等人Science 189:1002-1005(1975))。

在體外，已發(fā)現(xiàn)P388、L1210和LY5178鼠白血病細(xì)胞懸液被美登素抑制，美登素的劑量是10^-3至10^-1μg/μl，其中P388細(xì)胞系最為敏感。也已顯示，美登素是人鼻咽癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)的活性抑制劑，并且據(jù)報(bào)道，人急性成淋巴細(xì)胞性白血病系CEM被低至10^-7mg/ml的濃度所抑制(Wolpert-DeFillippes等人Biochem.Pharmacol.24:1735-1738(1975))。

在體內(nèi)，也已顯示，美登素是活性的。在50倍至100倍的劑量范圍內(nèi)，P388淋巴細(xì)胞白血病系統(tǒng)中的腫瘤生長(zhǎng)被抑制，這表明了高的治療指數(shù)；對(duì)于L1210鼠白血病系統(tǒng)、人Lewis肺癌系統(tǒng)和人 B-16黑素癌系統(tǒng)，也可以顯示出顯著的抑制活性(Kupchan,Fed.Proc.33:2288-2295(1974))。

基于其高效力，描述了在適用于連接到細(xì)胞結(jié)合劑的N-甲基丙氨?；胱迳蠑y帶各種酰基側(cè)鏈的美登素類似物(參見例如美國(guó)專利No.5,208,020；5,416,064；7,473,796；7,368,565；7.301,019；7,276,497；6,716,821；6,441,163；美國(guó)專利申請(qǐng)No.20100129314；20100092495；20090274713；20090076263；20080171865；20080171856；20070270585；20070269447；20070264266；以及20060167245；Chari等人，Cancer Res.,52:127-131(1992)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,93:8618-8623(1996)；以及Widdison等人，J.Med.Chem.,49；4392,2006)。在這些偶聯(lián)物中，細(xì)胞結(jié)合劑經(jīng)由二硫鍵連接到美登木素，例如DM1[N^2’-脫乙?；?N-^2’(3-巰基-1-氧代丙基)-美登素，CAS號(hào)：139504-50-0，圖1]或DM4[N^2’-脫乙?；?N-^2’(4-巰基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素，CAS號(hào)：796073-69-3]。

在上述專利中，用于與細(xì)胞結(jié)合劑連接的美登木素藥物攜帶含酰化的N-甲基丙氨酸或N-甲基半胱氨酸的酯側(cè)鏈(參見圖1)。含N-甲基丙氨酸或N-甲基半胱氨酸的側(cè)鏈必須具有L構(gòu)型以得到高效力，而D-異構(gòu)體的效力地至多100倍(參見Widdison等人，J.Med.Chem.,49；4392,2006)。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于下面的出乎意料的發(fā)現(xiàn)：與之前的報(bào)道相反，攜帶不同的簡(jiǎn)單C3酯(丙?；惗』?、異戊?；?、戊?；?的安絲菌素高度有效并且其效力比含N-甲基丙氨酸的酯美登素更高(參見圖2和圖3)。例如，經(jīng)報(bào)道，攜帶C3丙?；サ陌步z菌素抵抗KB細(xì)胞的效力比美登素低約34.4倍(Kupchan等人J.Med.Chem.21:31-37,1978)。然而，在本文，已發(fā)現(xiàn)攜帶C3丙?；サ南嗤陌步z菌素抵抗KB細(xì)胞系的效力比美登素高1.3倍。用另一細(xì)胞系SK-Br-3觀察到類似 的結(jié)果，表明安絲菌素相比于美登素具有更高的效力(參見圖3)。因此，使用細(xì)胞結(jié)合劑，安絲菌素具有足夠的靶向遞送的效力。

因此，本發(fā)明描述了攜帶可用于與細(xì)胞結(jié)合劑連接的官能團(tuán)的新型安絲菌素衍生物。

在第一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其包含以化學(xué)方式連接到由下式(I)表示的衍生化美登醇或美登醇類似物殘基的細(xì)胞結(jié)合劑：

MayO-A-

(I)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO是由MayOH表示的美登醇或美登醇類似物的殘基；A是選自C＝O、C(＝O)NR’和C(＝O)O的任選基團(tuán)，R’選自H、被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、以及被取代或未被取代的芳基，

前提條件是所述偶聯(lián)物不包含直接連接到MayO-的由下式表示的N-甲基丙氨酸或N-甲基半胱氨酸半族：

在第二實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其包含由下式(II)表示的衍生化美登醇或美登醇類似物殘基：

MayO-A-Y-

(II)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中MayO與A如式(I)中 所述并且Y是選自被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)、被取代或未被取代的芳基烷基、被取代或未被取代的雜環(huán)基烷基基團(tuán)、氮丙啶基團(tuán)和環(huán)氧基團(tuán)的任選基團(tuán)，其中烷基、烯基、炔基、芳基烷基、雜環(huán)基烷基基團(tuán)中的每一個(gè)任選地被一個(gè)或多個(gè)選自以下的基團(tuán)間斷：聚乙二醇單元(OCH₂CH₂)_n、氮丙啶基團(tuán)、環(huán)氧基團(tuán)、氨基基團(tuán)、酰氨基基團(tuán)、酯基團(tuán)、芳基基團(tuán)和雜環(huán)基團(tuán)、氨基酸以及肽，其中：n為1至200的整數(shù)；

在第三實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由式(III)表示的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物：

(MayO-A-Y-L’)_m-CB

(III)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO、A和Y如在第一和第二實(shí)施方案中所述，L’是連接子；m為1至20的整數(shù)，并且CB表示細(xì)胞結(jié)合劑。

在第四實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由式(IV)表示的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物：

MayO-A-Y-L’-CB

(IV)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO、A、L’和CB如在第一實(shí)施方案和第二實(shí)施方案中所述；Y是任選基團(tuán)并且選自被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)、每個(gè)基團(tuán)攜帶任選的聚乙二醇單元(OCH₂CH₂)_n，其中：n為1至200的整數(shù)，以及肽。

在第五實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由式(V)表示的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物：

(MayO-A-Y-M’-BFCG)_m-CB

(V)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO、A、Y、m和CB如在第一、第二、第三、第四實(shí)施方案中定義；BFCG不存在或包含兩個(gè)連接基團(tuán)的雙官能交聯(lián)劑的殘基，其中連接基團(tuán)之一已與M’反應(yīng)并且另一個(gè)連接基團(tuán)已與所述細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)；M’是連接基團(tuán)的殘基，所述連接基團(tuán)與BFCG的經(jīng)反應(yīng)的連接基團(tuán)之一一起形成硫醚、二硫化物、硫酯、酰胺、亞胺、-O-亞胺或腙半族；以及BFCG通過硫醚、二硫化物、硫酯、酰胺、亞胺、-O-亞胺或腙半族連接到CB。

在第六實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含衍生化美登醇或美登醇類似物殘基和連接基團(tuán)的化合物，所述連接基團(tuán)可與細(xì)胞結(jié)合劑或雙官能交聯(lián)劑形成化學(xué)鍵，其中所述衍生化美登醇或美登醇類似物殘基由式(VI)表示：

MayO-A-

(VI)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO是由MayOH表示的美登醇或美登醇類似物的殘基；A是選自C＝O、C(＝O)NR’和C(＝O)O的任選基團(tuán)；以及R’選自H、被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、以及被取代或未被取代的芳基；前提條件是所述化合物不包含直接連接到MayO-的由下式表示的N-甲基丙氨酸或N-甲基半胱氨酸半族：

在第七實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含衍生化美登醇或美登醇類似物殘基的化合物，其中所述衍生化美登醇或美登醇類似物由下式(VII)表示：

MayO-A-Y-

(VII)；

其中：MayO與A如在第六實(shí)施方案中所述；以及Y是選自被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)、被取代或未被取代的芳基烷基、被取代或未被取代的雜環(huán)基烷基基團(tuán)、氮丙啶基團(tuán)和環(huán)氧基團(tuán)的任選基團(tuán)，其中烷基、烯基、炔基、芳基烷基和雜環(huán)基烷基基團(tuán)中的每一個(gè)任選地被一個(gè)或多個(gè)選自以下的基團(tuán)間斷：聚乙二醇單元(OCH₂CH₂)_n、氮丙啶基團(tuán)、環(huán)氧基團(tuán)、氨基基團(tuán)、酰氨基基團(tuán)、酯基團(tuán)、芳基基團(tuán)和雜環(huán)基團(tuán)氨基酸和肽，其中：n為1至200的整數(shù)。

在第八實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(VIII)的化合物：

MayO-A-Y-L

(VIII)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO、A和Y如在第六和第七實(shí)施方案中所定義；以及L是可與細(xì)胞結(jié)合劑或雙官能交聯(lián)劑形成化學(xué)鍵的連接基團(tuán)。

在第九實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由式(IX)表示的化合物：

MayO-A-Y-L

(IX)；

或所述化合物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO、A和L如在第六、第七和第八實(shí)施方案中所定義；以及Y是選自被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)的任選基團(tuán)，每一個(gè)攜帶任選的聚乙二醇單元(OCH₂CH₂)_n，其中n為1至200的整數(shù)，以及肽；并且L是可經(jīng)由二硫鍵、硫醚鍵、肽鍵、酰胺鍵、酯鍵或腙鍵與細(xì)胞結(jié)合劑形成化學(xué)鍵的官能團(tuán)，前提條件是當(dāng)A是C＝O時(shí)，Y與A一起不是N-甲基丙氨酸或N-甲基半胱氨酸半族。

在第十實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及化合物，其包含連接到由式(X)表示的衍生化美登醇或美登醇類似物殘基的雙官能交聯(lián)劑：

MayO-A-

(X)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO是由MayOH表示的美登醇或美登醇類似物的殘基；A是選自C＝O、C(＝O)NR’和C(＝O)O的任選基團(tuán)；R’選自H、被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、以及被取代或未被取代的芳基；前提條件是所述化合物不包含直接連接到MayO-的由下式表示的N-甲基丙氨酸或N-甲基半胱氨酸半族：

在第十一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及化合物，其包含連接到由式(XI)表示的衍生化美登醇或美登醇類似物殘基的雙官能交聯(lián)劑：

MayO-A-Y-

(XI)；

其中：MayO和A如在第十實(shí)施方案中所定義；以及Y是選自被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)、被取代或未被取代的芳基烷基、被取代或未被取代的雜環(huán)基烷基基團(tuán)、氮丙啶基團(tuán)和環(huán)氧基團(tuán)的任選基團(tuán)，其中烷基、烯基、炔基、芳基烷基和雜環(huán)基烷基基團(tuán)中的每一個(gè)任選地被一個(gè)或多個(gè)選自以下的基團(tuán)間斷：聚乙二醇單元(OCH₂CH₂)_n、氮丙啶基團(tuán)、環(huán)氧基團(tuán)、氨基基團(tuán)、酰氨基基團(tuán)、酯基團(tuán)、芳基基團(tuán)和雜環(huán)基團(tuán)、氨基酸以及肽，其中：n為1至200的整數(shù)。

在第十二實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及化合物，其包含連接到衍生化美登醇或美登醇類似物殘基的雙官能交聯(lián)劑，其中所述化合物由式(XII)表示：

MayO-A-Y-M’-BFCG’-Z’

(XII)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：MayO、A和Y如在第十和第十一實(shí)施方案中所定義；以及BFCG’-Z’是包含兩個(gè)連接基團(tuán)的雙官能交聯(lián)劑的殘基，其中所述連接基團(tuán)中的一個(gè)由Z’表示并且另一個(gè)連接基團(tuán)已與M’反應(yīng)；；Z’是可經(jīng)由硫醚、二硫化物、硫酯、酰胺、硫酯、亞胺、-O-亞胺-或腙半族連接到細(xì)胞結(jié)合劑的連接基團(tuán)；M’是連接基團(tuán)的殘基，所述連接基團(tuán)與BFCG’的經(jīng)反應(yīng)的基團(tuán)之一一起形成硫醚、二硫化物、硫酯、酰胺、亞胺、-O-亞胺或腙半族。

在第十三實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)的異常細(xì)胞生長(zhǎng)或治療增殖性病癥、自身免疫性病癥、破壞性骨病癥、感染性疾病、病毒性疾病、纖維化疾病、神經(jīng)變性病癥、胰腺炎或腎疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的式I-V的偶聯(lián)物 和任選的化療劑。

在第十四實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式I-V的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物及其藥學(xué)上可接受的載體、添加劑或稀釋劑的藥物組合物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1示出美登醇和先前所述的美登木素的結(jié)構(gòu)。在Y’中，l、m、n、o、p、q、r、s、t和u各自獨(dú)立地是0或1至5的整數(shù)，前提條件是l、m、n、o、p、q、r、s、t和u中的至少兩個(gè)在任何時(shí)間均不為零；并且Z是H、SR或-COR，其中R是具有1至10個(gè)碳原子的直鏈烷基或烯基、具有3至10個(gè)碳原子的支鏈或環(huán)狀烷基或烯基、未被取代或被取代的芳基基團(tuán)或被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)。在可連接的美登木素中，Z和Z₁具有與Y’的Z相同的定義。示出可連接的美登木素。

圖2示出安絲菌素和美登素的結(jié)構(gòu)。

圖3示出與具有不同酯基團(tuán)的安絲菌素相比，美登素對(duì)A)KB細(xì)胞和B)SK-Br-3細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。示出安絲菌素和美登素的體外效力。

圖4示出側(cè)鏈的合成。

圖5示出含二硫化物和硫醇的安絲菌素衍生物的合成。

圖6示出攜帶芳族或雜環(huán)側(cè)鏈的含硫醇的安絲菌素衍生物的合成。

圖7示出含二硫化物與硫醇的聚乙二醇化安絲菌素衍生物的合成。圖7A示出含硫醇的聚乙二醇化安絲菌素衍生物的合成。圖7B示出硫醇反應(yīng)性的聚乙二醇化安絲菌素衍生物的合成。

圖8示出攜帶肽酶不穩(wěn)定性連接子的安絲菌素衍生物的合成。

圖9示出攜帶羰基基團(tuán)的安絲菌素衍生物的合成。

圖10示出攜帶氨基基團(tuán)的安絲菌素衍生物的合成。圖10A示出攜帶氨基集團(tuán)的安絲菌素衍生物的合成。圖10B攜帶二甲基氨基基團(tuán) 的安絲菌素衍生物的合成。

圖11示出攜帶N-羥基琥珀酰亞胺基酯基團(tuán)的安絲菌素衍生物的合成。

圖12示出攜帶醚基團(tuán)、氨基甲酸酯基團(tuán)或碳酸酯基團(tuán)的安絲菌素衍生物的合成。圖12A示出攜帶醚基團(tuán)的安絲菌素衍生物的合成。圖12B示出攜帶氨基甲酸酯或羰酸酯基團(tuán)的安絲菌素衍生物的合成。

圖13示出含硫醇的安絲菌素的合成。圖13A-13C示出含硫醇的安絲菌素的合成。

圖14示出用本發(fā)明化合物制備的二硫化物-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖15示出用本發(fā)明化合物制備的硫代琥珀酰亞胺基-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖16示出用本發(fā)明化合物制備的硫代乙酰氨基-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖17示出用本發(fā)明化合物制備的肽酶不穩(wěn)定性偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖18示出用本發(fā)明化合物制備的肽酶不穩(wěn)定性硫代琥珀酰亞胺基-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖19示出用本發(fā)明化合物制備的肽酶不穩(wěn)定性硫代乙酰氨基-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖20示出用本發(fā)明化合物制備的酰胺-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖21示出用本發(fā)明化合物制備的腙-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖22示出用本發(fā)明化合物制備的腙-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖23示出用本發(fā)明化合物制備的腙-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖24示出用本發(fā)明化合物制備的酰胺-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖25示出用本發(fā)明化合物制備的二硫化物-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖26示出用本發(fā)明化合物制備的硫醚-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖27示出本發(fā)明化合物制備的酰胺-連接的偶聯(lián)物的偶聯(lián)過程。

圖28示出所制備的安絲菌素衍生物抵抗KB細(xì)胞系的體外活性(96小時(shí)暴露)。

圖29示出所制備的安絲菌素衍生物抵抗COLO 205細(xì)胞系的體外活性(96小時(shí)暴露)。

圖30示出所制備的安絲菌素衍生物抵抗COLO 205-MDR細(xì)胞系的體外活性(96小時(shí)暴露)。

圖31示出用可連接的安絲菌素衍生物和攜帶硫醇的美登木素DM1制備的偶聯(lián)物抵抗COLO 205細(xì)胞的體外活性。

發(fā)明詳述

本發(fā)明公開了攜帶允許與細(xì)胞結(jié)合劑連接的官能團(tuán)的新型安絲菌素衍生物。此外，本發(fā)明公開了這些新型安絲菌素衍生物與細(xì)胞結(jié)合劑的偶聯(lián)物的制備。

本發(fā)明的另一方面是包含有效量的任何上述的安絲菌素衍生物-細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

上述的包含安絲菌素衍生物的藥物組合物可進(jìn)一步包含抗體。

本發(fā)明的進(jìn)一步方面是一種誘導(dǎo)所選細(xì)胞群體中的細(xì)胞死亡的方法，其包括將靶細(xì)胞或含有靶細(xì)胞的組織與有效量的任何上述的安絲菌素衍生物-細(xì)胞結(jié)合劑、其鹽或溶劑化物接觸。

本領(lǐng)域揭示了在不降低現(xiàn)有藥物細(xì)胞毒性潛力的情況下極難對(duì)其進(jìn)行修飾。公開的本發(fā)明克服了該問題，通過教導(dǎo)合成攜帶官能團(tuán)的新型安絲菌素衍生物的方法。公開的新型安絲菌素衍生物保留并且在一些情況下甚至增強(qiáng)前述的安絲菌素的細(xì)胞毒性效力。

安絲菌素衍生物-細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物允許待以靶向方法應(yīng)用的安絲菌素衍生物僅對(duì)不需要的細(xì)胞發(fā)揮充分的細(xì)胞毒性作用，由此避免由于對(duì)非靶向健康細(xì)胞的損傷而引起的副作用。因此，本發(fā)明提供了有用試劑，以及用于制備該試劑的新型方法、用于消除待殺死或溶解的患病或異常細(xì)胞而同時(shí)展現(xiàn)最小程度的副作用的新方法，所述細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞(特別是實(shí)體腫瘤細(xì)胞)、病毒感染細(xì)胞、微生物感染細(xì)胞、寄生蟲感染細(xì)胞、自身免疫細(xì)胞(生成自身抗體的細(xì)胞)、活化細(xì)胞(涉及移植物排斥或移植物宿主病的那些)、或任何其他類型的患病或異常細(xì)胞。

可用于本發(fā)明來生成能夠與細(xì)胞結(jié)合劑連接的安絲菌素衍生物的安絲菌素前體在本領(lǐng)域是眾所周知的并且可根據(jù)已知方法從天然來源分離或者根據(jù)已知方法(參見美國(guó)專利No.6,790,954；7,192,750；7,432,088)合成制備。

適合的安絲菌素前體的實(shí)例包括美登醇和美登醇類似物。適合的美登醇類似物的實(shí)例包括具有經(jīng)修飾芳族環(huán)的那些以及在其他位置具有修飾的那些。

適合的具有經(jīng)修飾芳族環(huán)的美登醇類似物的具體實(shí)例包括：

(1)C-19-脫氯(美國(guó)專利No.4,256,746)(通過對(duì)安絲菌素P2進(jìn)行LAH還原而制備)；

(2)C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國(guó)專利No.4,361,650和4,307,016)(通過使用鏈霉菌屬(Streptomyces)或放線菌屬(Actinomyces)進(jìn)行脫甲基或使用LAH進(jìn)行脫氯而制備)；以及

(3)C-20-脫甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-C-19-脫氯(美國(guó)專利No.4,294,757)(通過使用酰氯進(jìn)行酰氯而制備)。

適合的具有其他位置的修飾的美登醇類似物的具體實(shí)例包括：

(1)C9-SH(美國(guó)專利No.4,424,219)(通過美登醇與H₂S或P₂S₅的反應(yīng)而制備)；

(2)C14-烷氧基甲基(脫甲氧基/CH₂OR)(美國(guó)專利No.4,331,598)；

(3)C14-羥基甲基或酰氧基甲基(CH₂OH或CH₂OAc)(美國(guó)專利No.4,450,254)(由諾卡氏菌屬(Nocardia)制備)；

(4)C15-羥基/酰氧基(美國(guó)專利No.4,364,866)(通過用鏈霉菌屬轉(zhuǎn)化美登醇而制備)；

(5)C15-甲氧基(美國(guó)專利No.4,313,946和4,315,929)(由滑桃樹(Trewia nudiflora)分離)；

(6)C18-N-脫甲基(美國(guó)專利No.4,362,663和4,322,348)(通過用鏈霉菌屬對(duì)美登醇進(jìn)行脫甲基而制備)；以及

(7)4,5-脫氧(美國(guó)專利No.4,371,533)(對(duì)美登醇進(jìn)行三氯化鈦/LAH還原而制備)。

美登醇上的很多位置可用作化學(xué)連接連接半族的位置。例如，具有羥基基團(tuán)的C-3位置、用羥基甲基修飾的C-14位置、用羥基修飾的C-15位置和具有羥基基團(tuán)的C-20位置均是有用的。然而，優(yōu)選C-3和C-20位置并且尤其優(yōu)選美登醇的C-3位置。

下面根據(jù)C-3位置的一些示例性連接半族描述具有連接半族的美登醇的酯的合成，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，具有如上所述的其他化學(xué)鍵的連接半族也可用于本發(fā)明，就像如上所述的其他安絲菌素和其他連接位置一樣。

在本文所述的結(jié)構(gòu)式中(例如，在第一實(shí)施方案至第十二實(shí)施方案的式I-XII中)，下面提供了變量的替代值。

在第一(1)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式II-V、VII-IX、XI和XII中的Y是任選基團(tuán)，其選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、鹵代C_1-6烷基、在兩個(gè)相鄰碳原子上具有鹵素和羥基基團(tuán)的C_1-6烷基、

-C_2-6烯基-Ar-、-Ar-C_2-6烯基-、-C_2-6炔基-Ar-、-Ar-C_2-6炔基-、在C_1-6烷基的兩個(gè)相鄰碳原子上具有鹵素和羥基基團(tuán)的-C_1-6烷基-Ar-以及在兩個(gè)相鄰碳原子上具有鹵素和羥基基團(tuán)的-Ar-C_1-6烷基，其中Ar是任選被取代的芳基或任選被取代的雜環(huán)基并且由Y表示的基團(tuán)中的烯基、炔基、烷基是任選被取代的。

在第二(2)備選實(shí)施方案中，第一備選實(shí)施方案中的Ar是任選地被以下取代的苯基基團(tuán)：C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羥基C_1-4烷基、鹵代C_1-4烷基、-OH、-OC(＝O)-C_1-4烷基、-OC(＝O)-C_1-4烷基-NR^aR^b、-C_1-4烷基-COOH、-NR^aR^b、-C_1-4烷基NR^aR^b、-NO₂和鹵素，其中R^a和R^b各自獨(dú)立地是H、C_1-4烷基或氨基保護(hù)基團(tuán)或R^a和R^b與氮原子一起形成具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的雜環(huán)。

在第三(3)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式II-V、VII-IX、XI和XII中的 -A-Y-由下式之一表示：

以及 其中n和n’各自獨(dú)立地是0、1、2或3；n”是1、2或3并且對(duì)于每個(gè)出現(xiàn)的R^c是H、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、羥基C_1-4烷基、鹵代C_1-4烷基、-OH、-OC(＝O)-C_1-4烷基、-OC(＝O)-C_1-4烷基-NR^aR^b、-C_1-4烷基-COOH、-NO₂和鹵素，其中R^a和R^b各自獨(dú)立地是H、C_1-4烷基、氨基C_1-4烷基或氨基保護(hù)基團(tuán)或R^a和R^b與氮原子一起形成具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的雜環(huán)。

在第四(4)備選實(shí)施方案中，在第二和第三備選實(shí)施方案中的R^a和R^b與氮原子一起形成任選被取代的哌嗪基、任選被取代的保護(hù)的哌嗪基或任選被取代的4-哌啶子基哌啶基(例如，)。

在第五(5)備選實(shí)施方案中，n”是1或2并且在備選實(shí)施方案2-4中R^c是H、甲基、乙基、鹵素、-CF₃、-NO₂、-OMe、-CO₂Me、-OH、-CH₂OH、-CH₂OC(O)CH₂NH₂、-CH₂OC(O)(C(CH₃)₂)CH₂NH₂、-CH₂NH₂、-CH₂N(CH₃)₂、-CH₂COOH和-CH₂-哌嗪基。

在第六(6)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式II-V、VII-IX、XI和XII中的Y由式(IA)表示：

-[Ar’]_j-(C_1-10烷基)-

(IA)；

其中：Ar’是任選被取代的芳基、任選被取代的雜環(huán)基、任選被 取代的C_1-4烷基芳基、或任選被取代的C_1-4烷基雜環(huán)基；以及j為0或1。

在第七(7)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式II-V、VII-IX、XI和XII中的Y由式(IIA)表示：

-[Ar”]_0-1-(CR¹R²)_x-B-W-D-(CR¹R²)_w-

(IIA)；

其中：Ar”是苯基、-CH₂-苯基、雜環(huán)基、或-CH₂-雜環(huán)基，任選地被一個(gè)至四個(gè)選自以下的基團(tuán)取代：烷基、烷氧基、鹵代、鹵代烷基、烷氧基-鹵代烷基、腈和硝基；每個(gè)R¹和R²獨(dú)立地是氫或C_1-4烷基；B是NR”、O或不存在；W是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽、(OCH₂CH₂)_n或不存在；D是CO、NR”或不存在；R”選自H、被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、以及被取代或未被取代的芳基；x為1至10的整數(shù)；w為0或1至10的整數(shù)；以及n為1至200的整數(shù)。

在第八(8)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式IIA中的R”是H或C_1-4烷基。

在第九(9)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式II-V、VII-IX、XI和XII和備選實(shí)施方案1-8中的Y為-(CR¹R²)_x-、x是1至6的整數(shù)。

在第十(10)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式II-XII和備選實(shí)施方案1-9中的每個(gè)R¹和R²獨(dú)立地是氫或甲基。

在第十一(11)備選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式II-V、VII-IX、XI和XII中的Y由下式之一表示：

在第十二(12)備選實(shí)施方案中，式I-XII和備選實(shí)施方案1-11中的R’是H或C_1-4烷基。

在第十三(13)備選實(shí)施方案中，式I-XII和備選實(shí)施方案1-12中的MayO由下式表示：

其中：X’₄＝X’₅或OX’₅，以及X’、X’₁、X’₂、X’₃和X’₅相同或不同并且選自R、C(＝O)R、C(＝O)NR₂或C(＝O)OR，其中：每個(gè)R獨(dú)立地選自H、被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、以及被取代或未被取代的芳基；Q選自O(shè)或S；前提條件是X’、X’₁、X’₂、X’₃、X’₅中的至少一個(gè)表示MayO與A或AY之間的共價(jià)鍵。

在第十四(14)備選實(shí)施方案中，在第十三備選實(shí)施方案中的R獨(dú)立地是H或C_1-4烷基。

在第十五(15)備選實(shí)施方案中，式I-XII和備選實(shí)施方案1-14中的MayO由下式表示：

在第十六(16)備選實(shí)施方案中，式V中的BFCG包含連接到M’的半族M”和連接到CB的半族Z，其中M”和Z各自獨(dú)立地是選自由以下組成的組：-C(＝O)-、-C(＝O)-NR^e-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝NH)-、-C(＝NH)-NR^e-、-S-、-NR^e-、-NH-NR^e-、-C(＝NR^e)-、＝NNR^e-、-CH₂-C(＝O)-和-CH₂-C(＝O)-NR^e-，其中R^e是H、烷基、烯基或炔基并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所述。

在第十七(17)備選實(shí)施方案中，在第十六備選實(shí)施方案中的M”和Z各自獨(dú)立地是選自由以下組成的組：-C(＝O)-、-S-、-CH₂-C(＝O)-、-CH₂-C(＝O)-NH-和-O-C(＝O)-并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所述。

在第十八(18)備選實(shí)施方案中，在第十六備選實(shí)施方案中的M’-M”由選自以下的結(jié)構(gòu)式表示：

并且剩余變量如在備選實(shí)施方案1-17中所述。

在第十九(19)備選實(shí)施方案中，式V中的-BFCG-由式(IIIA)表示：

-M”-(CR³R⁴)_y-[Cy]_0或1-C(O)-

(IIIA)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中：M”是每個(gè)R³和R⁴獨(dú)立地是氫、甲基或-SO₃^-M⁺，其中：M⁺是H⁺或藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子；Cy是任選地被一個(gè)至四個(gè)選自以下的基團(tuán)取代的環(huán)烷基或苯基：烷基、烷氧基、鹵代、鹵代烷基、烷氧基鹵代烷基、腈和硝基；以及y為0或1至10的整數(shù)并且剩余變量如在備選實(shí)施方案1-18中所述。

在第二十(20)備選實(shí)施方案中，式V中的BFCG是 以及M’是-S-并且剩余變量如在備選實(shí)施方案1-19中所述，以及剩余變量如在備選實(shí)施方案1-19中所述。

在第二十一(21)備選實(shí)施方案中，式V中的BFCG是：

并且剩余變量如在備選實(shí)施方案1-20中所述。

在第二十二(22)備選實(shí)施方案中，式V的-BFCG-由式(IVA)表示：

-S-(CR³R⁴)_y’-C(O)-

(IVA)；

其中：每個(gè)R³和R⁴獨(dú)立地是氫、甲基或-SO₃^-M⁺，其中：M⁺是H⁺或藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子，y’為1至10的整數(shù)并且剩余變量如在備選實(shí)施方案1-18中所述。

在第二十三(23)備選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中BFCG包含自降解性半族的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-22中所述。

在第二十四(24)備選實(shí)施方案中，式V中的BFCG由下式表示：

其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽、R¹⁰⁰是H或烷基并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-18中所述。可選地，式V中的BFCG由下式表示：

其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽，其中具有本文所述的連接半族Z(例如、-NH-、-C(＝O)-)的氨基酸側(cè)鏈中的一個(gè)共價(jià)連接到細(xì)胞結(jié)合劑并且R¹⁰⁰是H或烷基。在另一備選中，式V中的BFCG是-AA-(C＝O)_0-1-C_0-6烷基-Z-，其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基 酸的肽并且Z是連接基團(tuán)；或式V中的BFCG是其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽，其中具有本文所述的連接半族Z(例如、-NH-、-C(＝O)-)的氨基酸側(cè)鏈中的一個(gè)共價(jià)連接到細(xì)胞結(jié)合劑。

在第二十五備選(25)實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案24中的AA選自由以下組成的組：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N⁹-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N⁹-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:1)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:2)和Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:3)、Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:4),Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg和D-Arg-D-Arg并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-18中所述。

在第二十六(26)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案24-25中的AA是Gly-Gly-Gly、Val-Cit、Phe-Lys或Val-Lys并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-18中所述。

在第二十七(27)備選實(shí)施方案中，式V中的BFCG選自：

其中：AA是Val-Cit、Phe-Lys或Val-Lys，q為1至5的整數(shù)；n為1至20的整數(shù)；以及M是H⁺或藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-18中所述。

在第二十八(28)備選實(shí)施方案中，式III-V中的細(xì)胞結(jié)合劑結(jié)合選自以下的靶細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、微生物感染細(xì)胞、寄生蟲感染細(xì)胞、自身免疫細(xì)胞、活化細(xì)胞、髓系細(xì)胞、活化T-細(xì)胞、B細(xì)胞或黑素細(xì)胞；表達(dá)CD4、CD6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、EpCAM、CanAg、CALLA、STEAP、TENB2、MUC16、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5、c-MET、5T4或Her-2抗原的細(xì)胞；Her-3抗原或表達(dá)胰島素生長(zhǎng)因子受體、表皮生長(zhǎng)因子受體和葉酸受體的細(xì)胞并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-27中所述。

在第二十九(29)備選實(shí)施方案中，式III-V的細(xì)胞結(jié)合劑是抗體、單鏈抗體、特異性結(jié)合靶細(xì)胞的抗體片段、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、或特異性結(jié)合靶細(xì)胞的單克隆抗體片段、嵌合抗體、特異性結(jié)合靶細(xì)胞的嵌合抗體片段、結(jié)構(gòu)域抗體、特異性結(jié)合靶細(xì)胞的結(jié)構(gòu)域抗體片段、雙鏈抗體、納米抗體、前抗體(probody)、達(dá)爾潘(Darpin)、淋巴因子、激素、維生素、生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、或營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)分子并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-27中所述。

I在第三十(30)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案29中的抗體是表 面重塑的抗體、表面重塑的單鏈抗體、或表面重塑的抗體片段并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-27中所述。

在第三十一(31)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案29中的抗體是單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、或其單克隆抗體片段并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-27中所述。

在第三十二(32)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案29中的抗體是人源化抗體、人源化單鏈抗體、或人源化抗體片段并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-27中所述。

在第三十三(33)備選實(shí)施方案中，式I-V的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物及示例性實(shí)施方案1-32與藥學(xué)上可接受的載體一起被配制成藥物組合物。

在第三十四(34)備選實(shí)施方案中，化合物式VI-IX由結(jié)構(gòu)式2-5表示：

其中，R’選自H、被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、 烯基或炔基以及被取代或未被取代的芳基；Y是選自被取代或未被取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)的任選基團(tuán)，每一個(gè)攜帶任選的聚乙二醇單元(OCH₂CH₂)_n，其中n為1至200的整數(shù)，以及肽；L是經(jīng)由二硫鍵、硫醚鍵、肽鍵、酰胺鍵、酯鍵或腙鍵形成與細(xì)胞結(jié)合劑的連接的官能團(tuán)，或安絲菌素衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第三十五(35)備選實(shí)施方案中，式VIII-IX和備選實(shí)施方案34中的L由選自以下的結(jié)構(gòu)式表示：順丁烯二酰亞胺、鹵代乙酰氨基、-SH、-SSR^d、-CH₂SH、-CH(Me)SH、-C(Me)₂SH、-NHR^f、-CH₂NHR^f、-NR^fNH₂、-COOH和-COE，其中COE表示活性酯，R^d是任選被取代的苯基或任選被取代的吡啶基以及R^f是H或烷基并且其余變量如備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第三十六(36)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案35中的由-COE表示的活性酯選自N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯、硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如，2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如，4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯、和五氟苯基酯、和R^d選自苯基、硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4-硝基苯基)、二硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4-硝基苯基)、羧基硝基苯基(例如，3-羧基-4-硝基苯基)、吡啶基或硝基吡啶基(例如，4-硝基吡啶基)并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第三十七(37)備選實(shí)施方案中，式VI-IX化合物和示例性實(shí)施方案34-36由化合物6至26或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物中的任一種表示：

其中x是1至6的整數(shù)；以及R^f是H或烷基。

在八十五(38)備選實(shí)施方案中，式XII中的BFCG’包含連接到M’的連接基團(tuán)M”，其中M”獨(dú)立地選自由以下組成的組：-C(＝O)-、-C(＝O)-NR^e-、-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝NH)-、-C(＝NH)-NR^e-、-S-、-NR^e-、-NH-NR^e-、-C(＝NR^e)-、＝NNR^e-、-CH₂-C(＝O)-和-CH₂-C(＝O)-NR^e-，其中R^e是H、烷基、烯基或炔基并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第三十九(39)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案38中的M”選自由以下組成的組：-C(＝O)-、-S-、-CH₂-C(＝O)-、-CH₂-C(＝O)-NH-和-O-C(＝O)-并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十(40)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案38中的M’-M”由選自如下的結(jié)構(gòu)式表示：

并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十一(41)備選實(shí)施方案中，式XII中的BFCG’由式(IIIC)表示：

-M”-(CR³R⁴)_y-[Cy]_0或1-

(IIIC)；

或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中M”是每個(gè)R³和R⁴獨(dú)立地是氫、甲基或-SO₃^-M⁺，其中M⁺是H⁺或藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子；Cy是任選地被一個(gè)至四個(gè)選自以下的基團(tuán)取代的環(huán)烷基或苯基：烷基、烷氧基、鹵代、鹵代烷基、烷氧基鹵代烷基、腈和硝基；以及y為0或1至10的整數(shù)并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十二(42)備選實(shí)施方案中，式XII和備選實(shí)施方案38-41中的BFCG’是以及M’是-S-并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十三(43)備選實(shí)施方案中，式XIII和備選實(shí)施方案38-42中的BFCG’是并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中定義。

在第四十四(44)備選實(shí)施方案中，式XII中的-BFCG’-由式(IVC)表示：

-S”-(CR³R⁴)_y

(IVC)；

其中：每個(gè)R³和R⁴獨(dú)立地是氫、甲基或-SO₃^-M⁺，其中：M⁺是H⁺或藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子，y’為1至10的整數(shù)并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十五(45)備選實(shí)施方案中，式XII中的BFCG’包含自降解性半族并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十六(46)備選實(shí)施方案中，式XII中的BFCG’由下式表示：

其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽，R¹⁰⁰是H或烷基，并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。可選地，式XII中的BFCG’-Z’由下式表示：

其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽，其中具有上文所述的連接基團(tuán)Z’(例如、-NH₂、-COOH或-COE)的氨基酸側(cè)鏈中的一個(gè)可共價(jià)連接到細(xì)胞結(jié)合劑并且R¹⁰⁰是H或烷基。在另一備選實(shí)施方案中，式V中的BFCG’是-AA-(C＝O)_0-1-C_0-6烷基-，其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽；或式V中的BFCG’-Z’是 其中AA是氨基酸或包含2至8個(gè)氨基酸的肽，其中具有上文所述的連接基團(tuán)Z’(例如、-NH₂或-COE)的氨基酸側(cè)鏈中的一個(gè)可共價(jià)連接到細(xì)胞結(jié)合劑。

在第四十七(47)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案46中的AA選自由以下組成的組：Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N⁹-甲苯磺?；?Arg、Phe-N⁹-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:1)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:2)和Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:3)、Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:4)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、 Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg和D-Arg-D-Arg并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十八(48)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案46-47中的AA是Gly-Gly-Gly、Val-Cit、Phe-Lys或Val-Lys并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第四十九(49)備選實(shí)施方案中，式XII中的BFCG’選自：

其中：AA是Val-Cit、Phe-Lys或Val-Lys，q為1至5的整數(shù)；n為1至20的整數(shù)；以及M是H⁺或藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-15中所定義。

在第五十(50)備選實(shí)施方案中，式XII中的Z’選自由以下組成的組：順丁烯二酰亞胺、鹵代乙酰氨基、-SH、-SSR^d、-CH₂SH、-CH(Me)SH、-C(Me)₂SH、-NHR^c、-CH₂NHR^c、-NR^cNH₂、-COOH和-COE，其中COE表示活性酯，R^d是任選被取代的苯基或任選被取代的吡啶基以及R^f是H或烷基，并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-49中所定義。

在第五十一(51)備選實(shí)施方案中，備選實(shí)施方案50中的COE選自N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯、硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如，2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基(例如，4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯、和五氟苯基酯、和R^d選自苯基、硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4-硝基苯基)、二硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4-硝基苯基)、羧基硝基苯基(例如，3-羧基-4-硝基苯基)、吡啶基或硝基吡啶基(例如，4-硝基吡啶基)并且其余變量如在備選實(shí)施方案1-49中所定義。

在第五十二(52)備選實(shí)施方案中，向所述哺乳動(dòng)物相繼或連續(xù)施用第十三實(shí)施方案的化療劑。

在第五十三(53)備選實(shí)施方案中，第十三實(shí)施方案和備選實(shí)施方案52的方法是用于治療選自以下的病狀：癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 多發(fā)性硬化、移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥、狼瘡、肌炎、感染和免疫缺陷。

在第五十四(54)備選實(shí)施方案中，第十三實(shí)施方案和備選實(shí)施方案52的方法是用于治療癌癥。

在第五十五(55)備選實(shí)施方案中，第十三實(shí)施方案和備選實(shí)施方案52與54的方法是治療癌癥的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、結(jié)腸癌、腦癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌、頭頸癌、黑素瘤、結(jié)直腸癌、胃癌、鱗癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、Merkel細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及淋巴器官癌。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，式V中的MayO-A-Y-M’-BFCG由下式表示：

其中R^f是H或烷基；Q是-O-或-NR¹⁰⁰；R¹⁰⁰是H或烷基；以及R₁和R₂各自獨(dú)立地是氨基酸側(cè)鏈。

如本文所用的，“雙官能交聯(lián)劑”是指具有兩個(gè)活性基團(tuán)的試劑；所述活性基團(tuán)中的一個(gè)能夠與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)，而另一個(gè)活性基團(tuán)能 夠與細(xì)胞毒性劑反應(yīng)以連接細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑(例如，式(VI)-(IX)的化合物)，由此形成偶聯(lián)物。

任何適合的雙官能交聯(lián)劑可結(jié)合本發(fā)明使用，只要該連接子試劑分別提供細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞結(jié)合劑的治療性例如細(xì)胞毒性以及靶向特性的保留，而無異常毒性。優(yōu)選地，連接子分子通過化學(xué)鍵(如上所述)聯(lián)結(jié)細(xì)胞毒性劑與細(xì)胞結(jié)合劑，以使細(xì)胞毒性劑與細(xì)胞結(jié)合劑彼此化學(xué)偶聯(lián)(例如，共價(jià)鍵合)?？捎糜谥苽浔景l(fā)明的藥物-連接子化合物的雙官能交聯(lián)劑還包括描述于Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook(其全部教導(dǎo)通過引用并入本文)中的那些。

在一個(gè)實(shí)施方案中，雙官能交聯(lián)劑包含不可切割的連接子。不可切割的連接子是能夠以穩(wěn)定且共價(jià)的方式連接細(xì)胞毒性劑(例如，式(VI)-(IX)的化合物)與細(xì)胞結(jié)合劑的任何化學(xué)半族。因此，在細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞結(jié)合劑保持活性的條件下，不可切割的連接子實(shí)質(zhì)上可抵抗酸誘導(dǎo)的切割、光誘導(dǎo)的切割、肽酶誘導(dǎo)的切割、脂酶誘導(dǎo)的切割和二硫鍵切割。

在細(xì)胞毒性劑與細(xì)胞結(jié)合劑之間形成不可切割的連接子的適合的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑通過硫醚鍵連接到細(xì)胞結(jié)合劑。不可切割的連接子的實(shí)例包括具有與細(xì)胞毒性劑反應(yīng)的基于順丁烯酰二亞胺基的半族的或基于鹵代乙?；陌胱宓倪B接子。此類雙官能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參見美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2010/0129314、2009/0274713、2008/0050310、20050169933、2009/0274713、2010/0129314，以及可由Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box 117,Rockland,IL 61105,USA得到的那些)并且包括但不限于4-(順丁烯酰二亞胺基甲基)環(huán)己烷羧酸N-琥珀酰亞胺基酯(SMCC)、為SMCC“長(zhǎng)鏈”類似物的N-琥珀酰亞胺基-4-(N-順丁烯酰二亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-順丁烯酰二亞胺基十一酸N-琥珀酰亞胺基酯 (KMUA)、γ-順丁烯酰二亞胺基丁酸N-琥珀酰亞胺基酯(GMBS)、ε-順丁烯酰二亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺(EMCS)、間順丁烯酰二亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺(MBS)、N-(α-順丁烯酰二亞胺基乙酰氧基)-琥珀酰亞胺(AMAS)、琥珀酰亞胺基-6-(β-順丁烯酰二亞胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、4-(對(duì)順丁烯酰二亞胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亞胺基酯(SMPB)和N-(對(duì)順丁烯酰二亞胺基苯基)異氰酸酯(PMPI)。包含基于鹵代乙?；陌胱宓慕宦?lián)試劑包括N-琥珀酰亞胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯(SBA)和3-(溴乙酰氨基)丙酸N-琥珀酰亞胺基酯(SBAP)、二-順丁烯酰二亞胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)₂、BM(PEO)₃、N-(β-順丁烯酰二亞胺基丙基氧基)琥珀酰亞胺酯(BMPS)、5-順丁烯酰二亞胺基戊酸NHS、HBVS、4-(4-N-順丁烯酰二亞胺基苯基)-丁酸肼·HCl(MPBH)、琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基磺基nyl)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代二-順丁烯酰二亞胺基乙烷(DTME)、1,4-二-順丁烯酰二亞胺基丁烷(BMB)、1,4-二順丁烯酰二亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、二-順丁烯酰二亞胺基己烷(BMH)、二-順丁烯酰二亞胺基乙烷(BMOE)、4-(N-順丁烯酰二亞胺基-甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺基酯(磺基-SMCC)、磺基琥珀酰亞胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、間順丁烯酰二亞胺基苯甲酰基-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-MBS)、N-(γ-順丁烯酰二亞胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-GMBS)、N-(ε-順丁烯酰二亞胺基己酰氧基)磺基琥珀酰亞胺基酯(磺基-EMCS)、N-(κ-順丁烯酰二亞胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-KMUS)、4-(對(duì)順丁烯酰二亞胺基苯基)丁酸磺基琥珀酰亞胺基酯(磺基-SMPB)、CX1-1、磺基-Mal和PEG_n-Mal。優(yōu)選地，該雙官能交聯(lián)劑是SMCC。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該連接試劑是可切割的連接子。適合的可切割的連接子的實(shí)例包括二硫化物連接子、酸不穩(wěn)定性連接子、光不穩(wěn)定性連接子、肽酶不穩(wěn)定性連接子和脂酶不穩(wěn)定性連接子。含有連接子的二硫化物是通過在生理?xiàng)l件下可發(fā)生的二硫化物交換可切割的連接子。酸不穩(wěn)定性連接子是在酸性pH下可切割的連接子。例如，某些細(xì)胞內(nèi)的小室例如核內(nèi)體和溶酶體具有酸性的pH(pH 4-5)，并且提供了適合切割酸不穩(wěn)定性連接子的條件。光不穩(wěn)定性連接子在體表上和在可接觸光的很多體腔中是有用的。而且，紅外線可深入組織。肽酶不穩(wěn)定性連接子可用于切割在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的某些肽(參見例如，Trouet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:626-629(1982),和Umemoto等人，Int.J.Cancer,43:677-684(1989))。在一個(gè)實(shí)施方案中，可切割的連接子在溫和條件下，即不影響細(xì)胞毒性劑活性的細(xì)胞內(nèi)的條件下是可切割的。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性劑通過二硫鍵連接到細(xì)胞結(jié)合劑。該連接子分子包含可與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)。優(yōu)選的用于與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)是N-琥珀酰亞胺基酯和 N-磺基琥珀酰亞胺基酯。此外，該連接子分子包含可與細(xì)胞毒性劑反應(yīng)以形成二硫鍵的反應(yīng)性化學(xué)基團(tuán)，優(yōu)選二硫代吡啶基基團(tuán)。經(jīng)由二硫鍵實(shí)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑的連接的雙官能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是已知的并且包括例如，3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亞胺基酯(SPDP)(參見，例如，Carlsson等人，Biochem.J.,173:723-737(1978))、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀酰亞胺基酯(SPDB)(參見，例如，美國(guó)專利4,563,304)、4-(2-吡啶基二硫代)戊酸N-琥珀酰亞胺基酯(SPP)(參見例如，CAS登記號(hào)341498-08-6)和N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(參見例如，美國(guó)申請(qǐng)公布No.2009/0274713)。可用于引入二硫化物基團(tuán)的其他雙官能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且描述于美國(guó)專利6,913,748、6,716,821和美國(guó)專利公布2009/0274713和2010/0129314(其所有均通過引用整體并入本文)中。

缺少硫原子的可形成不可切割的連接子的其他交聯(lián)劑也可用于本發(fā)明方法中。此類連接子可衍生自基于二羧酸的半族。適合的基于二羧酸的半族包括但不限于通式(IX)的α,ω-二羧酸。

HOOC-X_l-Y_n-Z_m-COOH

(IX)，

其中X是具有2至20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基、烯基或炔基基團(tuán)，Y是攜帶3至10個(gè)碳原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基基團(tuán)，Z是攜帶6至10個(gè)碳原子的被取代或未被取代的芳族基團(tuán)、或被取代或未被取代的雜環(huán)基團(tuán)，其中雜原子選自N、O或S，并且其中l(wèi)、m和n各自為0或1，前提條件是l、m和n不同時(shí)為零。

本文公開的很多不可切割的連接子詳細(xì)描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2005/0169933A1中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，式VII中的BFCG’-Z’由以下結(jié)構(gòu)式表示：

其中：q為1至5的整數(shù)；n為2至6的整數(shù)；D是H或SO₃M； M是H或陽(yáng)離子，例如Na⁺或K⁺。更優(yōu)選地，BFCG’-Z’由式(a1)、(a4)、(a8)、(a9)和(a10)表示。

“連接基團(tuán)”是化合物上可與雙官能交聯(lián)劑——包含衍生化美登醇或美登醇類似物的化合物(例如，式VI-IX化合物)或細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)以形成化學(xué)鍵的官能團(tuán)。

兩個(gè)半族，例如生物活性半族例如細(xì)胞結(jié)合劑或包含衍生化美登醇或美登醇類似物的化合物(例如，式VI-IX化合物)、或反應(yīng)性半族例如連接基團(tuán)，當(dāng)通過化學(xué)鍵或其他基團(tuán)連接時(shí)被“連接”以使基本上保持生物活性和/或反應(yīng)性。例如，MayO-A-和細(xì)胞結(jié)合劑通過結(jié)構(gòu)式(III)中的Y-M’-BFCG連接。連接兩個(gè)此類半族的基團(tuán)在本文被稱為“連接子”，其為結(jié)構(gòu)式V中的Y-M’-BFCG。

“殘基”是化合物中的活性官能團(tuán)與第二化合物經(jīng)歷反應(yīng)并且結(jié)合第二化合物后在該化合物中剩余的原子。類似地，在反應(yīng)后剩余的第二化合物中的原子是第二化合物的殘基。

術(shù)語(yǔ)"自降解性半族"是指能夠使兩個(gè)化學(xué)半族共價(jià)連接到通常穩(wěn)定的三重分子的雙官能化學(xué)半族。如果與第一半族的鍵被切割，那么自降解性半族能夠自發(fā)地與第二半族分離。自降解性半族包括但不限于描述于美國(guó)專利No.7,750,116和7,705,045以及US 2010/0062008中的那些半族。在一個(gè)實(shí)施方案中，自降解性半族是對(duì)氨基芐氧基羰基基團(tuán)(PABC)。可選地，自降解性半族是對(duì)氨基-雙(羥基甲基)苯乙烯(BHMS)，具有結(jié)構(gòu)p-NH-Ph-CH＝C(CH₂O-)₂，包括羰基基團(tuán)，結(jié)構(gòu)為p-NH-Ph-CH＝C(CH₂OCO-)₂。

術(shù)語(yǔ)“間斷”和“攜帶”在本文可互換使用。這些術(shù)語(yǔ)表示烷基、烯基、炔基、芳基烷基和雜環(huán)基烷基基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)亞甲基基團(tuán)被指定的基團(tuán)，例如聚乙烯單元、氮丙啶基團(tuán)、環(huán)氧基團(tuán)、氨基基團(tuán)、酰氨基基團(tuán)、酯基團(tuán)、芳基基團(tuán)和雜環(huán)基基團(tuán)替換。

直鏈或支鏈烷基是飽和的直鏈或支鏈單價(jià)烴自由基，優(yōu)選具有1至10個(gè)碳原子。適合的直鏈烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。適合的支鏈烷基的實(shí)例包括異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基和1-乙基-丙基。直鏈和支鏈烷基基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)如上所述的取代基取代。

直鏈或支鏈烯基是直鏈或支鏈單價(jià)烴自由基，優(yōu)選具有2至10個(gè)碳原子并且具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)，即碳-碳雙鍵，其中所述烯基自由基包括具有"順式"和"反式"取向、或可選地，"E"和"Z"取向的自由基。適合的直鏈烯基的實(shí)例包括乙烯基或乙烯基(-CH＝CH₂)、烯丙基(-CH₂CH＝CH₂)、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、戊二烯基和己二烯基。適合的支鏈烯基的實(shí)例包括異丁烯基、異戊烯基和異己烯基。優(yōu)選的烯基基團(tuán)為乙烯基、烯丙基和異丁烯基基團(tuán)。直鏈和支鏈烯基基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)如上所述的取代基取代。

直鏈或支鏈炔基是直鏈或支鏈單價(jià)烴自由基，優(yōu)選具有2至10個(gè)碳原子并且具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)，即碳-碳三鍵。適合的炔基的實(shí)例包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基等。直鏈和支鏈炔基基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)如上所述的取代基取代。

環(huán)狀烷基、環(huán)狀烯基和環(huán)狀炔基是單價(jià)非-芳族、飽和或部分不飽和環(huán)，優(yōu)選具有3至12個(gè)碳原子(作為單環(huán))或7至12個(gè)碳原子(作為雙環(huán))。環(huán)狀烷基、烯基和炔基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)丁烯基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)丁炔基、環(huán)戊炔基和環(huán)己炔基。優(yōu)選的環(huán)狀烷基、烯基和炔基基團(tuán)包括環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基和環(huán)己炔基以及環(huán)辛炔基。環(huán)狀烷基、烯基和炔基基團(tuán)可被一個(gè)或多個(gè)如上所述的取代基取代。

由R和R’表示的烷基、烯基和炔基的優(yōu)選取代基包括一個(gè)或多 個(gè)選自磺酸基團(tuán)、磷酸、羧基基團(tuán)、羧基酯例如甲基或乙基酯、以及伯胺、仲胺、叔胺或季胺。優(yōu)選為甲基、乙基、丙基和異丙基基團(tuán)。由Y和Y’表示的烷基、烯基和炔基的優(yōu)選取代基包括一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、烷氧基或芳基氧基基團(tuán)(例如甲氧基、乙氧基或苯氧基)、硫化物(例如S-甲基、S-乙基和S-苯基)、硫酯(例如S-乙酰基)、亞砜例如(甲基或苯基亞砜)、砜(例如甲基或苯基)砜、磺酰胺、醛、酮、(例如乙?；虮郊柞；?、環(huán)氧化物(例如環(huán)氧乙烷)、環(huán)硫化物、酰胺半族(例如乙酰氨基或苯甲酰氨基)、伯、仲、叔或季氨基或烷基氨基或芳基氨基基團(tuán)(例如甲基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基或三乙基氨基)、肼基、磺酸、羧基基團(tuán)、羧基酯例如甲基或乙基酯、羧酰胺、脲基、磷酸基、硝基基團(tuán)、疊氮基、氰基基團(tuán)和氰酸酯。

芳基或芳族基團(tuán)是單價(jià)芳族烴自由基，優(yōu)選具有6-18個(gè)碳原子。芳基或芳族基團(tuán)包括包含與飽和、部分不飽和環(huán)稠合的芳族環(huán)、或芳族碳環(huán)或雜環(huán)的二環(huán)自由基。未取代芳基的實(shí)例包括苯基、萘基和蒽基。

芳基或芳族基團(tuán)可被取代。由R和R’表示的芳基或芳族基團(tuán)優(yōu)選被至少一個(gè)含有1至4個(gè)碳原子的烷基或烯基基團(tuán)、烷氧基基團(tuán)例如甲氧基或乙氧基、鹵素、硝基基團(tuán)、磺酸基團(tuán)、磷酸、羧基、羧基酯例如甲基或乙基酯、伯胺、仲胺、叔胺或季胺或烷氧基例如甲氧基或乙氧基取代。由Y和Y’表示的芳基或芳族基團(tuán)優(yōu)選被以下取代：至少一個(gè)鹵素、烷氧基或芳基氧基基團(tuán)(例如甲氧基、乙氧基或苯氧基基團(tuán))、硫化物(例如S-甲基、S-乙基和S-苯基)、硫酯(例如S-乙?；?、亞砜(例如甲基或苯基亞砜)、砜(例如甲基或苯基砜)、磺酰胺、醛和酮(例如乙?；虮郊柞；?、環(huán)氧化物(例如環(huán)氧乙烷)、環(huán)硫化物、酰胺半族(例如乙酰氨基或苯甲酰氨基)、伯、仲、叔或季氨基或烷基氨基或芳基氨基基團(tuán)(例如甲基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基或三乙基氨基)、肼基、磺酸、羧基基團(tuán)、羧基酯例如甲基或乙基酯、羧酰胺、脲基、磷酸基、硝基基團(tuán)、疊氮基、氰基基團(tuán)和氰酸酯。取代的芳基或芳族基團(tuán)的優(yōu)選實(shí)例包括硝基苯基、二硝基苯基、氯苯基 和甲氧基苯基、甲苯?；捅桨贰?/p>

雜環(huán)基團(tuán)或雜環(huán)基是指飽和、部分不飽和或芳族碳環(huán)自由基，優(yōu)選具有3至18個(gè)環(huán)原子，其中至少一個(gè)環(huán)原子是選自氮、氧、磷和硫的雜原子，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子任選地被一個(gè)或多個(gè)如上所述的取代基取代。雜環(huán)基團(tuán)可以是單環(huán)基團(tuán)，優(yōu)選具有3至7個(gè)環(huán)成員(2至6個(gè)碳原子和1至4個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)或二環(huán)基團(tuán)，優(yōu)選具有7至10個(gè)環(huán)成員(4至9個(gè)碳原子和1至6個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)。雜環(huán)基團(tuán)描述于Paquette,Leo A.；"Principles of Modern Heterocyclic Chemistry"(W.A.Benjamin,New York,1968),特別是第1、3、4、6、7和9章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs"(John Wiley&Sons,New York,1950至今)，特別是第13、14、16、19和28卷；以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。雜環(huán)基團(tuán)最優(yōu)選為具有含有一個(gè)或兩個(gè)選自N、O或S的雜原子的3元至10元環(huán)系統(tǒng)的環(huán)狀化合物。雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例包括吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、哌啶子基、嗎啉代、哌嗪基、環(huán)氧丙烷基(oxetanyl)、硫雜環(huán)丁烷基、吡咯啉基、吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、吡唑啉基、二噻烷基、哌啶子基哌啶基、雜環(huán)芳族基團(tuán)例如吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基和苯并呋喃基。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜環(huán)基基團(tuán)是任選被取代的哌嗪基基團(tuán)或任選被取代的哌啶子基哌啶基(例如，4-哌啶子基哌啶基)基團(tuán)。

雜環(huán)基團(tuán)可任選地被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取代基取代：含有1至4個(gè)碳原子的烷基或烯基、或烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)、或鹵素、硫化物(例如S-甲基、S-乙基和S-苯基)、硫酯(例如S-乙?；?、亞砜(例如甲基或苯基亞砜)、砜(例如甲基或苯基砜)、磺酰胺、醛、酮(例如乙?；虮郊柞；?、環(huán)氧化物(例如環(huán)氧乙烷)、環(huán)硫化物、酰胺半族(例如乙酰氨基或苯甲酰氨基)、伯、仲、叔或季氨基或烷基 氨基或芳基氨基基團(tuán)(例如甲基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基或三乙基氨基)、肼基、磺酸、羧基基團(tuán)、羧基酯例如甲基或乙基酯、羧酰胺、脲基、磷酸基、硝基基團(tuán)、疊氮基、氰基基團(tuán)和氰酸酯。

本發(fā)明中有用的肽(短氨基酸單元、優(yōu)選2至10個(gè)氨基酸單元)由天然或非天然氨基酸(包括N-烷基氨基酸、實(shí)例N-甲基氨基酸、以及還包括其L-異構(gòu)體、D-異構(gòu)體或外消旋氨基酸)構(gòu)成。適合的肽的實(shí)例包括二肽、三肽、四肽和五肽。優(yōu)選的肽包括纈氨酸-瓜氨酸、ala-phe、gly-gly-gly、ala-leu-ala-leu、ala-leu-ala-leu-β-ala。

適合的鹵素包括F、Cl、Br或I。

藥學(xué)上可接受的鹽是本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)鹽。示例性鹽包括但不限于硫酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲烷磺酸鹽"甲磺酸鹽"、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、鹽、堿金屬(例如，鈉和鉀)鹽、堿土金屬(例如，鎂)鹽和銨鹽。藥學(xué)上可接受的鹽可涉及包含另一分子例如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他抗衡離子?？购怆x子可以是穩(wěn)定母體化合物上的電荷的任何有機(jī)或無機(jī)半族。而且，藥學(xué)上可接受的鹽可在其結(jié)構(gòu)中具有多于一個(gè)的荷電原子。多個(gè)荷電原子是藥學(xué)上可接受的鹽的一部分的例子可具有多個(gè)抗衡離子。因此，藥學(xué)上可接受的鹽可具有一個(gè)或多個(gè)荷電原子和/或者一個(gè)或多個(gè)抗衡離子。

如果本發(fā)明化合物是堿，那么所需藥學(xué)上可接受的鹽可通過本領(lǐng)域可用的任何適合方法來制備，例如用無機(jī)酸或有機(jī)酸處理游離堿，所述無機(jī)酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，所述有機(jī)酸如乙酸、順丁烯二酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羥乙酸、水楊酸、吡喃糖苷酸例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α羥基酸例如檸檬酸或酒石酸、氨基酸例如門冬氨酸或谷氨酸、芳族 酸例如苯甲酸或肉桂酸、磺酸例如對(duì)甲苯磺酸或乙磺酸等。

如果本發(fā)明化合物是酸，那么所需藥學(xué)上可接受的鹽可通過任何適合方法來制備，例如用無機(jī)或有機(jī)堿處理游離酸，例如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物等。適合的鹽的說明性實(shí)例包括但不限于源自氨基酸例如甘氨酸和精氨酸、氨、伯胺、仲胺和叔胺、以及環(huán)胺例如哌啶、嗎啉和哌嗪的有機(jī)鹽、以及源自鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁和鋰的無機(jī)鹽。

溶劑化物是進(jìn)一步包括化學(xué)計(jì)量的或非化學(xué)計(jì)量的量的溶劑例如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、己烷、庚烷、二甲基乙酰胺、乙酸乙酯、乙酸、乙醇胺、二氯甲烷、2-丙醇等的化合物，其受非共價(jià)分子間力限制?；衔锏娜軇┗锘蛩衔锿ㄟ^添加至少一個(gè)摩爾當(dāng)量的羥基溶劑例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水添加至化合物來容易地制備。

安絲菌素衍生物的合成

本發(fā)明提供了生成安絲菌素衍生物的方法，其中將C3羥基、C-14羥基甲基、C-15羥基、或C-20脫甲基轉(zhuǎn)化成攜帶能夠與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)以提供偶聯(lián)物的官能團(tuán)的酯、氨基甲酸酯、碳酸酯或醚。適合官能團(tuán)是二硫化物、硫醇、醇、羧基、羰基基團(tuán)、胺、肼、順丁烯二酰亞胺、疊氮化物、鹵素、磺酸酯例如甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯和對(duì)甲苯磺酸酯、乙烯基吡啶、乙烯砜、乙烯基磺酰胺、磺酸、磺酰氯、活性羧基酯例如N-羥基琥珀酰亞胺基、硝基或二硝基苯基、五氟苯基、磺基四氟苯基、鄰苯二甲酰亞胺基。這些官能團(tuán)經(jīng)由二硫鍵、硫醚鍵、肽鍵、酰胺鍵、酯鍵或腙鍵形成與細(xì)胞結(jié)合劑的連接。

安絲菌素酯衍生物通過用還攜帶適合于連接細(xì)胞結(jié)合劑的官能團(tuán)的羧酸化合物酯化美登醇來制備。此側(cè)鏈的合成示于圖4中。酯化反應(yīng)在催化劑例如1-羥基苯并三唑(HOBt)、4,4-二甲基氨基吡啶(DMAP)或ZnCl₂的存在下利用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)劑例如二環(huán)己基碳 二亞胺(DCC)或1-[(3-二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺(EDC)。攜帶不同的連接基團(tuán)的安絲菌素酯的合成示于圖5-13中。

如下合成攜帶各種鏈長(zhǎng)的酯的含硫醇的安絲菌素衍生物6(圖5)、55(圖13a)和58(圖13b)。制備具有不同碳鏈長(zhǎng)度和支化度的巰基-羧酸并且將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的甲基二硫化物。用這些羧酸酯化美登醇在DCC/DMAP存在下順利地進(jìn)行，從而提供甲基二硫代安絲菌素。用二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫化物提供了含硫醇的安絲菌素6、55和58。

如圖11所示制備攜帶用于連接細(xì)胞結(jié)合劑的N-羥基琥珀酸基酯或N-羥基琥珀酰亞胺基酯的安絲菌素衍生物13a,b。用TEOC在兩個(gè)羧基基團(tuán)中的一個(gè)上部分保護(hù)己烷-1,6-二酸。酯化美登醇提供了攜帶受保護(hù)的羧基基團(tuán)的安絲菌素酯衍生物。用四丁基氟化銨對(duì)TEOC基團(tuán)脫保護(hù)提供了羧基安絲菌素衍生物14b。用N-羥基琥珀酰亞胺或N-羥基磺基琥珀酰亞胺縮合，提供了攜帶用于與細(xì)胞結(jié)合劑連接的活性酯的安絲菌素衍生物13a,b。

安絲菌素氨基甲酸酯衍生物通過使美登醇與氯甲酸酯例如氯甲酸4-硝基苯基酯反應(yīng)、然后與還攜帶用于與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的官能團(tuán)(例如二硫化物半族)的氨基化合物反應(yīng)來制備。備選方法示于圖12b中。

安絲菌素碳酸酯衍生物通過使美登醇與光氣反應(yīng)、然后與還攜帶用于與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的官能團(tuán)(例如二硫化物半族)的羥基化合物反應(yīng)來制備。備選方法示于圖12b中。

如圖12a所示制備安絲菌素醚衍生物。美登醇用堿(對(duì)于適合的堿，參見美國(guó)專利No.7,598,375和7,301,019，通過引用明確并入本文)例如氫化鈉、正丁基鋰、三氟甲磺酸鋅/二異丙基乙胺或六甲基二硅胺化鋰處理，然后與含有鹵素或磺酸酯(例如甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯或?qū)妆交撬狨?的還攜帶用于與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)的官能團(tuán)的化合物反應(yīng)。

制備酯、氨基甲酸酯、碳酸酯和醚的額外通用方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如March’s Advanced Organic Chemistry,Jerry March&Michael B.Smith、Wiley 2007，通過引用明確并入本文)。

安絲菌素衍生物的體外細(xì)胞毒性

本發(fā)明的安絲菌素衍生物的體外細(xì)胞毒性可通過先前公開的方法(美國(guó)專利7,276,497和Widdison等人，J.Med.Chem.,49；4392,2006，均通過引用明確并入本文)來測(cè)量。例如，細(xì)胞系例如人乳腺癌系SK-Br-3、或人表皮樣癌細(xì)胞系KB可用于評(píng)估這些新型安絲菌素衍生物的細(xì)胞毒性。將待評(píng)價(jià)的細(xì)胞暴露于化合物下達(dá)72小時(shí)并且通過已知方法在直接測(cè)定中測(cè)量細(xì)胞的存活分率。由測(cè)定結(jié)果計(jì)算IC₅₀值。

細(xì)胞結(jié)合劑

本發(fā)明的其安絲菌素衍生物或其偶聯(lián)物作為治療劑的有效性取決于對(duì)合適細(xì)胞結(jié)合劑的仔細(xì)選擇。細(xì)胞結(jié)合劑可以是目前已知的、或是正在成為已知的任意種類，包括肽和非肽。通常地，這些可以是抗體(尤其是單克隆抗體)、淋巴因子、激素、生長(zhǎng)因子、維生素、營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)分子(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白)、或任意其他細(xì)胞結(jié)合劑或物質(zhì)。

可以使用的細(xì)胞結(jié)合劑的更具體實(shí)例包括：

多克隆抗體；

單克隆抗體；

抗體片段例如Fab、Fab'和F(ab')₂、Fv(Parham,J.Immunol.131:2895-2902(1983)；Spring等人J.Immunol.113:470-478(1974)；Nisonoff等人Arch.Biochem.Biophys.89:230-244(1960))；微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、納米抗體、前抗體(probody)、結(jié)構(gòu)域抗體、單抗體、微型抗體等(參見Kim等人，Mol,Cancer Ther.,7: 2486-2497(2008),Carter,Nature Revs.,6:343-357(2006),R.Kontermann&S.Dubel,2001Antibody Engineering,Springer-Verlag,Heidelberg-New York；

雙特異性抗體(Morrison,SL Nature biotechnology 25(11):1233-4(2007))；

錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins；Zahnd等人，J.Biol.Chem.,281,46,35167-35175,(2006)；Binz,H.K.,Amstutz,P.&Pluckthun,A.(2005)Nature Biotechnology,23,1257-1268)或錨蛋白樣重復(fù)蛋白或合成肽，例如描述于美國(guó)專利公布號(hào)20070238667；美國(guó)專利No.7,101,675；以及WO/2007/147213；WO/2007/062466中)

干擾素(例如.α.、.β.、.γ.)；

淋巴因子例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6；

激素例如胰島素、TRH(促甲狀腺激素釋放激素)、MSH(黑素細(xì)胞刺激激素)、類固醇激素例如雄激素和雌激素；

生長(zhǎng)因子和集落刺激因子例如EGF、TGF-α、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess,Immunology Today 5:155-158(1984))；

轉(zhuǎn)鐵蛋白(O'Keefe等人J.Biol.Chem.260:932-937(1985))；和

維生素，例如葉酸。

單克隆抗體技術(shù)允許以特異性單克隆抗體的形式制備特異性很高的細(xì)胞結(jié)合劑。本領(lǐng)域中特別眾所周知的是通過采用所關(guān)注的抗原如完整的靶細(xì)胞、從靶細(xì)胞分離出的抗原、全病毒、減毒的全病毒、以及病毒蛋白如病毒外殼蛋白來免疫小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠或任何其它哺乳動(dòng)物，從而生成單克隆抗體的技術(shù)。致敏人細(xì)胞也可使用。生成單克隆抗體的其它方法是采用scFv(單鏈可變區(qū))，尤其是人類scFv的 噬菌體庫(kù)(參見例如，Griffiths等人，美國(guó)專利No.5,885,793和5,969,108；McCafferty等人，WO 92/01047；Liming等人，WO99/06587)。此外，也可以使用在美國(guó)專利No.5,639,641中公開的表面重塑的抗體，如可嵌合抗體和人源化抗體一樣。合適細(xì)胞結(jié)合劑的選擇是取決于待靶向的特定細(xì)胞群體的一個(gè)選擇問題，但是一般而言優(yōu)選人單克隆抗體，如果可得到合適的話。

例如，單克隆抗體MY9是特異性結(jié)合到CD33抗原的鼠IgG₁抗體{J.D.Griffin等人8Leukemia Res.,521(1984)}并且其可在靶細(xì)胞表達(dá)CD33的情況下，如在急性骨髓性白血病(AML)的疾病下使用。類似地，單克隆抗體抗-B4是結(jié)合到B細(xì)胞上CD19抗原的鼠IgG₁{Nadler等人，131J.Immunol.244-250(1983)}并且其可在靶細(xì)胞是B細(xì)胞或表達(dá)該抗原的患病細(xì)胞的情況下，例如在非-何杰金氏淋巴瘤或淋巴性白血病的情況下使用。Hu-B4是源自鼠抗-B4抗體的表面重塑的抗體(Roguska等人，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.,91,pg969-973)。HuN901是結(jié)合到在小細(xì)胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌和其他實(shí)體腫瘤(包括神經(jīng)內(nèi)分泌癌)上表達(dá)的CD56抗原上的人源化抗體(Roguska等人，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.,91,第969-973頁(yè))。B38.1是靶向EpCAM的嵌合抗體。也可使用靶向在數(shù)種實(shí)體腫瘤上表達(dá)的EGF受體的全人抗體例如帕尼單抗(Van Cutsem等人，J Clin Oncol.2007；25(13):1658-1664)。也可使用抗-erbB抗體例如曲妥單抗和帕妥珠單抗(Nahta等人，2004,Cancer Research 64:2343-2346。

當(dāng)細(xì)胞結(jié)合劑為抗體時(shí)，其結(jié)合至為多肽并且可以是跨膜分子(例如受體)或配體如生長(zhǎng)因子的抗原。示例性的抗原包括例如腎素的分子；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素和胎牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺激素；甲狀腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子vmc、因子IX、組織因子(TF)和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C；心房鈉尿肽；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物 (t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腦啡肽酶；RANTES(對(duì)通常T-細(xì)胞表達(dá)和分泌的活化的調(diào)節(jié))；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；苗勒(Muellerian)抑制物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；前松弛素；鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，例如β-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE；細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；蛋白A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如骨源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子例如NGF-β；血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子例如aFGF和bFGF；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(FGFR2)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受體、EphB受體、葉酸受體、FOLR1、間皮素(mesothelin)、cripto、α_vβ₆、整聯(lián)蛋白、VEGF、VEGFR、EGFR、運(yùn)鐵蛋白受體、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5；CD蛋白，例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80.CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152或在美國(guó)公布No.20080171040或美國(guó)公布No.20080305044中公開的結(jié)合一種或多種腫瘤相關(guān)的抗原或細(xì)胞表面受體的抗體，并且它們通過引用整體并入；紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(ILs)，例如，IL-1到IL-10；超氧化物岐化酶；T-細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，例如，例如HIV包膜蛋白的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，例如CD11a、CD11b、 CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；腫瘤相關(guān)抗原例如HER2、HER3或HER4受體；內(nèi)皮因子(endoglin)、c-Met、c-kit、1GF1R、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、LGR5、B7H4、TAG72(腫瘤相關(guān)糖蛋白72)、5T4(Bogharert等人，International J.of Oncology 32:221-234,2008)以及以上列出任一多肽的片段。

另外，GM-CSF(其與髓系細(xì)胞結(jié)合)可用作急性骨髓白血病的患病細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合劑。IL-2(其與活化T細(xì)胞結(jié)合)可用于防止移植體移植排斥，用于治療和預(yù)防移植物抗宿主疾病，以及用于治療急性T細(xì)胞白血病。與黑素細(xì)胞結(jié)合的MSH可被用于治療黑素瘤。葉酸可用于靶向在卵巢癌和其它腫瘤上表達(dá)的葉酸受體。表皮生長(zhǎng)因子可用于靶向鱗狀細(xì)胞癌，如肺以及頭和頸。促生長(zhǎng)素抑制素可用于靶向成神經(jīng)細(xì)胞瘤和其它腫瘤類型。

乳腺癌和睪丸癌可以用作為細(xì)胞結(jié)合劑的雌激素(或雌激素類似物)或雄激素(或雄激素類似物)分別成功地靶向。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞結(jié)合劑是huN901、huMy9-6、huB4、huC242、曲妥單抗、比伐單抗、西羅珠單抗、利妥昔單抗、CNTO95、huDS6、描述于WO 2010/124797中的抗-間皮瘤抗體(例如MF-T)、描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公布2010/0093980中的抗-cripto抗體(例如huB3F6)、描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公布2007/0183971中的抗-CD138抗體(例如huB-B4)、描述于美國(guó)專利No.7,736,644和7,628,986以及美國(guó)申請(qǐng)公布No.2010/0111979、2009/0240038、2009/0175887、2009/0156790和2009/0155282中的抗-EGFRvIII抗體、描述于PCT/IB2010/054417和PCT/IB2010/054422中的人源化EphA2抗體(例如2H11R35R74)；描述于WO2008/047242中的抗-CD38抗體(例如hu38SB19)、描述于美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/307,797、61/346,595和61/413,172和美國(guó)申請(qǐng)No.13/033,723中的抗-葉酸受體抗體。所有這些申請(qǐng)的教導(dǎo)通過引用整體并入本文。

細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物的生成

本發(fā)明還提供了安絲菌素衍生物-細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物，其包含經(jīng)由各種連接子連接到一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞毒性安絲菌素衍生物的細(xì)胞結(jié)合劑，所述連接子包括但不限于二硫化物連接子、硫醚連接子、酰胺鍵合的連接子、肽酶-不穩(wěn)定性連接子、酸不穩(wěn)定性連接子、脂酶不穩(wěn)定性連接子。

可用許多方法在腫瘤/不需要的增殖細(xì)胞的位點(diǎn)上切割連接子以將細(xì)胞毒性劑遞送至其靶。連接子可(例如)通過低pH(腙)、還原環(huán)境(二硫化物)、蛋白質(zhì)水解(酰胺/肽連接)、或通過酶促反應(yīng)(脂酶/糖苷酶)切割。

本發(fā)明的代表性細(xì)胞毒性偶聯(lián)物是抗體/安絲菌素衍生物、抗體片段-安絲菌素衍生物、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)/安絲菌素衍生物、黑素細(xì)胞刺激激素(MSH)/安絲菌素衍生物、甲狀腺刺激激素(TSH)/安絲菌素衍生物、生長(zhǎng)抑素/安絲菌素衍生物、葉酸/安絲菌素衍生物、雌激素/安絲菌素衍生物、雌激素類似物/安絲菌素衍生物、前列腺特異性膜抗原(PSMA)抑制劑/安絲菌素衍生物、蛋白裂解酶抑制劑/安絲菌素衍生物、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins)/安絲菌素衍生物、雄激素/安絲菌素衍生物以及雄激素類似物/安絲菌素衍生物。

本發(fā)明的偶聯(lián)物可根據(jù)本領(lǐng)域中的任何已知方法來制備。參見例如，WO 2009/134977、美國(guó)專利No.7,811,572、6,441,163、U.S2006/0182750和Widdison,W.C.等人Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer.J Med Chem 2006,49(14),4392-4408。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物可通過如下來制備：a)使細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能交聯(lián)劑反應(yīng)以形成經(jīng)修飾的具有與其共價(jià)結(jié)合的連接子的細(xì)胞結(jié)合劑；b)任選地純化經(jīng)修飾的細(xì)胞結(jié)合劑；c)將細(xì)胞毒性劑(即，本文所述的安絲菌素衍生物，例如式VI-IX化合物)與經(jīng)修飾的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)以形成細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián) 物；以及d)純化細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的偶聯(lián)物可通過使細(xì)胞結(jié)合劑與具有能夠與細(xì)胞結(jié)合劑形成共價(jià)鍵的連接基團(tuán)的藥物-連接子化合物(例如，式X-XII化合物)反應(yīng)以形成細(xì)胞結(jié)合劑-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物來制備。然后可純化偶聯(lián)物?？稍划a(chǎn)生藥物-連接子化合物并且在不經(jīng)純化下將其用于與抗體反應(yīng)。

可在首先使細(xì)胞結(jié)合劑與雙官能連接子例如商購(gòu)可得的SMCC反應(yīng)后使攜帶硫醇半族的安絲菌素衍生物與細(xì)胞結(jié)合劑例如抗體的Fab單元偶聯(lián)。例如Fab片段的數(shù)種賴氨酸殘基可與SMCC反應(yīng)以得到攜帶順丁烯二酰亞胺基團(tuán)的經(jīng)修飾的Fab，然后可使含硫醇的安絲菌素與經(jīng)修飾的Fab反應(yīng)以得到偶聯(lián)物。

攜帶順丁烯二酰亞胺基團(tuán)的安絲菌素衍生物可與含有一個(gè)或多個(gè)硫醇半族的細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)。例如抗體可與二硫蘇糖醇反應(yīng)以還原數(shù)個(gè)抗體內(nèi)部二硫鍵。二硫蘇糖醇可通過分子排阻色譜除去，然后可使攜帶順丁烯二酰亞胺的安絲菌素衍生物與游離硫醇基團(tuán)偶聯(lián)以得到偶聯(lián)物。

攜帶活化酯例如N-羥基琥珀酰亞胺酯的安絲菌素衍生物可與攜帶一個(gè)或多個(gè)胺半族的細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)。例如含有一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基的雙鏈抗體可與攜帶五氟苯基酯的安絲菌素衍生物反應(yīng)以得到偶聯(lián)物。

通過上文所述的方法制備的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物可通過本文所述的任何方法來純化。

含有二硫化物的細(xì)胞毒性偶聯(lián)物通過使含硫醇的安絲菌素衍生物與合適修飾的細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)來制備(參見圖14,25)。通過使用凝膠過濾、離子交換色譜、陶瓷羥磷灰石(CHT)色譜、疏水相互作用色譜(CHT)、切向流過濾(TFF)、或通過HPLC純化這些偶聯(lián)物以除去非 連接的細(xì)胞毒性劑。

將含水緩沖液中的抗體溶液用摩爾過量的抗體修飾劑例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)或用N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)孵育來引入二硫代吡啶基基團(tuán)。經(jīng)修飾的抗體然后與含硫醇的細(xì)胞毒性劑例如化合物17、18、19或46反應(yīng)，以生成二硫化物-連接的抗體-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物。細(xì)胞毒性-細(xì)胞結(jié)合偶聯(lián)物然后使用任何上文提及的方法來純化?？捎糜谝攵蚧锘鶊F(tuán)的其他交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是已知的并且公開于美國(guó)專利6,913,748、6,716,821和美國(guó)專利公布20090274713和20100129314中。

可選地，抗體用摩爾過量的抗體修飾劑例如2-亞胺基硫雜環(huán)戊烷、L-同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯(或衍生物)、或N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)孵育以引入巰基基團(tuán)。經(jīng)修飾的抗體然后與合適的含二硫化物的安絲菌素衍生物反應(yīng)以生成二硫化物-連接的抗體-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物?？贵w-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物然后通過凝膠過濾或其他上文提及的方法來純化。

每抗體分子結(jié)合的細(xì)胞毒性分子的數(shù)量通過測(cè)量280nm和252nm下的吸光度的比率用分光光度法測(cè)定。每抗體分子平均1-10個(gè)細(xì)胞毒性分子通過該方法連接。優(yōu)選的每抗體分子連接的細(xì)胞毒性分子的平均數(shù)為2-5，并且最優(yōu)選為3-4.5。

可選地，可制備偶聯(lián)物，其中安絲菌素衍生物經(jīng)由不可切割的連接子連接到細(xì)胞結(jié)合劑(參見圖15、16、26)。抗體在含水緩沖劑中的溶液用摩爾過量的抗體-修飾劑例如N-琥珀酰亞胺基-4-(N-順丁烯酰二亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)孵育以引入順丁烯酰二亞胺基基團(tuán)、或用N-琥珀酰亞胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)孵育以引入碘乙?；鶊F(tuán)。經(jīng)修飾的抗體然后與含硫醇的安絲菌素衍生物反應(yīng)以生成硫醚-連接的抗體-細(xì)胞毒性偶聯(lián)物?？贵w-細(xì)胞毒性偶聯(lián) 物然后通過凝膠過濾或其他上文提及的方法通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來純化。向細(xì)胞結(jié)合劑引入順丁烯酰二亞胺基基團(tuán)或鹵代乙?；钠渌宦?lián)劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參見美國(guó)專利申請(qǐng)2008/0050310、20050169933，可由Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box117,Rockland,IL 61105,USA得到)并且包括但不限于BMPEO、BMPS、GMBS、EMCS、5-順丁烯酰二亞胺基戊酸NHS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、KMUA、SMPB、SMPH、SVSB、DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、BM(PEO)₃、BM(PEO)₃、磺基-SMCC、磺基-SIAB、磺基-MBS、磺基-GMBS、磺基-EMCS、磺基-KMUS和磺基-SMPB。

攜帶胺反應(yīng)性基團(tuán)例如N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)酯的安絲菌素衍生物與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)以生成直接酰胺連接的偶聯(lián)物(參見圖20、24、27)?？贵w-細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)物通過凝膠過濾或其他上文提及的方法來純化。

包含肽可切割的連接子的細(xì)胞結(jié)合劑-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物由相應(yīng)的含有肽的安絲菌素衍生物制備(參見圖17、18、19)。

攜帶末端N-羥基琥珀酰亞胺的含有肽的安絲菌素衍生物直接與細(xì)胞結(jié)合劑反應(yīng)以提供肽可切割的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物通過凝膠過濾、透析或其他本領(lǐng)域已知的方法來純化。示例性肽包括二肽，例如纈氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-苯基丙氨酸；三肽，例如、gly-gly-gly、gly-val-cit、ala-val-cit；四肽，例如leu-leu-leu-leu、ala-lys-ala-lys、ala-leu-ala-leu；五肽或六肽。其他可使用的肽在本領(lǐng)域公開(參見美國(guó)專利公布2008/0050310、20090047296、20080280937、20090203889)。

如圖21、22所示制備包含酸不穩(wěn)定性連接的安絲菌素衍生物的細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物。具有酸不穩(wěn)定性連接例如腙的偶聯(lián)物通過含有烷基、芳基酮的安絲菌素衍生物與肼修飾的細(xì)胞結(jié)合劑的縮合而制備。可選地，修飾細(xì)胞結(jié)合劑以引入本領(lǐng)域所述的羰基基團(tuán)半族(參見美 國(guó)專利5,773,001；5,767,285；5,877,296)，然后與攜帶肼基半族安絲菌素衍生物反應(yīng)。

評(píng)價(jià)細(xì)胞結(jié)合劑與本發(fā)明安絲菌素衍生物的偶聯(lián)物抑制各種不需要細(xì)胞系的體外增殖的能力。例如，細(xì)胞系例如人結(jié)腸癌系COLO205、人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)-375和人髓樣白血病細(xì)胞系HL60可用于評(píng)估這些偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性。待評(píng)價(jià)的細(xì)胞可暴露于化合物下達(dá)24小時(shí)、72小時(shí)或更長(zhǎng)并且細(xì)胞的存活分率通過已知方法在直接測(cè)定中測(cè)量。然后可由測(cè)定結(jié)果計(jì)算IC₅₀值。

細(xì)胞結(jié)合劑與安絲菌素衍生物的偶聯(lián)物的體內(nèi)抗腫瘤效力通過先前公開的方法(美國(guó)專利No.7,473,796，通過引用并入本文)來評(píng)價(jià)。

組合物及使用方法

本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的任何安絲菌素衍生物-細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物、以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

本發(fā)明還提供了治療方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的任何上述的偶聯(lián)物。

類似地，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)所選細(xì)胞群體中的細(xì)胞死亡的方法，其包括將靶細(xì)胞或含有靶細(xì)胞的組織與有效量的細(xì)胞毒性劑(包含本發(fā)明的任何安絲菌素衍生物-細(xì)胞結(jié)合劑偶聯(lián)物、其鹽或溶劑化物)接觸。靶細(xì)胞為細(xì)胞結(jié)合劑可與其結(jié)合的細(xì)胞。

如有需要，其他活性劑例如其他抗腫瘤劑可與偶聯(lián)物一起施用。

適合的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和賦形劑是眾所周知的并且可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員以臨床情況為據(jù)而確定。

適合的載體、稀釋劑和/或賦形劑的實(shí)例包括：(1)杜爾貝科氏磷 酸緩沖鹽水(pH約7.4)，含有或不含約1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％鹽水(0.9％w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)葡萄糖；并且也可含有抗氧化劑例如色胺和穩(wěn)定劑例如Tween 20。

誘導(dǎo)所選細(xì)胞群體中的細(xì)胞死亡的方法可在體外、體內(nèi)或離體進(jìn)行。

體外應(yīng)用的實(shí)例包括在移植到同一患者之前，對(duì)自體骨髓進(jìn)行處理以殺死患病細(xì)胞或惡性細(xì)胞：移植之前處理骨髓以便殺死感受態(tài)T細(xì)胞并且防止移植物抗宿主病(GVHD)；處理細(xì)胞培養(yǎng)物以殺死除未表達(dá)靶抗原的所需變體之外的所有細(xì)胞；或殺死表達(dá)不希望的抗原的變體。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易確定體外應(yīng)用的非臨床條件。

臨床離體應(yīng)用的例子是在癌癥治療或自身免疫疾病治療中，進(jìn)行自體移植之前將腫瘤細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞從骨髓中去除，或在進(jìn)行移植之前從自體的或異體(allogenic)的骨髓中去除T細(xì)胞或其它淋巴樣細(xì)胞，以防止GVHD。治療按如下進(jìn)行。從患者或其它個(gè)體收集骨髓，然后在約37℃下于加入了濃度為10μM到1pM的本發(fā)明細(xì)胞毒性劑的含血清培養(yǎng)基中孵育約30分鐘至48小時(shí)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員易于確定孵育的濃度和時(shí)間(即劑量)的確切條件。在孵育之后，用含有血清的培養(yǎng)基洗滌骨髓細(xì)胞，并采用已知的方法使骨髓細(xì)胞由靜脈內(nèi)返回到患者。在患者接受其它治療，如在收集骨髓和重新灌注處理過的細(xì)胞之間的期間內(nèi)接受燒蝕化療(ablative chemotherapy)或全身放療(total-body irradiation)的情況下，采用標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)療器械在液氮中儲(chǔ)存處理過的骨髓細(xì)胞。

對(duì)于臨床體內(nèi)應(yīng)用，本發(fā)明的細(xì)胞毒性劑以作為測(cè)定無菌度和內(nèi)毒素水平的溶液或凍干粉末而提供。偶聯(lián)物施用的合適方法的例子如下。偶聯(lián)物作為靜脈內(nèi)推注劑施用，每周一次，為期4周。施用的推注劑量為，在50到1000ml標(biāo)準(zhǔn)鹽水中可加入5到10ml人類血清白 蛋白。每次靜脈內(nèi)施用的劑量將為10μg到2000mg(每天施用的劑量范圍為100ng到20mg/kg)。治療4周之后，患者可繼續(xù)接受每周一次的治療。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員以臨床情況為據(jù)，可確定關(guān)于施用途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量、時(shí)間等的具體臨床方案。

根據(jù)誘導(dǎo)所選細(xì)胞集落中的細(xì)胞死亡的體內(nèi)或離體方法可治療的醫(yī)學(xué)病狀的例子包括任何種類的惡性情況，包括(例如)肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、卵巢癌和淋巴器官癌；自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化；移植排斥，如腎移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主?。徊《靖腥?，如CMV感染、HIV感染、AIDS等；以及寄生蟲感染，如賈第鞭毛蟲病、阿米巴病、血吸蟲病，以及其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可確定的疾病。

本文提及的所有出版物、專利和非專利參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過引用明確并入本文。

實(shí)施例

現(xiàn)在通過參照非限制性的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明。除非另有指明，否則所有的百分比、比率、份數(shù)等均以重量計(jì)。

所有試劑均購(gòu)自Aldrich Chemical Co.,New Jersey或來自其他商業(yè)來源。如前所述制備美登醇(11)(美國(guó)專利6,333,410)。核磁共振(¹H NMR)光譜是在Bruker 400MHz設(shè)備上獲得的，且質(zhì)譜在Bruker Daltonics Esquire 3000儀器上使用電噴霧離子化獲得的。體外細(xì)胞毒性測(cè)定如前所述地進(jìn)行(參見美國(guó)專利7,276,497和W.C.Widdison等人，J.Med.Chem.,2006,49,4392-4408)。

KB(ATCC CCl-17)細(xì)胞系是人上皮細(xì)胞來源。由人乳腺癌細(xì)胞建立SK-BR-3(ATCC HTB-30)細(xì)胞系。人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系COLO 205(ATCC CCL-222)和HT-29(ATCC HTB 38)、人黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)-375 (ATCC CRL 1619)、人伯基特淋巴瘤細(xì)胞系Ramos(ATCC CRL-1596)和人髓系白血病細(xì)胞系HL-60(ATCC CCL-240)所有均獲自ATCC,Maryland。使細(xì)胞系在具有L-谷氨酰胺的杜爾貝科氏改性伊格爾培養(yǎng)基(DMEM,Biowhittaker,Walkersville,MD)中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％胎牛血清(Hyclone,Logan,Utah)和50μg/mL硫酸慶大霉素(Life Technologies,Rockville,MD)。將細(xì)胞維持在36-37.5℃下于含有6％CO₂的增濕大氣中。

實(shí)施例1.體外細(xì)胞毒性

細(xì)胞毒性研究使用克隆原測(cè)定來進(jìn)行。將測(cè)試細(xì)胞系(KB和SK-Br-3)以每孔1000個(gè)細(xì)胞的恒定數(shù)量接種于6孔培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞用不同濃度(0至3nM)的各種安絲菌素或美登素孵育72小時(shí)。然后從平板吸取培養(yǎng)基并且替換為新鮮培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基生長(zhǎng)，并且在接種后總計(jì)7-10天后形成集落。然后固定培養(yǎng)基并且用10％福爾馬林/PBS中的0.2％結(jié)晶紫染色，并對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過將所計(jì)數(shù)的集落數(shù)目除以所接種的細(xì)胞數(shù)目確定未處理細(xì)胞(僅培養(yǎng)基)的接種效率。通過將孔中暴露于藥物下的集落數(shù)目除以對(duì)照孔中的集落數(shù)目來測(cè)定暴露于藥物下的細(xì)胞的存活分率。

各種安絲菌素與美登素相比的體外細(xì)胞毒性測(cè)量的結(jié)果示于圖3中。結(jié)果顯示，測(cè)試的所有三種安絲菌素酯對(duì)測(cè)試的兩種細(xì)胞系(KB和SK-Br-3)的效力比美登素高。例如，攜帶C3戊?；陌步z菌素P4’和攜帶異丁?；サ陌步z菌素P3對(duì)SK-Br-3細(xì)胞的效力比C3N-乙?；?N-甲基丙氨?；ァ赖撬?IC₅₀＝3.4x 10^-11M)高17倍(IC₅₀＝2x10^-12M)。類似地，安絲菌素P3、P4和P4’酯對(duì)KB細(xì)胞的效力比美登素高3.7至6倍。

實(shí)施例2.衍生化羧酸的制備

化合物28：如前所述，3-巰基丙酸與S-甲基硫代磺酸甲酯在乙醇中反應(yīng)以得到28。(Widdison,W.C.,等人，J Med Chem,2006.4, 4392-408)。

化合物30：化合物30通過使S-甲基硫代磺酸甲酯與4-巰基-1-丁醇反應(yīng)而制備。

化合物32：化合物32通過使S-甲基硫代磺酸甲酯與1-氨基-丁-4-硫醇反應(yīng)而制備(Reineke,T.M.等人Bioconjugate Chem.,2003 14,247-254)。

化合物34：如下制備攜帶呋喃的羧酸34。5-羥基甲基-2-糠酸甲酯(33)(Moore,J.A等人，Journal of Polymer Science,Polymer Chemistry Edition(1984),22(3),863-4)與甲磺酰氯反應(yīng)，然后與硫脲反應(yīng)并水解以得到33。之后33與甲基硫代磺酸酯反應(yīng)。

化合物37：化合物37通過使2,2’-二硫代二吡啶與4-(巰基甲基)苯甲酸36反應(yīng)而制備。

化合物39：化合物39通過使2,2’-二硫代二吡啶與硫代PEG4羧酸38反應(yīng)而制備。

化合物42：如下制備攜帶肽的羧酸42。使用N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基苯并三唑(HOBT)使二肽FMoc-Val-Cit-OH 40(Dubowchik G.M.等人Bioconjugate Chem.2002,13,855-869)與β丙氨酸的叔丁酯偶聯(lián)，然后用哌啶進(jìn)行FMoc脫保護(hù)以得到41。化合物41然后與3-[2-吡啶基二硫代]-丙酸N-琥珀酰亞胺基酯(SPDP)反應(yīng)，然后用三氟乙酸進(jìn)行叔丁酯脫保護(hù)。

實(shí)施例3.碳酸4-硝基-苯酚酯或氨基甲酸4-硝基-苯酚酯的制備

使氯甲酸4-硝基苯酯與化合物30反應(yīng)以得到攜帶二硫化物的碳酸酯43。

使氯甲酸4-硝基苯酯與化合物32反應(yīng)以得到攜帶二硫化物的氨 基甲酸酯44。

安絲菌素衍生物的制備

實(shí)施例4：

攜帶硫醇的安絲菌素衍生物6通過美登醇與28的4,4-二甲基吡啶(DMAP)催化的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)偶聯(lián)、然后使用二硫蘇糖醇進(jìn)行二硫化物還原而制備。

實(shí)施例5：

攜帶硫醇的安絲菌素衍生物19通過美登醇與37的4,4-二甲基吡啶(DMAP)催化的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)偶聯(lián)、然后使用二硫蘇糖醇進(jìn)行二硫化物還原而制備。

實(shí)施例6：

攜帶硫醇的安絲菌素衍生物23通過美登醇與34的4,4-二甲基吡啶(DMAP)催化的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)偶聯(lián)、然后使用二硫蘇糖醇進(jìn)行二硫化物還原而制備。

實(shí)施例7：

攜帶硫醇的安絲菌素衍生物18通過美登醇與39的4,4-二甲基吡啶(DMAP)催化的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)偶聯(lián)、然后使用二硫蘇糖醇進(jìn)行二硫化物還原而制備。

實(shí)施例8：

攜帶硫醇的安絲菌素衍生物17通過美登醇與42的4,4-二甲基吡啶(DMAP)催化的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)偶聯(lián)、然后使用二硫蘇糖醇進(jìn)行二硫化物還原而制備。

實(shí)施例9：

攜帶硫醇的安絲菌素衍生物20通過美登醇與44的DMAP催化的偶聯(lián)、然后使用二硫蘇糖醇進(jìn)行二硫化物還原而制備。

實(shí)施例10：

攜帶硫醇的安絲菌素衍生物21通過美登醇與43的DMAP催化的偶聯(lián)、然后使用二硫蘇糖醇進(jìn)行二硫化物還原而制備。

實(shí)施例11：

安絲菌素衍生物9通過美登醇與3氧代丙酸48的DMAP催化的DCC偶聯(lián)而制備(Yamada,E.M.等人J.Biol.Chem.1959 234,941-945)。

實(shí)施例12：

安絲菌素衍生物8通過美登醇與3-氧代丁酸49的DMAP催化的DCC偶聯(lián)而制備。

實(shí)施例13：

安絲菌素衍生物15通過美登醇與50的DMAP催化的DCC偶聯(lián)、然后用嗎啉進(jìn)行FMoc脫保護(hù)而制備。

實(shí)施例14：

安絲菌素衍生物16通過美登醇與51Fmoc-β-丙氨酸的DMAP催化的DCC偶聯(lián)、然后用嗎啉進(jìn)行FMoc脫保護(hù)而制備。

實(shí)施例15：

安絲菌素衍生物13a,b如下制備(參見圖11)。

美登醇的己二酸-1-[2-三甲基甲硅烷基)乙基]酯(14a)。

在室溫下向己二酸-1[2-三甲基甲硅烷基)乙基]酯(523.0mg,2.12mmol)、CH₂Cl₂(2mL)的溶液加入二環(huán)己基碳二亞胺(438mg,2.124mmol)、4-二甲基氨基吡啶(86.0mg,0.708mmol)和美登醇(200.00mg,0.354mmol)。2h后，過濾反應(yīng)物并且真空濃縮。通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC來分離產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并并且真空濃縮以得到32.0mg(11％收率)的所需產(chǎn)物。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,815.3；實(shí)測(cè)值，815.2

美登醇的己二酸酯(14b)。

向含有美登醇的己二酸-1[2-三甲基甲硅烷基)乙基]酯酯(30mg,0.038mmol)在THF(378μL)中的溶液的冰水冷卻的燒瓶中加入1M四丁基氟化銨在四氫呋喃(45.4μL,0.045mmol)中的溶液。冷卻浴且經(jīng)6h后用飽和氯化銨淬滅反應(yīng)物、用EtOAC萃取，用鹽水洗滌，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥并且真空濃縮。通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC來分離產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并并且真空濃縮以得到5.4mg(21％收率)的所需產(chǎn)物。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.82(s,3H),1.35-1.17(m,4H),1.54-1.39(m,2H),1.61(d,J＝13.7Hz,1H),1.68(s,3H),1.82-1.70(m,2H),2.20(d,J＝11.9Hz,2H),2.36(d,J＝11.1Hz,3H),2.61-2.50(m,2H),2.77-2.63(m,2H),2.91(d,J＝9.7Hz,1H),3.16(s,1H),3.19(s,3H),3.37(s,3H),3.51(dd,J＝17.7,11.0Hz,1H),3.72(dd,J＝14.1,7.0Hz,1H),3.99(s,3H),4.29-4.21(m,1H),4.88(d,J＝9.1Hz,1H),5.53(dd,J＝15.5,8.8Hz,1H),6.16(d,J＝10.6Hz,1H),6.42(dd,J＝15.3,10.9Hz,1H),6.63(s,1H),6.79(s,1H),6.84(s,1H)。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,715.3；實(shí)測(cè)值，715.3

美登醇的己二酸酯的N-羥基琥珀酰亞胺(13)。

在室溫下向美登醇的己二酸酯(5mg,7.21μmol)在CH₂Cl₂(1mL)中的溶液加入N-羥基琥珀酰亞胺(4.15mg,0.036mmol)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(6.91mg,0.036mmol)。24h后 在真空下除去溶劑并且通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC純化殘余物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分直接冷凍并且凍干以得到0.91mg(16％收率)的所需產(chǎn)物。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,812.3；實(shí)測(cè)值，812.3

實(shí)施例16.如下制備含硫醇的安絲菌素6(參見圖5)。

美登醇的3-(甲基二硫代)丙酸酯(45)。

在室溫下向3-(甲基二硫代)丙酸(323.0mg,2.12mmol)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液加入二環(huán)己基碳二亞胺(438mg,2.124mmol)、4-二甲基氨基吡啶(89.3mg,0.731mmol)和美登醇(197.0mg,0.348mmol)。2h后過濾反應(yīng)物并且真空濃縮。用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC純化產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并且真空濃縮以得到93.6mg(38％收率)的所需產(chǎn)物。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ0.85(s,3H),1.24(d,J＝13.7Hz,1H),1.28(d,J＝6.4Hz,3H),1.53-1.41(m,1H),1.63(d,J＝13.6Hz,2H),1.68(s,3H),2.19(dd,J＝13.9,2.6Hz,1H),2.43-2.40(m,1H),2.44(m,2H),2.52(dd,J＝13.9,12.0Hz,1H),2.87-2.77(m,2H),2.89(dd,J＝8.5,4.9Hz,1H),3.02-2.94(m,3H),3.18(s,3H),3.36(s,3H),3.52(d,J＝8.9Hz,1H),3.56(d,J＝12.9Hz,1H),3.99(s,3H),4.24(t,J＝11.3Hz,1H),4.96(dd,J＝11.9,2.7Hz,1H),5.61(dd,J＝15.4,8.9Hz,1H),6.27(d,J＝11.0Hz,1H),6.34(s,1H),6.45(dd,J＝15.4,11.1Hz,1H),6.80(d,J＝1.7Hz,1H),6.84(d,J＝1.7Hz,1H)。¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ12.08,14.51,15.76,22.16,22.72,24.70,31.25,33.41,34.24,35.68,38.34,47.15,56.58,56.72,60.34,66.18,74.47,81.09,88.08,113.02,119.44,122.28,124.49,128.09,132.47,140.09,141.58,142.51,149.10,152.32,168.52,170.51。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,721.2；實(shí)測(cè)值，721.2。

美登醇的3-硫代丙酸酯(6)。

在室溫下向美登醇的3-(甲基二硫代)丙酸酯(45mg,0.064mmol) 在1,2-二甲氧基乙烷(3mL)中的溶液加入D,L-二硫蘇糖醇(49.6mg,0.322mmol)在100mM碳酸鉀、2mM EDTA,pH 7.5緩沖液(3.00mL)中的溶液。1h后將反應(yīng)物體積真空減至約其原體積的1/2并且通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC來分離產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分直接冷凍并且凍干以得到4.0mg(9.5％收率)的所需產(chǎn)物6。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,675.2；實(shí)測(cè)值，675.2。

實(shí)施例16.如下制備含硫醇的安絲菌素55(參見圖13a)。

6-(甲基二硫代)己酸(53)。

向含有6-巰基己酸(500.0mg,3.37mmol)在去離子水(2mL)中的溶液的冷水浴冷卻的燒瓶中加入S-甲基硫代磺酸甲酯(468mg,3.71mmol)在乙醇(1mL)中的溶液。16小時(shí)后將反應(yīng)物用飽和氯化鈉(400mL)稀釋并且用乙醚(3x150mL)萃取。將合并的萃取物用飽和NaCl(100mL)洗滌，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥并且真空濃縮。通過用乙酸乙酯/己烷/乙酸(40:58:2)洗脫的硅膠色譜純化產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并且真空濃縮以得到482mg(73％收率)的所需產(chǎn)物。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,217.3；實(shí)測(cè)值，217.3

美登醇的6-(甲基二硫代)己酸酯(54)。

在室溫下向6-(甲基二硫代)己酸(413.0mg,2.12mmol)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液加入二環(huán)己基碳二亞胺(438mg,2.124mmol)、4-二甲基氨基吡啶(86.0mg,0.708mmol)和美登醇(200.00mg,0.354mmol)中的溶液。2h后過濾反應(yīng)物并且真空濃縮。產(chǎn)物通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC來分離。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并且真空濃縮以得到36.7mg(14％收率)的所需產(chǎn)物。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,763.3；實(shí)測(cè)值，763.3。

美登醇的6-巰基己酸酯(55)。

在室溫下向美登醇的6-(甲基二硫代)己酸酯(30.0mg,0.040mmol) 在1,2-二甲氧基乙烷(3mL)中的溶液加入D,L-二硫蘇糖醇(31.2mg,0.202mmol)在100mM磷酸鉀、2mM EDTA,pH 7.5緩沖液(3.00mL)中的溶液。4h后將反應(yīng)物體積真空濃縮至約2/3體積并且通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的半制備型C18HPLC來分離產(chǎn)物。收集后直接冷凍產(chǎn)物級(jí)分并且凍干以得到12.55mg(44％收率)的所需產(chǎn)物55。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,717.3；實(shí)測(cè)值，717.3。

實(shí)施例17如下制備含硫醇的安絲菌素58(參見圖13b)。

2-(甲基二硫代)丙酸(56)。

分批向2-巰基丙酸(2.0mL,22.55mmol)在水(50.0mL)中的溶液加入碳酸鈉(4.77g,45.00mmol)，同時(shí)避免過度起泡。之后在室溫下緩慢加入S-甲基硫代磺酸甲酯(2.77mL,29.3mmol)在乙醇(50.0mL)中的溶液。2h后將反應(yīng)物體積真空減至約其原體積的1/2，然后使用1M HCl酸化至pH～2并用乙酸乙酯萃取(2x 250mL)。將有機(jī)萃取液合并，用鹽水洗滌并且真空濃縮以得到粗油狀物，其通過用己烷：乙酸乙酯：乙酸(50:49:1)的混合物洗脫的硅膠色譜純化。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并且真空濃縮以得到2.3g(67％收率)的所需產(chǎn)物。1H NMR(CDCl₃)δ1.520(3H，d,J＝7.2Hz),2.446(3H，s)和3.559(1H，m)ppm。

美登醇的2-(甲基二硫代)丙酸酯(57)。

向2-(甲基二硫代)丙酸(303.3mg,1.992mmol)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液加入二環(huán)己基碳二亞胺(438mg,2.124mmol)、4-二甲基氨基吡啶(86mg,0.708mmol)和美登醇(200.0mg,0.354mmol)。1h后加入乙酸乙酯(20mL)并過濾混合物，相繼用飽和碳酸氫鈉(10mL)和鹽水(5mL)洗滌，然后經(jīng)無水Na₂SO₄干燥并且真空濃縮。通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC來分離產(chǎn)物。收集含有產(chǎn)物的級(jí)分，合并且真空濃縮以得到8.53mg(3.3％收率)的所需產(chǎn)物。¹H NMR(CDCl₃,ref.7.26ppm)δ0.821(3H，s),1.288(3H，d,J＝6.4Hz),1.455(1H，m),1.650(1H，d J＝4Hz),1.679(3H，d,J＝3.2Hz), 1.693(3H，s),1.782(1H，d,J＝7.2Hz),2.245(1H，dd,J＝11.6,J＝2.4Hz),2.494(3H，s),2.573(1H，dd,J＝11.6,J＝2Hz),2.877(1H，m),3.186(3H，s),3.359(3H，s),3.511(3H，m),3.645(1H，m),3.987(3H，s),4.265(1H，m),4.914(1H，dd,J＝9.2,J＝3.2Hz),5.539(1H，dd,J＝11.6,J＝6.4Hz),6.158(1H，d,J＝11.2),6.308(1H，s),6.422(1H，dd,J＝10.8,J＝4.4Hz),6.834(1H，s)和6.905(1H，d,J＝1.6Hz)。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,721.2；實(shí)測(cè)值，721.2。MS計(jì)算值(M+Cl)^-,733.2；實(shí)測(cè)值，735.1。

美登醇的2-(硫代)丙酸酯(58)。

在室溫下向美登醇的2-(甲基二硫代)丙酸酯(8mg,0.011mmol)在1,2-二甲氧基乙烷(1mL)中的溶液加入D,L-二硫蘇糖醇(5.29mg,0.034mmol)在100mM磷酸鉀、2mM EDTApH 7.5緩沖液(1.000mL)中的溶液。90min后將反應(yīng)物體積真空減至干燥并且通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的C18HPLC純化。將含有產(chǎn)物的級(jí)分直接冷凍并凍干以得到1.6mg(18％收率)的所需產(chǎn)物。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,675.2；實(shí)測(cè)值，676.2。MS計(jì)算值(M-H)^-,651.1；實(shí)測(cè)值，651.2.

實(shí)施例18：

安絲菌素衍生物13a通過37與N-羥基琥珀酰亞胺的DCC偶聯(lián)而制備。

實(shí)施例19：

安絲菌素13b通過37與磺基-N-羥基琥珀酰亞胺的DCC偶聯(lián)而制備。

實(shí)施例20：

如下制備安絲菌素衍生物22。使30的羥基半族與甲磺酰氯反應(yīng) 以得到甲磺酸酯52。在低溫下將美登醇在四氫呋喃中的溶液用丁基鋰脫質(zhì)子并且插入到52的溶液以形成醚鍵，然后將二硫化物半族用DTT切割。

實(shí)施例21.通過二硫化物連接子將抗體與攜帶巰基的安絲菌素衍生物偶聯(lián)

通過前述的方法將抗體偶聯(lián)到本發(fā)明的攜帶巰基的安絲菌素衍生物的數(shù)個(gè)分子上(W.C.Widdison等人，J.Med.Chem.,2006,49,4392-4408)，這在本文被描述。首先將人源化抗體用含有胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)(NHS基團(tuán))和硫醇反應(yīng)性2-吡啶基二硫代基團(tuán)(-SSPy基團(tuán))的異雙官能連接子(SPDB、SPP、SPDP)修飾以并入每分子抗體的數(shù)個(gè)分子(例如1至10)的連接子。此后，將攜帶反應(yīng)性硫醇基團(tuán)的安絲菌素衍生物加至連接子修飾的抗體以通過二硫鍵偶聯(lián)安絲菌素衍生物與抗體。

在具體實(shí)施例中，在室溫下使用3至15倍摩爾過量的異雙官能連接子例如SPDB、SPP和SPDP在pH 6.5-8的含水緩沖液中修飾濃度5-10mg/ml的人源化抗體0.25-3h并且通過凝膠過濾(使用例如，Sephadex G25色譜)純化以獲得用每抗體分子平均3-15個(gè)連接子基團(tuán)修飾的抗體。通過在將過量的1,4-二硫蘇糖醇(DTT)試劑添加到少量等分試樣的連接子修飾的抗體樣品時(shí)根據(jù)2-硫代吡啶酮在343nm的吸光度(ε_343nm＝8080M^-1cm^-1)測(cè)量其的釋放來評(píng)估所連接的基團(tuán)。測(cè)量抗體上所連接的反應(yīng)性基團(tuán)的數(shù)目后，將連接子修飾的抗體與過量的攜帶硫醇的安絲菌素衍生物(通常每反應(yīng)性連接子基團(tuán)1.0-2.5倍摩爾過量的攜帶硫醇的安絲菌素衍生物)在約2.5mg/mL的抗體濃度下(pH 6.5-8)偶聯(lián)，反應(yīng)時(shí)間為2-24小時(shí)。通過凝膠過濾或透析純化抗體-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物以除去未反應(yīng)的安絲菌素衍生物。根據(jù)252nm和280nm下的吸光度測(cè)量并且使用安絲菌素衍生物和抗體在252nm和280nm下的吸光系數(shù)，測(cè)定純化的偶聯(lián)物中每抗體分子所連接的安絲菌素衍生物的數(shù)目(圖13,m＝1至10)。

實(shí)施例22.通過不可切割的硫醚連接子將抗體與每抗體分子所連接的數(shù)個(gè)攜帶巰基的安絲菌素衍生物分子偶聯(lián)

硫醚連接的抗體-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物可用兩步工藝制備。用攜帶胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)(NHS基團(tuán))和硫醇反應(yīng)性順丁烯酰二亞胺基、乙烯基吡啶、乙烯砜、乙烯基磺酰胺或基于鹵代乙?；幕鶊F(tuán)的異雙官能交聯(lián)劑修飾人源化抗體以并入抗體分子中的數(shù)個(gè)連接子分子。包含基于順丁烯酰二亞胺基的半族的交聯(lián)劑包括4-(順丁烯酰二亞胺基甲基)環(huán)己烷羧酸N-琥珀酰亞胺基酯(SMCC)、為SMCC“長(zhǎng)鏈”類似物的N-琥珀酰亞胺基-4-(N-順丁烯酰二亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LC-SMCC)、κ-順丁烯酰二亞胺基十一酸N-琥珀酰亞胺基酯(KMUA)、γ-順丁烯酰二亞胺基丁酸N-琥珀酰亞胺基酯(GMBS)、ε-順丁烯酰二亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)、間-順丁烯酰二亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N-(α-順丁烯酰二亞胺基乙酰氧基)-琥珀酰亞胺酯(AMAS)、琥珀酰亞胺基-6-(β-順丁烯酰二亞胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、4-(對(duì)順丁烯酰二亞胺基苯基)-丁酸N-琥珀酰亞胺基酯(SMPB)和N-(對(duì)順丁烯酰二亞胺基苯基)異氰酸酯(PMPI)。描述了含有乙烯基吡啶的硫醇反應(yīng)性的化合物(Friedman M.等人Int.J.Peptide Protein Res.1974,6,183-185；Mak A.等人Anal.Biochem.1978,84,432-440)。已描述了含有乙烯砜半族的硫醇反應(yīng)性的化合物(Masri M.S.J.Protein Chem..1988,7,49-54；Morpurgo,M.等人Bioconjugate Chem.1996,7,363-368)。包含基于鹵代乙?；陌胱宓慕宦?lián)試劑包括N-琥珀酰亞胺基-4-(碘乙?；?-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(SIA)、溴乙酸N-琥珀酰亞胺基酯(SBA)和3-(溴乙酰氨基)丙酸N-琥珀酰亞胺基酯(SBAP)。

在室溫下用在含水緩沖液(pH 6.5-8)中過量的5-10mg/mL的異雙官能交聯(lián)劑修飾抗體0.25-3h，然后通過G25色譜純化。使用少量等分試樣的連接子修飾的抗體并且添加已知的高于順丁烯二酰亞胺或鹵代乙?；鶟舛鹊倪^量硫醇(例如2-巰基乙醇)，測(cè)定經(jīng)修飾的抗體上 連接的順丁烯二酰亞胺或鹵代乙?；鶊F(tuán)的數(shù)目。將硫醇與經(jīng)修飾的抗體上引入的順丁烯二酰亞胺或鹵代乙酰基基團(tuán)反應(yīng)并且通過使用DTNB試劑的Ellman測(cè)定(412nm下TNB硫醇鹽的吸光系數(shù)＝14150M^-1cm^-1；Riddles,P.W.等人，Methods Enzymol.,1983,91,49-60；Singh、R.,Bioconjugate Chem.,1994,5,348-351)測(cè)量過量硫醇。測(cè)量抗體上所連接的反應(yīng)性基團(tuán)的數(shù)目之后，將連接子修飾的抗體與過量的攜帶硫醇的安絲菌素衍生物(通常每反應(yīng)性連接子基團(tuán)1.0-2.5倍摩爾過量的攜帶硫醇的安絲菌素衍生物)在約2.5mg/mL的抗體濃度下(pH6.5-8)偶聯(lián)，反應(yīng)時(shí)間2-24小時(shí)。通過凝膠過濾或透析純化不可切割的抗體-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物以除去未反應(yīng)的安絲菌素衍生物。根據(jù)252nm和280nm下的吸光度測(cè)量并且使用安絲菌素衍生物和抗體在252nm和280nm下的吸光系數(shù)，測(cè)定純化的偶聯(lián)物中每抗體分子所連接的不可切割的安絲菌素衍生物分子的數(shù)目(圖14,15，m＝1至10)。

實(shí)施例23.抗體與每抗體分子連接的數(shù)個(gè)胺反應(yīng)性安絲菌素衍生物分子的偶聯(lián)

可通過用本發(fā)明的胺反應(yīng)性安絲菌素衍生物修飾人源化抗體上的賴氨酸殘基，以一步工藝制備抗體-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物。如在本說明書中所述，制備攜帶胺反應(yīng)性基團(tuán)例如N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)(NHS基團(tuán))的安絲菌素衍生物。最初用數(shù)個(gè)過量的胺反應(yīng)性安絲菌素衍生物滴定抗體，以測(cè)定所需的安絲菌素衍生物對(duì)抗體的比率，通常該范圍為人源化抗體的6-10倍摩爾過量。

在一步工藝中，在室溫下將人源化抗體與濃度5-10mg/mL的過量的攜帶胺反應(yīng)性NHS基團(tuán)的安絲菌素衍生物在含水緩沖液(pH6.0-8.0)中反應(yīng)1-24h。通過凝膠色譜、然后透析來純化抗體-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物。通過測(cè)量偶聯(lián)物在252nm和280nm下的吸光度并且使用安絲菌素衍生物和抗體在這兩個(gè)波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)，測(cè)定最終偶聯(lián)物中每抗體分子所連接的安絲菌素衍生物分子的數(shù)目(圖19，m＝ 1至10)。

實(shí)施例24.使用酸不穩(wěn)定性連接子將抗體與每抗體分子所連接的數(shù)個(gè)安絲菌素衍生物分子偶聯(lián)

在偶聯(lián)抗體與數(shù)個(gè)分子的本發(fā)明的攜帶羰基基團(tuán)的安絲菌素衍生物的兩步工藝中，首先用過量的商購(gòu)可得的含有胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)(NHS基團(tuán))和羰基反應(yīng)性肼基團(tuán)的異雙官能連接子修飾人源化抗體，以并入抗體分子中數(shù)個(gè)分子的連接子。此類商購(gòu)可得的交聯(lián)劑的實(shí)例包括琥珀酰亞胺基6-肼基煙酰胺丙酮腙(SANH)、4-肼基對(duì)苯二甲酸琥珀酰亞胺基酯鹽酸鹽(SHTH)和煙酸琥珀酰亞胺基肼鹽酸鹽(SHNH)。經(jīng)修飾的抗體然后與過量的攜帶酮或醛的安絲菌素衍生物反應(yīng)以通過酸不穩(wěn)定性鍵偶聯(lián)安絲菌素衍生物與抗體。

攜帶酸不穩(wěn)定鍵的偶聯(lián)物也可使用本發(fā)明的攜帶肼的安絲菌素衍生物來制備。與上述的兩步工藝類似，用商購(gòu)可得的攜帶胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)和肼反應(yīng)性羰基基團(tuán)的異雙官能交聯(lián)劑修飾人源化抗體。此類交聯(lián)劑的實(shí)例包括琥珀酰亞胺基-對(duì)甲?；郊姿狨?SFB)和琥珀酰亞胺基-對(duì)甲?；窖趸宜狨?SFPA)。連接子修飾的抗體然后與過量的攜帶肼的安絲菌素衍生物反應(yīng)以得到通過酸不穩(wěn)定性鍵連接的抗體-安絲菌素衍生物偶聯(lián)物(圖20-22,m＝1to 10)。

實(shí)施例25.如下制備胺反應(yīng)性安絲菌素衍生物13a(參見圖11)。

美登醇的己二酸-1-[三甲基甲硅烷基)乙基]酯(14a)。

反應(yīng)燒瓶裝有6-氧代-6-(2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)己酸(523mg,2.124mmol)、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(438mg,2.124mmol)和二氯甲烷(2.5mL)。將4-二甲基氨基吡啶(86mg,0.708mmol)加至攪拌的溶液，然后添加美登醇(200mg,0.354mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)物4h。繼續(xù)進(jìn)行4H后，將粗反應(yīng)混合物離心并且真空濃縮。將所得粗油狀物通過半制備型C18HPLC純化以得到32mg 14a，收率為11.4％。 HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：815.3299,計(jì)算值：815.3312 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.84(s,1H),6.77(s,1H),6.43(dd,J＝15.3,11.0Hz,1H),6.32(s,1H),6.17(d,J＝10.9Hz,1H),5.52(dd,J＝15.4,8.9Hz,1H),4.89(dd,J＝11.9,2.8Hz,1H),4.24(t,J＝10.5Hz,1H),4.15(m,2H),3.99(s,3H),3.52(m,2H),3.37(s,3H),3.22(s,2H),3.17(m,1H),3.16(s,3H),2.87(d,J＝9.7Hz,1H),2.49(m,2H),2.34(m,2H),2.18(dd,J＝13.9,2.7Hz,1H),2.00(s,3H),1.68(s,3H),1.63(d,J＝13.6Hz,1H),1.46(m,1H),1.27(d,J＝6.3Hz,3H),1.22(m,1H),0.97(m,2H),0.83(s,3H),0.03(s,9H)。

美登醇的己二酸酯(14b)。

將三甲基甲硅烷基-保護(hù)的安絲菌素衍生物14a(30mg,0.038mmol)溶解于四氫呋喃(0.38mL)中并冷卻至0℃。一旦冷卻，就用四氫呋喃中的1M四丁基氟化銨(0.045mL,0.045mmol)處理反應(yīng)物。除去冷卻浴并且將反應(yīng)物升至室溫，并攪拌6h。然后將反應(yīng)物用飽和氯化銨淬滅，萃取到乙酸乙酯中，用鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥并且真空濃縮。通過半制備型C18HPLC純化粗產(chǎn)物以得到5.4mg的所需羧酸安絲菌素衍生物14b，收率為20.6％。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：715.2593,計(jì)算值：715.2604 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.84(s,1H),6.79(s,1H),6.63(s,1H),6.42(dd,J＝15.3,10.9Hz,1H),6.16(d,J＝10.6Hz,1H),5.53(dd,J＝15.5,8.8Hz,1H),4.88(d,J＝9.1Hz,1H),4.26(t,J＝10.9Hz,1H),3.99(s,3H),3.72(m,2H),3.51(m,1H),3.37(s,3H),3.19(s,3H),2.91(d,J＝9.7Hz,1H),2.71(m,1H),2.53(m,1H),2.41(m,3H),2.20(d,1H),2.01(s,3H),1.73(m,2H),1.68(s,3H),1.61(d,J＝13.7Hz,1H),1.46(m,1H),1.26(m,3H),0.82(s,3H)。

美登醇的己二酸酯的N-羥基琥珀酰亞胺(13a)。

反應(yīng)燒瓶裝有14b(5mg,0.007mmol)和二氯甲烷(1mL)。相繼地將N-羥基琥珀酰亞胺(4.15mg,0.036mmol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨 基丙基)碳二亞胺(6.91mg,0.036mmol)加至攪拌的反應(yīng)混合物。反應(yīng)在室溫下繼續(xù)進(jìn)行過夜。完成后，將反應(yīng)物體積真空濃縮并且通過半制備型C18HPLC純化產(chǎn)物。收集含有產(chǎn)物的級(jí)分，冷凍并凍干以得到0.91mg所需的攜帶N-羥基琥珀酰亞胺基酯基團(tuán)的安絲菌素衍生物13a，收率為15.9％。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：812.2763,計(jì)算值：812.2768。

實(shí)施例26.如下制備含硫醇的安絲菌素衍生物6(參見圖5)。

美登醇的3-(甲基二硫代)丙酸酯(45)。

反應(yīng)燒瓶裝有3-巰基丙酸(28,318mg,2.088mmol)、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(431mg,2.088mmol)和二氯甲烷(2.0mL)。當(dāng)相繼加入4-二甲基氨基吡啶(85mg,0.696mmol)和美登醇(197mg,0.348mmol)時(shí)攪拌溶液。在室溫下將反應(yīng)物攪拌2h。2h后，將反應(yīng)物過濾以除去沉淀并且真空濃縮。通過半制備型C18HPLC分離產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并且濃縮至干以得到93mg(38.4％)的化合物45。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：763.2448,計(jì)算值：763.2460.¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.84(s,1H),6.82(s,1H),6.45(dd,J＝15.4,11.1Hz,1H),6.32(s,1H),6.19(d,J＝11.0Hz,1H),5.54(dd,J＝15.4,8.8Hz,1H),4.98(dd,J＝11.9,2.6Hz,1H),4.23(t,J＝11.2Hz,1H),3.99(s,3H),3.52(t,J＝12.1Hz,2H),3.37(s,3H),3.20(m,2H),3.16(s,3H),2.89(m,2H),2.83(d,J＝9.7Hz,1H),2.70(m,2H),2.52(m,1H),2.20(dd,J＝13.9,2.4Hz,1H),1.72(m,1H),1.68(s,3H),1.62(d,J＝13.5Hz,2H),1.48(m,1H),1.28(d,J＝6.3Hz,3H),1.23(d,J＝13.5Hz,1H),0.84(s,3H)。

¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.65,168.66,152.46,149.47,142.65,140.20,128.24,124.63,122.42,119.58,113.16,88.22,81.24,74.46,66.32,60.48,56.86,56.73,47.29,38.48,35.83,34.38,33.55,32.93,31.39,24.86,22.87,22.31,15.90,14.76,14.65,12.22.

美登醇的3-硫代丙酸酯(6)。

在裝備有攪拌棒的10mL圓底燒瓶中，制備45(45mg,0.064mmol)在1,2-二甲氧基乙烷(3mL)中的溶液。然后加入D,L-二硫蘇糖醇(49.6mg,0.322mmol)在磷酸緩沖液(pH 7.5)(3mL,100mM磷酸鉀，2mM EDTA)中的溶液。反應(yīng)燒瓶裝備有隔片并且在室溫于氬氣氣氛下伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)直到完成。將反應(yīng)物體積真空濃縮并且通過半制備型C18純化來分離產(chǎn)物。在進(jìn)行化合物洗脫后將含有產(chǎn)物的級(jí)分冷凍，并且凍干以得到4mg(9.5％收率)的化合物6，為白色固體。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：675.2092,計(jì)算值：675.2114 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.84(s,1H),6.77(s,1H),6.43(dd,J＝15.3,11.0Hz,1H),6.32(s,1H),6.17(d,J＝10.9Hz,1H),5.52(dd,J＝15.4,8.9Hz,1H),4.89(dd,J＝11.9,2.8Hz,1H),4.24(t,J＝10.5Hz,1H),4.15(m,2H),3.99(s,3H),3.52(dd,J＝16.5,11.0Hz,1H),3.37(s,3H),3.20(m,2H),3.16(s,3H),2.87(d,J＝9.7Hz,1H),2.51(m,1H),2.34(m,2H),2.18(dd,J＝13.9,2.7Hz,1H),1.68(s,3H),1.63(d,J＝13.6Hz,1H),1.46(m,1H),1.27(d,J＝6.3Hz,2H),1.22(m,1H),0.97(m,1H),0.83(s,3H)。¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ170.35,168.71,156.18,152.32,142.66,140.37,140.14,132.55,128.14,124.48,122.33,119.61,113.15,88.26,81.21,77.30,74.42,66.16,60.49,56.88,56.72,47.31,38.67,38.48,35.85,35.81,32.95,19.84,15.93,14.65,12.27.

實(shí)施例27.如下制備含硫醇的安絲菌素58(參見圖13B)。

2-(甲基二硫代)丙酸(56)。

向裝備有攪拌棒的圓底燒瓶裝入2-巰基丙酸(1.99mL,2.39g,22.55mmol)和水(50.0mL)。當(dāng)將碳酸鈉(4.77g,45.00mmol)緩慢加至反應(yīng)燒瓶時(shí)攪拌溶液。分開地，在乙醇(50.0mL)中制備甲基硫代磺酸甲酯(2.77mL,29.3mmol)的溶液并且將其緩慢加至攪拌的反應(yīng)溶液中。在室溫于氬氣氣氛下繼續(xù)進(jìn)行2h。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物體積真空減至原體積的1/2。使用1M HCl將剩余的水溶液酸化至pH 2并且用乙酸乙酯(2x 250mL)萃取。將有機(jī)萃取液合并，用鹽水洗滌并 且真空濃縮以得到粗油狀物。通過用己烷：乙酸乙酯：乙酸(50:49:1)的混合物洗脫的硅膠色譜純化產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并且真空濃縮以得到2.3g純化的56，為無色油狀物，收率為67％。1H NMR(CDCl₃)δ1.520(3H，d,J＝7.2Hz),2.446(3H，s),3.559(1H，m)。

美登醇的2-(甲基二硫代)丙酸酯(57)。

圓底燒瓶裝有2-(甲基二硫代)丙酸(56,303.3mg,1.992mmol)、二氯甲烷(2mL)和攪拌棒。當(dāng)攪拌溶液時(shí)，加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(438mg,2.124mmol)，然后相繼加入4-二甲基氨基吡啶(86mg,0.708mmol)和美登醇(200.0mg,0.354mmol)。燒瓶裝備有隔片并且在室溫下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行。1h后將反應(yīng)物用乙酸乙酯(20mL)稀釋，過濾，相繼用飽和碳酸氫鈉溶液(10mL)和鹽水(5mL)洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥并且真空濃縮。通過用0.1％甲酸水溶液中的乙腈的線性梯度洗脫的半制備型C18HPLC來分離產(chǎn)物。收集含有產(chǎn)物的級(jí)分，合并且真空濃縮以得到8.53mg化合物57，收率為3.3％。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：721.1998,計(jì)算值：721.1991 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.91(d,J＝1.4Hz,1H),6.83(s,1H),6.42(dd,J＝15.4,11.0Hz,1H),6.31(s,1H),6.16(d,J＝10.9Hz,1H),5.54(dd,J＝15.5,9.0Hz,1H),4.91(dd,J＝12.0,3.0Hz,1H),4.26(t,J＝11.0Hz,1H),3.99(s,3H),3.65(dd,J＝14.5,7.2Hz,1H),3.51(dd,J＝10.6,7.9Hz,1H),3.36(d,J＝3.6Hz,3H),3.19(s,3H),2.86(m,1H),2.57(dd,J＝14.1,12.0Hz,1H),2.49(s,3H),2.24(m,1H),1.89(m,1H),1.78(d,J＝7.1Hz,1H),1.69(s,3H),1.68(d,J＝3.1Hz,3H),1.65(d,J＝4.1Hz,1H),1.47(m,1H),1.29(d,J＝6.2Hz,3H),1.25(s,1H),0.82(s,3H)。

美登醇的2-(硫代)丙酸酯(58)。

圓底燒瓶裝有57(8mg,0.011mmol)、1,2-二甲氧基乙烷(1mL)并且裝備有攪拌棒。分開地，在磷酸緩沖液(pH 7.5)(3mL,100mM磷酸鉀，2mM EDTA)中制備D,L-二硫蘇糖醇(5.29mg,0.034mmol)的溶 液并且將其加至反應(yīng)燒瓶。在室溫于氬氣氣氛下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行直到完成。完成后(90min.)，將反應(yīng)混合物真空蒸發(fā)至干并且通過半制備型C18HPLC純化。收集產(chǎn)物，冷凍并凍干以得到以97.1％純度分離的1.6mg化合物58，收率為18.2％。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,675.2；實(shí)測(cè)值，676.2,MS計(jì)算值(M-H)^-、651.1；實(shí)測(cè)值，651.2。

實(shí)施例28.如下制備含硫醇的安絲菌素55(參見圖13A)。

6-(甲基二硫烷基)己酸(53)。

將反應(yīng)燒瓶在冰浴中冷卻并且裝有6-巰基己酸(500mg,3.37mmol)和水(2mL)。當(dāng)加入溶解于乙醇(1mL)中的甲基硫代磺酸甲酯(468mg,3.71mmol)時(shí)攪拌溶液。在室溫于氬氣氣氛下攪拌溶液過夜。然后將反應(yīng)混合物用飽和氯化鈉(400mL)稀釋，并且萃取到醚(3x150mL)中。將合并的萃取液用氯化鈉溶液洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥并且真空濃縮。通過用己烷：乙酸乙酯：乙酸的1:0.9:0.1混合物洗脫的硅膠快速色譜法分離產(chǎn)物，以得到482mg(73.5％收率)化合物53。 ¹H NMR(CDCl₃,參考(ref.)7.26ppm)δ1.473(2H，m),1.702(4H，m),2.359(2H，t),2.405(3H，s),2.708(2H，t)。

美登醇的6-(甲基二硫代)己酸酯(54)。

反應(yīng)燒瓶裝有6-(甲基二硫烷基)己酸(53,413mg,2.124mmol)和二氯甲烷(2.0mL)。將攪拌溶液相繼用N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(438mg,2.124mmol)、4-二甲基氨基吡啶(86mg,0.708mmol)和美登醇(200mg,0.354mmol)處理。在室溫下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行過夜。過濾反應(yīng)混合物，真空濃縮，并且通過半制備型C18HPLC純化以得到36.7mg 54，收率為13.9％。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：763.2448,計(jì)算值：763.2460 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.83(s,1H),6.77(s,1H),6.44(m,1H),6.39(s,1H),6.15(d,J＝11.2Hz,1H),5.49(m,1H),4.89(dd,J＝11.8,2.6Hz,1H),4.24(t,J＝10.5Hz,1H),3.98(s,3H),3.51(m,1H),3.36(s,3H),3.20(d,1H),3.17(s,3H),2.87(m,1H),2.69(m,2H), 2.50(m,2H),2.42(s,3H),2.39(s,1H),2.39(s,1H),2.34(m,1H),2.17(d,1H),2.00(s,3H),1.72(m,6H),1.45(m,2H),1.27(d,J＝6.3Hz,3H),0.82(s,3H)。¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ172.04,168.97,159.49,156.21,152.51,151.65,142.70,140.17,132.50,128.19,124.60,122.23,113.13,88.32,81.14,74.47,66.44,60.49,56.72,47.35,44.03,38.60,38.03,35.76,34.05,32.91、28.93,27.90,25.37,24.36,23.30,22.30,15.92,14.67,12.23.

美登醇的6-巰基己酸酯(55)。

于裝備有攪拌棒的10mL圓底燒瓶中將攜帶二硫化物的安絲菌素衍生物54(30.0mg,0.040mmol)溶解于1,2-二甲氧基乙烷(3mL)中。在磷酸緩沖液(pH 7.5)(3mL,100mM磷酸鉀，2mM EDTA)中加入D,L-二硫蘇糖醇(31.2mg,0.202mmol)。反應(yīng)燒瓶裝有隔片并且在室溫于氬氣氣氛下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行3.5h。通過半制備型C18HPLC純化來分離產(chǎn)物。洗脫之后將產(chǎn)物冷凍，并且凍干以得到12.5mg(44.6％收率)的55。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：717.2563,計(jì)算值：717.2583 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.84(d,J＝1.5Hz,1H),6.77(d,J＝1.5Hz,1H),6.44(dd,J＝15.4,11.0Hz,1H),6.34(s,1H),6.16(d,J＝11.2Hz,1H),5.49(dd,J＝15.4,8.9Hz,1H),4.89(dd,J＝11.9,2.8Hz,1H),4.25(t,J＝10.5Hz,1H),3.99(s,3H),3.72(q,J＝7.0Hz,1H),3.51(m,1H),3.37(s,3H),3.21(d,J＝12.8Hz,1H),3.17(s,3H),2.88(m,1H),2.52(m,6H),2.35(m,1H),2.19(dd,J＝13.7,2.7Hz,1H),1.66(d,J＝7.3Hz,3H),1.61(m,2H),1.46(m,4H),1.36(m,1H),1.26(m,3H),0.83(s,3H)。¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ172.04,168.82,156.22,152.41,142.72,140.19,132.51,128.17,124.58,122.22,119.67,113.12,88.34,81.14,74.45,66.47,60.46,56.73,47.37,44.03,38.61,35.75,34.07,33.66,32.91、29.85,29.43,28.70,28.32,27.81、24.41,15.92,14.67,12.23。

實(shí)施例29.如下制備含硫醇的安絲菌素衍生物19(參見圖6B)。

4-((甲基二硫烷基)甲基)苯甲酸(37b)

將4-(巰基甲基)苯甲酸(36,500mg,2.97mmol)溶解于水(10mL)中并且在冰浴中冷卻。當(dāng)加入溶解于乙醇(5.00mL)中的甲基硫代磺酸甲酯(413mg,3.27mmol)時(shí)攪拌經(jīng)冷卻的溶液。添加后，去除冷卻浴并且在室溫下將反應(yīng)物攪拌過夜。繼續(xù)進(jìn)行過夜后，將反應(yīng)物用飽和氯化鈉稀釋并且用醚萃取。將合并的萃取液用氯化鈉洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，并且真空濃縮。通過使用含有1％乙酸的在己烷中的40-60％乙酸乙酯洗脫20min的硅膠快速色譜法來分離產(chǎn)物，以得到482mg的所需產(chǎn)物4-((甲基二硫烷基)甲基)苯甲酸(37b)，收率為73.5％。¹H NMR(CDCl₃)δ2.121(3H，s),3.938(2H，s),7.457(2H，d,J＝8.4Hz),8.068(2H，d,J＝8Hz)。

美登醇的4-((甲基二硫烷基)甲基)苯甲酸酯(59)。

將4-((甲基二硫烷基)甲基)苯甲酸(37b,228mg,1.062mmol)在二氯甲烷(2.0mL)中的溶液相繼用N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(219mg,1.062mmol)、4-二甲基氨基吡啶(43.2mg,0.354mmol)和美登醇(100mg,0.177mmol)處理。將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行72h，之后過濾反應(yīng)混合物，真空濃縮并且通過半制備型C18HPLC純化，以得到3.4mg化合物59(2.5％收率)。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：783.2155,計(jì)算值：783.2147 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.03(d,J＝8.2Hz,2H),7.49(d,J＝8.2Hz,2H),7.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.85(d,J＝1.5Hz,1H),6.28(dd,J＝15.4,10.9Hz,1H),6.12(s,1H),5.88(d,J＝10.8Hz,1H),5.02(dd,J＝12.0,3.3Hz,1H),4.78(dd,J＝15.4,9.1Hz,1H),4.27(t,J＝10.4Hz,1H),4.00(s,3H),3.97(s,2H),3.48(d,J＝12.9Hz,1H),3.34(d,J＝9.1Hz,1H),3.23(s,3H),3.19(s,3H),3.14(d,J＝9.6Hz,1H),2.75(t,J＝13.2Hz,1H),2.33(dd,J＝14.3,3.2Hz,1H),2.23(s,3H),1.66(s,3H),1.59(d,J＝13.3Hz,1H),1.53-1.36(m,1H),1.31(d,J＝6.3Hz,3H),1.14(t,J＝12.9Hz,2H),0.84(s,3H)。

美登醇的4-巰基甲基苯甲酸酯(19)。

10mL圓底燒瓶裝有59(3mg,0.004mmol)、1,2-二甲氧基乙烷(3mL)和攪拌棒。分開地，制備D,L-二硫蘇糖醇(3.04mg,0.020mmol)在磷酸緩沖液(pH 7.5)(3mL,100mM磷酸鉀，2mM EDTA)中的溶液并且將其加至反應(yīng)燒瓶。反應(yīng)燒瓶裝備有隔片，并且在室溫于氬氣氣氛下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行3.5h。然后將反應(yīng)物體積真空濃縮并且通過半制備型C18純化來分離產(chǎn)物。洗脫之后將含有產(chǎn)物的級(jí)分冷凍并且凍干以得到1.4mg化合物19，為白色固體(35.5％收率)。HRMS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值：737.2269，計(jì)算值：737.2270

實(shí)施例30.如下制備聚乙二醇化硫醇反應(yīng)性安絲菌素60(參見圖7B)。

美登醇的PEG₄-SPDP酯(60)。

10mL圓底燒瓶裝有是SPDP-dPEG₄-酸(Quanta Biodesign,Ltd.,Cat.#10373,100mg,0.216mmol)和二氯甲烷(2mL)。燒瓶裝備有攪拌棒并且當(dāng)加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(134mg,0.648mmol)時(shí)攪拌溶液。然后相繼加入美登醇(61.0mg,0.108mmol)和4-二甲基氨基吡啶(26.4mg,0.216mmol)。燒瓶裝備有隔片并且在室溫下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行。2.5h后過濾粗反應(yīng)混合物，真空濃縮并且通過半制備型C18HPLC純化。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并且真空濃縮以得到30mg化合物60，為澄明油狀物，收率為27％。MS計(jì)算值(M+Na)⁺,1031.3；實(shí)測(cè)值，1031.3；MS計(jì)算值(M+Cl)^-,1043.3；實(shí)測(cè)值，1043.2 ¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.43(d,J＝4.1Hz,1H),7.67(m,2H),7.08(m,1H),6.82(s,1H),6.76(d,J＝1.3Hz,1H),6.65(s,1H),6.42(dd,J＝15.4,11.0Hz,1H),6.20(d,J＝11.0Hz,1H),5.61(dd,J＝15.5,8.9Hz,1H),4.93(dd,J＝11.8,2.5Hz,1H),4.55(s,1H),4.24(t,J＝11.2Hz,1H),3.97(s,3H),3.87(m,1H),3.63(m,8H),3.50(m,3H),3.32(s,3H),3.15(s,3H),3.07(m,2H),2.81(d,J＝9.5Hz,2H),2.70(m,1H),2.62(m, 2H),2.48(m,1H),2.16(dd,J＝13.9,2.4Hz,1H),1.91(m,1H),1.69(m,2H),1.65(s,3H),1.59(m,2H),1.47(m,1H),1.32(m,2H),1.26(d,J＝6.4Hz,3H),1.10(m,4H),0.84(s,3H)。¹³C NMR(101MHz，CDCl₃)δ171.03,170.01,168.76,160.03,156.94,156.09,152.88,149.71,142.59,140.33,139.72,137.28,132.21,128.87,124.74,122.27,120.91,119.91,119.46,113.15,88.79,80.87,74.44,70.92,70.57,70.47,70.34,70.13,69.91,66.38,66.17,60.60,56.80,56.69,49.24,47.20,39.41,38.39,35.72,35.55,34.62,34.08,25.76,25.08,15.82,14.68,12.19。

實(shí)施例31.如下制備安絲菌素衍生物64a和64b(參見圖13C)。

3,7-二甲基氧雜環(huán)庚烷-2-酮(61)。

250mL圓底燒瓶裝入2,6-二甲基環(huán)己酮(2.162mL,2.0g,15.85mmol)和126mL 1:1甲醇/水混合物。當(dāng)加入單過氧酞酸鎂六水合物(MMPP,15.68g,31.7mmol)和碳酸氫鈉(2.66g,31.7mmol)時(shí)攪拌溶液。在室溫下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行。第二天，將粗產(chǎn)物萃取到乙酸乙酯中，相繼用飽和碳酸氫鈉溶液、鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，然后真空濃縮以得到1.07g(47.5％收率)的3,7-二甲基氧雜環(huán)庚烷-2-酮(61)，為澄明無色油狀物。

6-巰基-2-甲基庚酸(62)。

裝備有攪拌棒的10mL圓底燒瓶裝有3,7-二甲基氧雜環(huán)庚烷-2-酮(61,0.729g,5.13mmol)、氫碘酸(2.029ml,15.38mmol)和硫脲(2.73g,35.91mmol)。燒瓶裝有冷卻水的水冷凝器，置于氮?dú)鈿夥障虏⒓訜嶂粱亓?。在回流下將反?yīng)繼續(xù)進(jìn)行過夜。然后將在水(5mL)中的氫氧化鈉(3.69g,92mmol)溶液加至反應(yīng)燒瓶。將反應(yīng)物回流過夜。將反應(yīng)混合物從熱移除，冷卻至室溫，并且將燒瓶?jī)?nèi)容物轉(zhuǎn)移至分液漏斗。將水層用乙酸乙酯萃取并且將萃取液放一邊靜置。將水層用HCl酸化至pH 2并且用乙酸乙酯(2x 100mL)和二氯甲烷(1x 100mL)萃取。將有機(jī)萃取液合并，用30mL鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥并且真空濃 縮以得到823mg粗6-巰基-2-甲基庚酸(62,92％收率)，為淺褐色油狀物。

2-甲基-6-(甲基二硫烷基)庚酸(63)。

100mL圓底燒瓶裝有粗6-巰基-2-甲基庚酸(62,832.3mg,4.72mmol)和水(30mL)。將碳酸鈉(1.001g,9.44mmol)加至攪拌溶液。分開地，在乙醇(30mL)中制備甲基硫代磺酸甲酯(0.668mL,7.08mmol)的溶液并且將其緩慢加至攪拌的反應(yīng)混合物。添加完成后，將反應(yīng)燒瓶裝備有隔片并且在氬氣氣氛下放置。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3h。

3h后將反應(yīng)物體積真空減半。將剩余的水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗并且用乙酸乙酯(2x 40mL)萃取兩次。當(dāng)用濃HCl將水相酸化至pH 2時(shí)將有機(jī)萃取液放一邊靜置。酸化后，將水相用乙酸乙酯(3x 70mL)萃取。合并有機(jī)萃取液并且將產(chǎn)物反萃取到飽和碳酸氫鈉(3x100mL)中。合并含水萃取液并且用濃HCl將其酸化至pH 2。然后將經(jīng)酸化的水相轉(zhuǎn)移到分液漏斗，并且將產(chǎn)物萃取到乙酸乙酯(3x 100mL)中。將有機(jī)萃取液合并，用50mL鹽水洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，并且真空濃縮以得到粗黃色油狀物。通過用己烷：乙酸乙酯：乙酸的66:33:1混合物洗脫的硅膠色譜法來純化產(chǎn)物。將含有產(chǎn)物的級(jí)分合并并且真空濃縮以得到292mg化合物63，收率為28％。¹H NMR(CDCl₃)δ1.189(3H，d,J＝7.2Hz),1.317(3H，d J＝6.4Hz),1.442-1.706(6H，m),2.392(3H，s),2.475(1H，m),2.840(1H，m)。

美登醇的2-甲基-6-(甲基二硫烷基)庚酸酯(64a和64b)。

10mL圓底燒瓶裝有美登醇(29.6mg,0.052mmol)、二氯甲烷(3mL)和攪拌棒。當(dāng)加入2-甲基-6-(甲基二硫烷基)庚酸(63,69.9mg,0.314mmol)，然后相繼加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(64.8mg,0.314mmol)和4-二甲基氨基吡啶(12.8mg,0.105mmol)時(shí)攪拌溶液。反應(yīng)燒瓶裝有隔片并且在室溫下將反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行4h。將粗反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移 至分液漏斗并且用乙酸乙酯稀釋。將有機(jī)相用兩部分的飽和碳酸氫鈉洗滌，用鹽水洗滌一次并且真空濃縮以得到粗黃色油狀物。通過半制備型C18HPLC純化產(chǎn)物。分開地收集對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物的外消旋體的兩個(gè)峰并且真空濃縮以得到總計(jì)為4.7mg的合并的所需化合物(64a:2.1mg和64b:2.6mg)。MS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值64a:791.0,計(jì)算值：791.3；(M+Cl)^-實(shí)測(cè)值64a:802.9，計(jì)算值：803.2。MS(M+Na)⁺實(shí)測(cè)值64b:791.1，計(jì)算值：791.3；(M+Cl)^-實(shí)測(cè)值64b:802.9，計(jì)算值：803.2。

實(shí)施例32.如下制備安絲菌素衍生物66(參見圖10B)。

美登醇的二甲基氨基丁酸酯(66)

反應(yīng)燒瓶裝有4-(二甲基氨基)-丁酸HCl(93.5mg,0.558mmol)、N,N-二異丙基乙胺(15.45μL,0.088mmol)和二氯甲烷(0.2mL)。然后相繼加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(110mg,0.531mmol)、4-二甲基氨基吡啶(21.62mg,0.177mmol)和美登醇(50mg,0.088mmol)。反應(yīng)燒瓶裝有隔片并且在室溫下將反應(yīng)伴隨攪拌繼續(xù)進(jìn)行72h。過濾粗反應(yīng)混合物，真空濃縮并且通過半制備型C18HPLC純化。收集含有產(chǎn)物的級(jí)分，合并并且真空濃縮以得到8.2mg(13.7％收率)化合物66。MS計(jì)算值(M+H)⁺；678.3；實(shí)測(cè)值，678.2.

實(shí)施例23.安絲菌素衍生物的體外活性

圖28-30示出本發(fā)明的各種安絲菌素衍生物抵抗KB、COLO 205和COLO 205-MDR細(xì)胞系的細(xì)胞毒性活性。攜帶二硫化物的安絲菌素衍生物45、54、57、59、64a和64b是有效的，其中抵抗KB細(xì)胞系的IC₅₀值在0.27nM至4nM的范圍內(nèi)(圖28a-d)。當(dāng)?shù)挚谷私Y(jié)腸癌細(xì)胞系COLO 205測(cè)試時(shí)，攜帶二硫化物的安絲菌素衍生物54和59顯示類似的效力，所測(cè)量的IC₅₀值分別為0.31nM和0.53nM。

抵抗KB、COLO 205和COLO 205-MDR細(xì)胞系評(píng)價(jià)合成的化合 物13a的前體—可連接的胺反應(yīng)性安絲菌素衍生物。TMS-保護(hù)的前體14a抵抗三種細(xì)胞系的活性在0.40nM(抵抗COLO 205細(xì)胞)至4.8nM(抵抗COLO 205MDR細(xì)胞系)的范圍內(nèi)。在除去TMS保護(hù)基團(tuán)之后，分離攜帶末端羧酸14b的安絲菌素衍生物并且抵抗KB細(xì)胞系體外評(píng)價(jià)。當(dāng)與TMS-保護(hù)的前體相比時(shí)，觀察到14b抵抗KB細(xì)胞系的活性下降15倍。效力的下降主要是由于荷電安絲菌素羧酸鹽的細(xì)胞滲透性較差。然而，細(xì)胞內(nèi)的遞送可通過與細(xì)胞結(jié)合劑例如單克隆抗體偶聯(lián)以增強(qiáng)效力。

所測(cè)試化合物中，二甲基氨基丁酸安絲菌素衍生物66是抵抗三種細(xì)胞系的效力最低的化合物。所測(cè)量的該化合物抵抗非-MDR細(xì)胞系的IC₅₀為11-12nM，抵抗COLO 205MDR細(xì)胞系的IC₅₀>20nM(圖30)。

實(shí)施例34.通過二硫化物連接子將抗體與攜帶巰基的安絲菌素衍生物偶聯(lián)

在DMA中制備攜帶巰基的安絲菌素衍生物55的溶液(8.4mM儲(chǔ)備液，w/v)。將儲(chǔ)備溶液在乙醇中稀釋并且相對(duì)于乙醇和DMA的試劑空白，測(cè)量280nm下的吸光度。儲(chǔ)備液55的濃度通過使用280nm下的吸光系數(shù)5,456M^-1(其是用實(shí)驗(yàn)方法確定的美登木素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù))來計(jì)算。

在室溫下，將在pH 7.5 20mM磷酸鈉、含有DMA(5％,v/v)的150mM氯化鈉緩沖液中的抗-EpCam抗體(5mg/mL)與8倍摩爾過量的SPP(10mM于DMA中)反應(yīng)3小時(shí)。然后用pH 6.5 20mM磷酸鈉、50mM氯化鈉、2mM EDTA緩沖液將經(jīng)修飾的抗體稀釋至2.5mg/m并且用每摩爾過量的在修飾反應(yīng)中所用的SPP的2倍摩爾過量的55處理。在室溫下含有DMA(7.5％,v/v)的pH 6.5緩沖液中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)20小時(shí)。然后在NAP-25(Sephadex G25)柱上純化、透析并且過濾偶聯(lián)物，所述柱在由10mM組氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗 糖(pH 5.5)組成的緩沖液中平衡。透析之后，偶聯(lián)物具有每抗體分子連接的3.8個(gè)安絲菌素分子。使用所測(cè)量的偶聯(lián)物在252nm和280nm下的吸光度以及使用已知的美登木素和抗體在這兩個(gè)波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)，測(cè)定最終偶聯(lián)物中每抗體分子的安絲菌素分子的數(shù)目。對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行SEC HPLC，顯示其在偶聯(lián)后為86％單體。

實(shí)施例34.抗體與胺反應(yīng)性安絲菌素衍生物的偶聯(lián)

在DMA中制備胺反應(yīng)性安絲菌素衍生物13a的5mM儲(chǔ)備液(w/v)。在乙醇中稀釋儲(chǔ)備溶液并且相對(duì)于乙醇和DMA的試劑空白，測(cè)量280nm下的吸光度。儲(chǔ)備液13a的濃度通過使用280nm下的吸光系數(shù)5,456M^-1(其是用實(shí)驗(yàn)方法確定的美登木素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù))來計(jì)算。

在室溫下，將抗-EpCam抗體在pH 7.5 20mM磷酸鈉、含有DMA(10％,v/v)的150mM氯化鈉緩沖液中與12倍摩爾過量的13a(2.5mg/mL)偶聯(lián)4.5小時(shí)。然后在NAP-10(Sephadex G25)柱上純化、透析并且過濾偶聯(lián)物，所述柱在由10mM組氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖(pH 5.5)組成的緩沖液中平衡。透析之后，偶聯(lián)物具有每抗體分子連接的3.3個(gè)安絲菌素分子并且未在偶聯(lián)物中檢測(cè)出游離藥物。使用所測(cè)量的偶聯(lián)物在252nm和280nm下的吸光度以及使用已知的美登木素和抗體在這兩個(gè)波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)，測(cè)定最終偶聯(lián)物中每抗體分子的安絲菌素分子的數(shù)目(圖20)。對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行SEC HPLC，顯示其在偶聯(lián)后為91％單體。

實(shí)施例35.用安絲菌素衍生物和美登木素制備的偶聯(lián)物的體外細(xì)胞毒性

體外評(píng)價(jià)用可連接的安絲菌素衍生物55和13a制備的靶向EpCam抗原的偶聯(lián)物抵抗表達(dá)EpCam的細(xì)胞系COLO 205的效力。二硫化物-連接的mAb-SPP-55偶聯(lián)物是有效且特異的，所測(cè)量的活性為0.23nM(圖31)。不可切割的安絲菌素偶聯(lián)物mAb-13a的活性比二 硫化物偶聯(lián)物略高，其IC₅₀值為0.14nM(圖31)。所測(cè)試的兩種偶聯(lián)物對(duì)所靶向的細(xì)胞系的抵抗是特異的，這由測(cè)試偶聯(lián)物對(duì)COLO 205細(xì)胞(所述COLO 205細(xì)胞在用抗-EpCam mAb-安絲菌素偶聯(lián)物孵育之前用過量的未偶聯(lián)的抗-EpCam抗體預(yù)處理)的抵抗時(shí)的活性損耗指示(圖31)。