本發(fā)明涉及檢測(cè)用品領(lǐng)域，具體而言，涉及一種動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，市場(chǎng)出現(xiàn)不法分子利用廉價(jià)低值肉制品，摻雜在牛肉羊肉驢肉中進(jìn)行銷售，常常以處理豬肉冒充牛肉，以雞鴨肉摻到牛羊肉中，以老鼠、貂或狐貍?cè)饷俺溲蛉庾鲅蛉獯?，等等，大大損害消費(fèi)者權(quán)益，同時(shí)也使人們對(duì)食品安全信任度降低，造成不良社會(huì)影響。與此同時(shí)，在國(guó)際貿(mào)易進(jìn)出口貿(mào)易中，由瘋牛病導(dǎo)致的畜牧業(yè)安全隱患依然存在。農(nóng)業(yè)部發(fā)布的通知《關(guān)于禁止在反芻動(dòng)物飼料中添加和使用動(dòng)物源性飼料的通知》等均對(duì)飼料中動(dòng)物源性成分進(jìn)行強(qiáng)制要求，為更好保證食品安全和我國(guó)畜牧業(yè)安全生產(chǎn)，急需開(kāi)發(fā)一種快速準(zhǔn)確技術(shù)和商業(yè)化試劑盒來(lái)進(jìn)行動(dòng)物源性成分的快速高通量篩查，達(dá)到執(zhí)法和商檢部門需求。因而，需要建立一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)鑒定動(dòng)物源性成分的方法，對(duì)我國(guó)食品安全及畜牧業(yè)安全產(chǎn)生重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)報(bào)道主要有顯微鏡檢法、紅外光譜法、ELISA、普通PCR、熒光定量PCR等方法，這些技術(shù)一般每次僅能檢測(cè)一種或兩種指標(biāo)，無(wú)法全面分析檢測(cè)食品中所涉及的多種動(dòng)物源性成分，這些方法不能很好滿足快速、大規(guī)模、高通量檢測(cè)的需求。而基因芯片技術(shù)目前絕大多數(shù)還處于實(shí)驗(yàn)室階段，更多的用于基礎(chǔ)性研究而不能平民化應(yīng)用。目前基因芯片法一般采用玻璃片作為固相支持物，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需要相應(yīng)的點(diǎn)樣儀和芯片識(shí)讀儀，成本較高。因此研發(fā)一種快速、方便、靈敏度高、成本低、可視化和高通量的檢測(cè)方法將具有非常好的應(yīng)用前景及市場(chǎng)推廣能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒，該試劑盒能夠?qū)κ称分械亩喾N動(dòng)物源性成分檢測(cè)，且具有成本低、快速、操作方便以及靈敏度高的特點(diǎn)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

一種動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒，其包括引物組合，該引物組合包括選自SEQ ID NO.1～2所示的用于檢測(cè)豬源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.3～4所示的用于檢測(cè)牛源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.5～6所示的用于檢測(cè)貉源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.7～8所示的用于檢測(cè)羊源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.9～10所示的用于檢測(cè)雞源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.11～12所示的用于檢測(cè)鴨源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.13～14所示的用于檢測(cè)兔源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.15～16所示的用于檢測(cè)狐源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.17～18所示的用于檢測(cè)貂源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.19～20所示的用于檢測(cè)驢源性成分的引物對(duì)和SEQ ID NO.21～22所示的用于檢測(cè)鼠源性成分的引物對(duì)中的至少三種的組合，引物組合中的各引物對(duì)中的正向引物的5’端或反向引物的5’端帶有生物素標(biāo)記。

本發(fā)明提供的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒的有益效果是：本發(fā)明的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒包括引物組合，引物組合包括了SEQ ID NO.1～2所示的用于檢測(cè)豬源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.3～4所示的用于檢測(cè)牛源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.5～6所示的用于檢測(cè)貉源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.7～8所示的用于檢測(cè)羊源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.9～10所示的用于檢測(cè)雞源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.11～12所示的用于檢測(cè)鴨源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.13～14所示的用于檢測(cè)兔源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.15～16所示的用于檢測(cè)狐源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.17～18所示的用于檢測(cè)貂源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.19～20所示的用于檢測(cè)驢源性成分的引物對(duì)和SEQ ID NO.21～22所示的用于檢測(cè)鼠源性成分的引物對(duì)中的至少三種引物對(duì)的組合，這樣可對(duì)待測(cè)樣本DNA進(jìn)行三重或三重以上的PCR，達(dá)到可同時(shí)擴(kuò)增三種或三種以上目標(biāo)DNA序列的目的，并同時(shí)在體系中加入不等量的引物，進(jìn)行非對(duì)稱PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與相應(yīng)的探針雜交顯色后，進(jìn)而可檢測(cè)出待測(cè)樣本的動(dòng)物源性成分，可同時(shí)檢測(cè)豬、牛、羊、鴨、雞、兔、貉、狐、驢、貂和鼠共11種動(dòng)物中的至少三種；因此，本發(fā)明的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒具有單次可檢成分多、靈敏度高、速度快以及成本低等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明的動(dòng)物源性成分試劑盒的膜芯片上各探針的固定位置模式圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的待測(cè)樣本的雜交結(jié)果圖，其中圖2A為膜芯片結(jié)果模式圖，圖2B為待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2的待測(cè)樣本的雜交結(jié)果圖，其中圖3A為膜芯片結(jié)果模式圖，圖3B為待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3的待測(cè)樣本的雜交結(jié)果圖，其中圖4A為膜芯片結(jié)果模式圖，圖4B為待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4的待測(cè)樣本的雜交結(jié)果圖，其中圖5A為膜芯片結(jié)果模式圖，圖5B為待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒進(jìn)行具體說(shuō)明。

動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒，其包括用于擴(kuò)增出單鏈DNA的Tag引物和引物組合，引物組合包括選自SEQ ID NO.1～2所示的用于檢測(cè)豬源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.3～4所示的用于檢測(cè)牛源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.5～6所示的用于檢測(cè)貉源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.7～8所示的用于檢測(cè)羊源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.9～10所示的用于檢測(cè)雞源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.11～12所示的用于檢測(cè)鴨源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.13～14所示的用于檢測(cè)兔源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.15～16所示的用于檢測(cè)狐源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.17～18所示的用于檢測(cè)貂源性成分的引物對(duì)、SEQ ID NO.19～20所示的用于檢測(cè)驢源性成分的引物對(duì)和SEQ ID NO.21～22所示的用于檢測(cè)鼠源性成分的引物對(duì)中的至少三種引物對(duì)的組合，引物組合中的各引物對(duì)中的正向引物或反向引物的5’端帶有生物素標(biāo)記。

需要說(shuō)明的是，引物組合中引物對(duì)的組合方式可以是多種，例如可以是選自SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.19～20和SEQ ID NO.21～22所示引物對(duì)中的4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種，甚至是11種。引物組合中的引物對(duì)數(shù)量少、成本低、可以節(jié)約檢測(cè)原料；若引物組合中的引物對(duì)數(shù)量多，可檢出的成分指標(biāo)則多，因此，引物組合中引物對(duì)的具體組合方式均可根據(jù)實(shí)際情況和經(jīng)濟(jì)效益進(jìn)行設(shè)計(jì)，只要是根據(jù)SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6、SEQ ID NO.7～8、SEQ ID NO.9～10、SEQ ID NO.11～12、SEQ ID NO.13～14、SEQ ID NO.15～16、SEQ ID NO.17～18、SEQ ID NO.19～20和SEQ ID NO.21～22所示引物對(duì)進(jìn)行組合得到引物組合均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述每種引物對(duì)中均包括一正向引物和一反向引物。例如在用于檢測(cè)豬源性成分的引物對(duì)中，SEQ ID NO.1所示的是正向引物的堿基序列，SEQ ID NO.2所示的是反向引物的堿基序列。

在正向引物的5’端或反向引物的5’端標(biāo)記生物素的作用在于便于得到單鏈DNA能夠更容易和更靈敏地結(jié)合到催化酶上。再根據(jù)催化酶催化底物的顯色和發(fā)光來(lái)指示檢測(cè)結(jié)果。該催化酶優(yōu)選為辣根過(guò)氧化物酶，底物優(yōu)選為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。

較佳地，引物組合中的各引物對(duì)中的反向引物的5’端帶有生物素標(biāo)記的。當(dāng)然，在其他的實(shí)施例中也可以是正向引物的5’端帶有生物素標(biāo)記的，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

此外，引物組合還包括用于檢測(cè)內(nèi)參基因的內(nèi)參引物對(duì)。較佳地，內(nèi)參基因?yàn)?8SrRNA基因，內(nèi)參引物對(duì)如SEQ ID NO.23～24所示。SEQ ID NO.23所示的是擴(kuò)增18SrRNA基因的正向引物，SEQ ID NO.24所示的是擴(kuò)增18SrRNA基因的反向引物。內(nèi)參引物對(duì)中的反向引物的5’端帶有生物素標(biāo)記。18SrRNA基因是真核生物的保守基因，若檢測(cè)出18SrRNA基因則說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果相對(duì)可靠可信，因此，通過(guò)內(nèi)參引物對(duì)的設(shè)計(jì)，可以提高本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)結(jié)果的可靠性。需要說(shuō)明的是，在其他的實(shí)施例中，內(nèi)參基因可以不用是18SrRNA基因，可以是其他的保守基因例如α-珠蛋白的編碼基因作為內(nèi)參基因，再根據(jù)內(nèi)參基因設(shè)計(jì)出相應(yīng)的內(nèi)參引物對(duì)即可，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

此外，本發(fā)明實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒還可包括膜芯片，膜芯片為表面固定有探針的支持膜，探針包括SEQ ID NO.25所示的內(nèi)參探針、SEQ ID NO.26～36所示的檢測(cè)探針、SEQ ID NO.37所示的陽(yáng)性探針以及SEQ ID NO.38所示的陰性探針。其中，支持膜可以是硝酸纖維素膜或尼龍膜，或者是聚丙烯膜，或者是硅片等能夠起到固相支撐的作用的物質(zhì)。較佳地，支持膜為硝酸纖維素膜。

另外，SEQ ID NO.26～36中所示的檢測(cè)探針?lè)謩e是：SEQ ID NO.26所示的是豬探針，SEQ ID NO.27所示的是牛探針，SEQ ID NO.28所示的是貉探針，SEQ ID NO.29所示的是羊探針，SEQ ID NO.30所示的是雞探針，SEQ ID NO.31所示的是鴨探針，SEQ ID NO.32所示的是兔探針，SEQ ID NO.33所示的是狐探針，SEQ ID NO.34所示的是貂探針，SEQ ID NO.35所示的是驢探針，SEQ ID NO.36所示的是鼠探針。每種探針與其對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交結(jié)合，例如豬探針與檢測(cè)豬源性成分的引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物雜交結(jié)合，進(jìn)而檢測(cè)出豬源性成分，牛探針與檢測(cè)牛源性成分的引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物雜交結(jié)合，檢測(cè)出牛源性成分。

本發(fā)明的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒通過(guò)提供多種引引物對(duì)的組合進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行非對(duì)稱PCR擴(kuò)增技術(shù)(Asymmetric PCR)用以提高檢測(cè)靈敏度。非對(duì)稱PCR擴(kuò)增技術(shù)是指在PCR擴(kuò)增過(guò)程中采用不等量的正向引物和反向引物(或是擴(kuò)增延伸條件不同的正向引物和反向引物)，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA，該單鏈DNA可以有效的和固定在支持膜上的探針雜交，從而提高檢測(cè)靈敏度。

本發(fā)明提供的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒通過(guò)5’端帶有生物素標(biāo)記序列的反向引物或正向引物結(jié)合到模板上并延伸擴(kuò)增得到大量的5’端帶有生物素標(biāo)記的單鏈DNA，該5’端帶有生物素標(biāo)記的單鏈DNA通過(guò)堿基互補(bǔ)原則對(duì)應(yīng)地與探針雜交，經(jīng)顯色處理后，顯示出相應(yīng)顏色，進(jìn)而得到檢測(cè)結(jié)果。其檢測(cè)結(jié)果具有特異強(qiáng)、假陽(yáng)性率低、可視化程度高等特點(diǎn)。其中，陽(yáng)性探針和陰性探針可用于評(píng)判顯色結(jié)果的可靠性。

較佳地，動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒還包括輔料，輔料包括dNTPs、EX-Taq聚合酶、5’端帶生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸(positive oligo)單鏈DNA，陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA的堿基序列如SEQ ID NO.40所示。其中，5’端帶生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA可與陽(yáng)性探針結(jié)合，而不與陰性探針結(jié)合。因此，在膜芯片上的陽(yáng)性探針位置有斑點(diǎn)而陰性探針位置沒(méi)有斑點(diǎn)說(shuō)明雜交結(jié)果可靠，檢測(cè)結(jié)果可信。需要說(shuō)明的是，動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒可以包括輔料，也可以不包括輔料，均可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行配置。

較佳地，動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒還包括配液，配液包括：10×PCR緩沖液(PCR buffer、含鎂離子)、預(yù)雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈霉親和素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶和四甲基聯(lián)苯胺顯色液。

其中，鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶即為催化酶，四甲基聯(lián)苯胺為該酶的催化底物，鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，催化甲基聯(lián)苯胺進(jìn)行反應(yīng)而顯色，使得檢測(cè)結(jié)果可視化。當(dāng)然，在其他的實(shí)施例中，催化酶可以不是鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，可以是鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶、鏈霉親和素標(biāo)記的葡萄糖氧化酶等，將四甲基聯(lián)苯胺換成其相應(yīng)的底物即可，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

綜上，本發(fā)明采用基于反向斑點(diǎn)雜交的可視化膜芯片技術(shù)進(jìn)行多種動(dòng)物源性成分檢測(cè)，其工作原理是首先將針對(duì)各種物種特異性序列的單鏈探針按順序排列固定于支持膜表面的特定區(qū)域，再將待測(cè)的多重PCR產(chǎn)物與其雜交，這樣PCR產(chǎn)物中的特異性序列單鏈DNA就會(huì)和支持膜上的探針雜交，經(jīng)洗滌去除未結(jié)合的DNA樣品，由于待測(cè)PCR產(chǎn)物的DNA上帶有生物素標(biāo)記，結(jié)合了待測(cè)DNA的探針點(diǎn)就偶聯(lián)上了生物素標(biāo)記物，再經(jīng)過(guò)相應(yīng)的顯色反應(yīng)就能讀取對(duì)應(yīng)的雜交信號(hào)，這樣一張膜芯片上就可以同時(shí)檢測(cè)多種動(dòng)物源性成分。本發(fā)明的檢測(cè)探針為寡核苷酸探針，其順序排列于支持膜表面的特殊區(qū)域，形成低密度探針陣列。膜芯片同待測(cè)樣本雜交后經(jīng)底物顯色可形成肉眼可視化的檢測(cè)結(jié)果。

因此，本發(fā)明的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒具有了以下益效果是：1)操作簡(jiǎn)單，經(jīng)過(guò)一次樣本前處理，單管PCR擴(kuò)增，單芯片雜交就可以同步檢測(cè)樣本中多種動(dòng)物源性成分，具有平行分析和多重判斷的特點(diǎn)；2)檢驗(yàn)對(duì)象完備，包含了當(dāng)前市面上常見(jiàn)、常檢的動(dòng)物源性成分檢測(cè)指標(biāo)，并且可以很方便的加入新的檢測(cè)指標(biāo)；3)系統(tǒng)在多重PCR擴(kuò)增過(guò)程同時(shí)進(jìn)行了非對(duì)稱PCR擴(kuò)增，提高了系統(tǒng)的靈敏度和準(zhǔn)確性；4)試劑盒采用了可視化膜芯片的檢測(cè)方式，提高了系統(tǒng)的檢測(cè)通量，并且檢測(cè)結(jié)果可以直接用肉眼判斷，方便，快捷；5)試劑盒操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，無(wú)需特殊的昂貴儀器，適用于食品中動(dòng)物源性成分的大規(guī)模檢測(cè)。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒包括引物組合以及膜芯片。

其中，本實(shí)施例的引物組合包括12種引物對(duì)，各引物對(duì)的正向引物和反向引物的堿基序列5’-3’如下：

用于檢測(cè)豬源性成分的引物對(duì)：

正向引物：ACCGTAGGAATAGACGTG(SEQ ID NO.1)，反向引物：TGAAGCCCAGAGCTCATAG(SEQ ID NO.2)；

用于檢測(cè)牛源性成分的引物對(duì)：

正向引物：TTACAACAATTATCAACATAA(SEQ ID NO.3)，反向引物：CCGGGTCGAAGAAGGTTGTA(SEQ ID NO.4)；

用于檢測(cè)貉源性成分的引物對(duì)：

正向引物：GCCTGAAGTGTACCTCTT(SEQ ID NO.5)，反向引物：TGTGATCATGGGCTGATT(SEQ ID NO.6)；

用于檢測(cè)羊源性成分的引物對(duì)：

正向引物：GGCCTATACTATGGATCATATAC(SEQ ID NO.7)，反向引物：AATTGCTGAAAGGAGGTTGGT(SEQ ID NO.8)；

用于檢測(cè)雞源性成分的引物對(duì)：

正向引物：CCACCTCACCTTCCTACAC(SEQ ID NO.9)，反向引物：GAAATGGAATTTTGTCA(SEQ ID NO.10)；

用于檢測(cè)鴨源性成分的引物對(duì)：

正向引物：ACAGAAGGAAACCGAA(SEQ ID NO.1)，反向引物：TCCGATGATCACGTGGAGTCC(SEQ ID NO.2)；

用于檢測(cè)兔源性成分的引物對(duì)：

正向引物：GAAACTGGCTCCAACAAC(SEQ ID NO.13)，反向引物：AAGGAAACCTAGGGTGTCTTTG(SEQ ID NO.14)；

用于檢測(cè)狐源性成分的引物對(duì)：

正向引物：TTTGCCCACTGATTCCCCTT(SEQ ID NO.15)，反向引物：CATGTTCACCCCTACGAATAT(SEQ ID NO.16)；

用于檢測(cè)貂源性成分的引物對(duì)：

正向引物：GTCATCTCAGCACTAGCAG(SEQ ID NO.17)，反向引物：TAGGGGTGAAAGGGGATTT(SEQ ID NO.18)；

用于檢測(cè)驢源性成分的引物對(duì)：

正向引物：TACGCTCCATTCCCAACAAA(SEQ ID NO.19)，反向引物：TTTTGACATGTGTAGGGTAGGG(SEQ ID NO.20)；

用于檢測(cè)鼠源性成分的引物對(duì)：

正向引物：ACATACGAAAAACACACC(SEQ ID NO.21)，反向引物：TCCTAGAAGGGACCCAA SEQ ID NO.22)；

用于檢測(cè)18SrRNA基因的內(nèi)參引物對(duì)：

正向引物：AGCCTGAGAAACGGCTACC(SEQ ID NO.23)，反向引物：TGCTGGCACCAGACTTGC(SEQ ID NO.24)。

其中，每個(gè)引物對(duì)中的反向引物的5’端帶有生物素標(biāo)記。

另外，膜芯片為表面固定有探針的支持膜。支持膜是硝酸纖維素膜，探針包括14種，各探針的堿基序列5’-3’如下：

內(nèi)參探針：TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT(SEQ ID NO.25)。

檢測(cè)探針包括如下：

豬探針：

GAGCATACTTTACATCTGCCACAATAATCATTGCTATTCCC(SEQ ID NO.26)；

牛探針：AACCCCTCTATTCGTATGATCCG(SEQ ID NO.27)；

貉探針：CGAGAAACCATCAACCCTTGCCTGAAG(SEQ ID NO.28)；

羊探針：TGGATCATATACCTTCCTAGAAACATG(SEQ ID NO.29)；

雞探針：CCTAGGCATCTCATCCGACTC(SEQ ID NO.30)；

鴨探針：ACCGCCCTACAAGCAATAGAGTACCATG(SEQ ID NO.31)；

兔探針:ACAACCCCACAGGAATTCCTTCAAAC(SEQ ID NO.32)；

狐探針：GGGCTACACCCTAAATGACACCTG(SEQ ID NO.33)；

貂探針：GGAATCCCATCTGATTCAGAC(SEQ ID NO.34)；

驢探針：GCCCTTATCCTTTCCATCTTAATCCTAG(SEQ ID NO.35)；

鼠探針：AAAATTATTAACCACTCAT(SEQ ID NO.36)。

陽(yáng)性探針(positive probe)：

GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG(SEQ ID NO.37)

陰性探針(negative probe)：

GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC(SEQ ID NO.38)。

上述14種探針按圖1所示的位置順序地分別固定在支持膜上的相應(yīng)位置。在其他的實(shí)施例中，探針的固定順序可與本實(shí)施例有所不同。

通過(guò)相應(yīng)的多重PCR引物設(shè)計(jì)，采用固相亞磷酰胺三酯法合成得到上述用于12重PCR的引物對(duì)。根據(jù)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)檢測(cè)探針，采用固相亞磷酰胺三酯法合成探針，以及可與陽(yáng)性探針雜交結(jié)合的5’端帶生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA，5’端帶生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA(positive oligo)的堿基序列如下：

5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCT CATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3'(SEQ ID NO.39)。

本實(shí)施例以市面上購(gòu)得的雞肉粉，作為待測(cè)樣本，用本實(shí)施例提供的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其動(dòng)物源性成分。具體步驟如下。

1.制備膜芯片

將支持膜裁成1.2cm×1.8cm的膜條，裁好的膜條于雙蒸水中浸泡15min，再用15×SSC浸泡15min，取出，置于濾紙上，60℃烘1.5hour，待膜條降溫到室溫后，將內(nèi)參探針(5uM)、11種檢測(cè)探針(5uM)、陽(yáng)性探針(5uM)以及陰性探針(5uM)，按圖1所示(圖1中，“內(nèi)參”代表內(nèi)參探針的固定位置、“豬”代表豬探針的固定位置、“牛”代表牛探針的固定位置、“羊”代表羊探針的固定位置、“雞”代表雞探針的固定位置、“鴨”代表鴨探針的固定位置、“兔”代表兔探針的固定位置、“驢”代表驢探針的固定位置、“貉”代表貉探針的固定位置、“狐”代表狐探針的固定位置、“貂”代表貂探針的固定位置、“鼠”代表鼠探針的固定位置、“PC”代表陽(yáng)性探針的固定位置、“NC”代表陰性探針的固定位置)的順序?qū)⒏魈结橖c(diǎn)在膜條相應(yīng)的位置上，膜條晾干后，置于80℃烘2小時(shí)以固定探針，處理好的膜芯片室溫干燥處保存。

2.多重PCR

2.1按照CTAB法提取待測(cè)樣本的基因組DNA，每50mg待測(cè)樣本經(jīng)DNA提取后，并用微量核酸測(cè)定儀將DNA溶液稀釋至同一質(zhì)量濃度(100-200ng/μl)，得到待測(cè)樣本的DNA模板(100-200ng/μl)。

2.2多重PCR體系和條件

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

10×PCR Buffer：5μl；

dNTP(2.5mM each)：5μl；

正向引物(20μM)：0.5μl，

反向引物(20μM)：0.6μl，(本實(shí)施例的引物組合12種引物對(duì)都加入至一個(gè)體系中)；

EX-Taq Polymerase(Takara,5U/μl)：0.5μl；

待測(cè)樣本的DNA模板(100ng/μl)：2μl；

加ddH₂O至總體積50μl。

對(duì)上述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件如下：

預(yù)變性：溫度95℃、時(shí)間10分鐘；變性：溫度95℃、時(shí)間45秒，退火：溫度55℃、時(shí)間30秒，延伸：溫度72℃、時(shí)間30秒，30個(gè)循環(huán)；最后延伸：溫度72℃、時(shí)間10分鐘。得到多重PCR產(chǎn)物。

3得到多重PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行膜芯片斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，具體如下。

3.1預(yù)雜交：膜條于42℃預(yù)雜交液(5×SSC，0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉)，10×Denhardt’s)中預(yù)雜交1小時(shí)，之后將膜條放于2ml雜交液(5×SSC，0.1％SDS，5×Denhardt’s，50％去離子甲酰胺，100μg/ml酵母tRNA)中42℃，1小時(shí)。

3.2雜交：取40μl多重PCR產(chǎn)物，并加入1μl上述的5’端生物標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA(10uM)，100℃水浴變性5分鐘后置于冰上，之后加入2ml雜交液中，42℃雜交16小時(shí)。用洗液1(2×SSC，0.1％SDS)、洗液2(0.5×SSC，0.1％SDS)42℃各洗膜條兩次，每次10分鐘。

3.3封閉：將膜條置于封閉液(3％BSA(牛血清白蛋白)，100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl)中37℃封閉30分鐘，之后將膜條放到酶聯(lián)液(用封閉液1:5000稀釋鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶)中37℃，30分鐘。

3.4顯色：用洗液3(100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl)、洗液4(100mM Tris-HCl，PH9.5，100mM NaCl，100mM MgCl₂)各漂洗膜條3次，每次5分鐘，之后將膜條放入TMB顯色液(100mM檸檬酸鈉PH5.4，0.1mg/ml四甲基聯(lián)苯胺TMB，1:1600體積比的H₂O₂(3％))中，避光顯色10～15分鐘，依照雜交點(diǎn)的顯色情況判定結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

由圖2B可知，膜芯片在含雞探針的位置有斑點(diǎn)，同時(shí)含內(nèi)參探針和陽(yáng)性探針的位置也有斑點(diǎn)，說(shuō)明本實(shí)施例中待測(cè)樣本中含雞肉成分，不含豬、牛、羊、鴨、兔、驢、狐、貂以及鼠成分，檢測(cè)結(jié)果可靠可信。

需要說(shuō)明的是，本實(shí)施例中所用輔料(dNTPs、EX-Taq聚合酶、5’端帶生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA)和配液(PCR緩沖液、預(yù)雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈霉親和素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶和四甲基聯(lián)苯胺顯色液)為外購(gòu)或自配，百分比為重量百分比。還有，在其他的實(shí)施例中，動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒可以進(jìn)包括引物組合。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒包括引物組合、膜芯片、以及輔料。其中，輔料包括dNTPs、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端帶生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA以及PCR緩沖液(含鎂離子)，該5’端帶生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA的堿基序列如SEQ ID NO.39所示。其余同實(shí)施例1。

采用本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)樣本-香腸(市面所購(gòu))進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟同實(shí)施例1，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。由圖3B可知，膜芯片上含豬探針的位置有斑點(diǎn)，同時(shí)含內(nèi)參探針和陽(yáng)性探針的位置也有斑點(diǎn)，說(shuō)明本實(shí)施例中待測(cè)樣本中含豬肉成分，不含牛、羊、雞、鴨、兔、驢、狐、貂以及鼠成分，檢測(cè)結(jié)果可靠。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒包括引物組合、膜芯片、輔料和配液。配液包括預(yù)雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液。

其中，預(yù)雜交液為5×SSC，0.1％SDS和10×Denhardt’s；雜交液為5×SSC，0.1％SDS，5×Denhardt’s，50％去離子甲酰胺和100μg/ml酵母tRNA。

洗液包括洗液1、洗液2、洗液3、以及洗液4。其中，洗液1：2×SSC和0.1％SDS，洗液2：0.5×SSC和0.1％SDS，洗液3：100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl，洗液4：100mM Tris-HCl，PH9.5，100mM NaCl和100mM MgCl₂。

封閉液為3％BSA，100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl；四甲基聯(lián)苯胺顯色液由四甲基聯(lián)苯胺顯色液A液和四甲基聯(lián)苯胺顯色液B液混合得到。其中，四甲基聯(lián)苯胺顯色液A液：200mM檸檬酸鈉PH5.4，0.2mg/ml四甲基聯(lián)苯胺；四甲基聯(lián)苯胺顯色液B液：3％H₂O₂用800體積的雙蒸水稀釋液，使用前A液和B液等量混合配成四甲基聯(lián)苯胺顯色液。其余同實(shí)施例1。

采用本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)樣本-火腿腸進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟同實(shí)施例1，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。由圖4B可知，膜芯片在含豬針的位置和雞探針的位置有斑點(diǎn)，同時(shí)含內(nèi)參位置和陽(yáng)性探針的位置也有斑點(diǎn)，說(shuō)明本實(shí)施例中待測(cè)樣本中同時(shí)含豬肉成分和雞肉，檢測(cè)結(jié)果可靠。

實(shí)施例4

本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒包括引物組合、膜芯片、輔料和配液。具體地，本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒包括：

多重PCR擴(kuò)增試劑一管600μl，每48μl試劑可檢測(cè)一個(gè)DNA樣本，每48μl擴(kuò)增體系構(gòu)成如下：

10×PCR Buffer(含鎂離子)：5μl，

dNTP(2.5mM each)：5μl，

12種引物(20μM)：上游引物各0.5μl、下游引物各0.6μl，

EX-Taq Polymerase(5U/μl)：0.5μl，

ddH₂O加至48μl。

每一樣本檢測(cè)需要吸取48μl擴(kuò)增試劑，加入2μl待測(cè)樣本的DNA(約50ng/μl)。

5’端生物素標(biāo)記的陽(yáng)性寡核苷酸單鏈DNA(10uM)一管15μl。

預(yù)雜交液(5×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt’s液)一瓶30ml。雜交液(5×SSC，0.1％SDS，5×Denhardt’s液，50％去離子甲酰胺，100μg/ml酵母tRNA)一瓶30ml。

洗液1(2×SSC，0.1％SDS)10倍濃縮液一瓶12ml，使用前加108ml ddH2O。洗液2(0.5×SSC,0.1％SDS)10倍濃縮液一瓶12ml，使用前加108ml ddH2O。洗液3(100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl)10倍濃縮液一瓶18ml，使用前加162ml ddH₂O。洗液4(100mM Tris-HCl，PH9.5，100mM NaCl，100mM MgCl₂)10倍濃縮液一瓶18ml，使用前加162ml ddH₂O。

封閉液/酶聯(lián)液(3％BSA，100mM Tris-HCl，PH7.5，150mM NaCl)一瓶60ml。鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(1mg/ml)一管5μl，使用前用封閉液1:5000稀釋成酶聯(lián)液。

TMB顯色液A液(200mM檸檬酸鈉PH5.4，0.2mg/ml四甲基聯(lián)苯胺TMB)一瓶15ml。TMB顯色液B液(1:800體積比的H₂O₂(3％))一瓶15ml。使用前A液B液等量混合配成TMB顯色液。

采用本實(shí)施例的動(dòng)物源性成分檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)樣本-羊肉串(市購(gòu))檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。由圖5B可知，膜芯片在含豬探針的位置和羊探針的位置有斑點(diǎn)，同時(shí)含內(nèi)參探針和陽(yáng)性探針的位置也有斑點(diǎn)，說(shuō)明本實(shí)施例中待測(cè)樣本中同時(shí)含豬肉成分和羊肉成分，檢測(cè)結(jié)果可靠。

綜上所述，本發(fā)明提供的動(dòng)物源性成分試劑盒能夠同時(shí)對(duì)豬、牛、貉、羊、雞、鴨、兔、狐、貂、驢以及鼠等11種動(dòng)物源成分進(jìn)行檢測(cè)，11對(duì)引物對(duì)能夠進(jìn)行11重PCR，而不發(fā)生非特異性擴(kuò)增，特異性強(qiáng)，探針能夠與對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物特異性雜交，靈敏度高，假陽(yáng)性率非常低，且通過(guò)內(nèi)參探針、陽(yáng)性探針和陰性探針的設(shè)置，確保檢測(cè)結(jié)果可靠可信，且檢測(cè)結(jié)果可視化程度高，直接用肉眼即可進(jìn)行判斷，成本低，適用于各種食品的動(dòng)物源成分的大規(guī)模檢測(cè)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。