本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及GmACT7基因片段作為中藥秦艽的葉片在不同誘導(dǎo)子處理下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中藥秦艽是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、和血舒筋、利尿等功效。隨著社會發(fā)展，市場需求的逐年增大，以及亂采亂挖等原因，致使野生的秦艽資源遭到極大破壞。自1987年起，秦艽就被我國列為三級重點(diǎn)保護(hù)野生藥材。秦艽的有效成分主要是以龍膽苦苷(gentiopicroside)為代表的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類(Secoiridiod glycosides)，還包括獐牙菜苦苷(swertiamarin)、獐牙菜苷(sweroside)等。這些次生代謝產(chǎn)物有著廣泛的生物藥理性活性，例如健胃、利膽、抗炎、抗真菌、抗組胺等。植物常常會對誘導(dǎo)子處理產(chǎn)生不同程度的響應(yīng)，對中藥秦艽而言，可體現(xiàn)在次生代謝產(chǎn)物的含量升高或降低。從分子領(lǐng)域了解誘導(dǎo)子處理后次生代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，可在生產(chǎn)實(shí)際中，優(yōu)化龍膽苦苷等裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類的代謝途徑，產(chǎn)生更多有效的次生代謝產(chǎn)物。目前，秦艽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的建立，為挖掘該種中藥材的基因提供了大量的數(shù)據(jù)資源。

研究基因的表達(dá)有多種方法，其中熒光實(shí)時定量PCR(RT-qPCR)因?yàn)槠淇焖俸涂煽康囟糠治龌虮磉_(dá)研究而被廣泛應(yīng)用。但是，實(shí)時熒光定量PCR檢測的準(zhǔn)確性很大程度上依賴于篩選適合的內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。所謂內(nèi)參基因(Endogenous references gene)即內(nèi)部參照，主要作為檢測目的基因在特定條件下表達(dá)水平變化的參照物，相當(dāng)于衡量基因表達(dá)的一個“標(biāo)尺”。常用的內(nèi)參基因應(yīng)該在生物體各類細(xì)胞中均有表達(dá)，它們是在維持細(xì)胞基本生命活動中時刻表達(dá)的基因，自身表達(dá)相對穩(wěn)定，不會隨著實(shí)驗(yàn)材料不同而有較大差異，這樣作為一個“標(biāo)尺”才可靠。然而越來越多的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，一些常用的內(nèi)參基因并不是在所有的情況下均穩(wěn)定表達(dá)，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，內(nèi)參基因的表達(dá)會發(fā)生變化。因此，在選擇使用某一個內(nèi)參基因時，應(yīng)首先驗(yàn)證其在特定的條件下是否能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供GmACT7基因片段作為秦艽葉在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因的應(yīng)用，所述GmACT7基因片段的核苷酸序列為GCAGTAGGAAAGCATCAAGTTCTTTGTTAAAGTACATGTTCCGCCAACTGGGAATAATAAAGTACATTCTCATACAACATAATATTGACAATTGTTCTCAAGACAACAAACAAAACTTCAATAATAAGAAAACCAAAACCAATAGTAATAATAATATGGATAAAAAAGAACCATCACAACCACTCTCCA。

采用上述GmACT7基因片段作為秦艽葉在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因時，使用的特異性引物為：

GmACT7-F：5′-GCAGTAGGAAAGCATCAAGT-3′；和

GmACT7-R：5′-TGGAGAGTGGTTGTGATGG-3′

上述GmACT7基因片段由下述方法克隆得到：

(1)從秦艽中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

(2)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中GmACT7基因的核苷酸序列：

GTAAAGTCGATGCTAACTCGAAGCGTGGTGGCACGGTAGATTCATAATGCAGTAGGAAAGCATCAAGTTCTTTGTTAAAGTACATGTTCCGCCAACTGGGAATAATAAAGTACATTCTCATACAACATAATATTGACAATTGTTCTCAAGACAACAAACAAAACTTCAATAATAAGAAAACCAAAACCAATAGTAATAATAATATGGATAAAAAAGAACCATCACAACCACTCTCCAGCTACAAGCAACAACTCAAGCATGACAATGAAGCTCATTACATATCACAAGTGTTAACTGGATCGAATTGTGTCGAATTCGAACAACCATGACAACTGCAGATATATCCGAGTCGCATTATACCCAGCCCACTCTTAGAAGAAAACCCCAGCTCAAAACTTTATAACAACAGCAAACCGAAATTGTTTGTAACTTATCATAATAATGATACAAGGGCAGCAGCAGGAAAATAAAATAAAACTCACTATCCCAAGAAAGCAAATGAATCCTAAAAGCACTTCCTGTGGACAATAGATGGACCAGACTCTTCGTATTCAGCTTTCGAGATCCACATCTGCTGGAAAGTACTGAGGGAAGCGAGAATCGATCCTCCGATCCAAACACTGTACTTCCTCTCAGGTGGTGCAACAACCTTGATCTTCATGCTACTTGGAGCCAAAGCGGTGATCTCTTTGCTCATACGGTCAGCAATGCCCGGGAACATGGTTGAACCACCACTGAGAACAATGTTACCATAAAGATCCTTCCTGATATCGACGTCACATTTCATGATGGAATTGTAAGTAGTCTCGTGGATTCCTGCAGATTCCATTCCAATCATGCTAGGCTGAAACAGAACTTCAGGGCAACGGAATCTCTCGTTTGCTATTGTGATGACTTGTCCATCAGGCAATTCATAGTTCTTCTCGAGTGATGAGCTGCTTTTTGCAGTTTCAAGCTCCTGCTCGTAGTCAAGAGCAACATAAGCCAGCTTTTCCTTTATGTCACGGACAATTTCCCGCTCAGCAGAGGTGGTAAACATATATCCTCTCTCAGTGAGGATCTTCATGAGGTGATCGGTGAGATCACGACCAGCAAGGTCTAGACGAAGAATTGCATGGGGTAGAGCATACCCTTCATAGATTGGGACGGTATGAGACACACCATCACCAGAATCCAGGACAATACCGGTTGTACGGCCACTGGCATACAGAGACAGGACGGCCTGAATAGCAACATACATAGCCGGGGTATTGAAGGTCTCAAACATGATTTGAGTCATCTTCTCCCTATTGGCCTTTGGATTAAGAGGCGCCTCAGTGAGAAGTATAGGGTGCTCCTCAGGTGCAACACGAAGCTCGTTATAGAAAGTGTGATGCCATATCTTTTCCATATCATCCCAGTTGCTAACTATACCATGCTCAATCGGGTACTTCAAAGTCAAGATACCTCTTTTAGACTGAGCTTCATCACCCACATACGCGTCTTTCTGCCCCATTCCAACCATAACACCAGTGTGCCTTGGCCTACCCACAATACTGGGAAAGACTGCCCTTGGAGCATCATCACCAGCAAACCCAGCCTTCACCATTCCAGTTCCATTATCGCAAACAAGGGGTTGAATTTCCTCGGAATCGGCCATTTTCTATGAGCTTTGTTGGTAGAAAAGACGAGGACTTGCTGGCTTTGCTTAGCTTAGCTTAGCTTAGCTTTTGGAAATTGAACAGCTGCCTCGCGTTTTTGTAA

設(shè)計(jì)合成特異性引物：

GmACT7-F：5′-GCAGTAGGAAAGCATCAAGT-3′；和

GmACT7-R：5′-TGGAGAGTGGTTGTGATGG-3′；

(3)以cDNA為模板，利用步驟(2)中的特異性引物，PCR擴(kuò)增GmACT7基因片段，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：98℃10s、57℃3s、72℃1min，30個循環(huán)，72℃延長10min；

(4)電泳檢測步驟(3)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收并純化目的片段，進(jìn)行測序；

(5)測序所得的序列分別通過NCBI上BLAST比對和BioEdit本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中分析比較，進(jìn)而確定所得核苷酸序列為上述GmACT7基因片段。

本發(fā)明采用GmACT7基因片段作為秦艽葉在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因，以熒光定量PCR技術(shù)，通過絕對定量和相對定量分析方法檢測目的基因GmG10H的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，秦艽受銀離子、銅離子、水楊酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨等誘導(dǎo)子處理后，兩種分析方法體現(xiàn)的GmG10H基因在葉中的表達(dá)結(jié)果趨勢一致，說明GmACT7基因片段可作為秦艽葉在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因，為研究秦艽功能基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是GmACT7基因片段的溶解曲線。

圖2是GmG10H基因片段的溶解曲線。

圖3是Ct隨GmG10H基因片段濃度對數(shù)變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4是以GmACT7基因片段為內(nèi)參基因分析GmG10H基因片段在秦艽葉受不同誘導(dǎo)子處理后的相對表達(dá)量柱狀圖。

圖5是GmG10H基因片段在秦艽葉受不同誘導(dǎo)子處理后的絕對表達(dá)量柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

以GmACT7基因片段作為秦艽葉在不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的內(nèi)參基因，GmG10H基因片段(核苷酸序列為：ATCATGGGCTTACAGTTCGGACAAGTTACCACGATCGTCGTTACTTCTTCTGGGATGGCTAAAGAGGTTCTTCAAAAGCAGGATTTATCCTTCTGCAGCAGGTCAATTCCTAATGCTATTCATGCCCATGATCAGTACAAATACTCTGTTATTTGGCTCCCTGT)作為目標(biāo)檢測基因，具體檢測方法如下：

1、提取秦艽總RNA

分別以銀離子、銅離子、水楊酸、花生四烯酸、茉莉酸甲酯、檸檬酸銨為誘導(dǎo)子噴施處理新鮮秦艽，然后將處理后的秦艽葉分別放入1.5mL的離心管中，用液氮速凍后置于提前去除RNA酶的研缽中，并在研缽中加入足量的液氮，將樣本研成粉末；采用百泰克生物公司多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒并按照說明書提取樣本的總RNA。

2、合成秦艽cDNA

所得總RNA經(jīng)電泳檢測、測OD值，選質(zhì)量好的總RNA為模板，按照TaKaRa Prime ScriptTM RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，將合成的cDNA稀釋5倍，于-20℃凍存，待用。

3、合成內(nèi)參基因的特異性引物

上游引物GmACT7-F：5′-GCAGTAGGAAAGCATCAAGT-3′；和

下游引物GmACT7-R：5′-TGGAGAGTGGTTGTGATGG-3′；

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

4、合成目標(biāo)檢測基因的特異性引物

上游引物GmG10H-F：5′-ATCATGGGCTTACAGTTCG-3′；和

下游引物GmG10H-R：5′-ACAGGGAGCCAAATAACAG-3′；

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

5、PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的秦艽葉cDNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR均采用以下25μL反應(yīng)體系：超純水17μL、10×EX Taq PCR buffer 2.5μL、dNTPs 2μL(2.5mM)、上游引物0.25μL(5μM)、下游引物0.25μL(5μM)、ExTaq 0.5μL、cDNA2.5μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：98℃變性10s、57℃退火30s、72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸10min。用OMEGA膠回收試劑盒純化所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的片段，進(jìn)行測序，測序所得的序列分別通過在NCBI的BLAST比對和BioEdit的本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中分析比較，進(jìn)而確定所得核苷酸序列為上述GmACT7基因片段和GmG10H基因片段。

6、熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下的秦艽葉cDNA為模板，使用Roche 96系統(tǒng)，根據(jù)Takera公司的 Premix Ex Taq^TM II試劑盒說明書，反應(yīng)體系為20μL，其中2×SuperReal PreMix Plus SYBR Premix Ex Taq II(2×)(Tli RNaseH Plus)10μL，上、下游引物各0.8μL(10μmol/L)，cDNA 2μL(10ng/μL)，用超純水定容至20μL。熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增采用兩步法，即在95℃預(yù)變性30s后，運(yùn)行40個循環(huán)：95℃10s、60℃30s，再運(yùn)行溶解曲線(95℃1min，60℃1min，60℃-95℃，每30s升高0.5℃收集一次熒光。)，得到GmACT7基因片段和GmG10H基因片段的溶解曲線及閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。由圖1～2可見，溶解曲線為單一峰，說明GmACT7基因片段和GmG10H基因片段的上、下游引物均具有特異性。

7、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

將步驟5所得GmG10H基因片段進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋成5個濃度梯度，然后分別作為模板，采用GmG10H基因片段的上、下游引物按照步驟6的方法進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到Ct隨GmG10H基因片段濃度的對數(shù)為變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程為y＝-3.5735X+38.49(相關(guān)系數(shù)R²＝0.93)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(slope)即可得到GmG10H基因片段的擴(kuò)增效率E＝(10^(-1/slope)–1)×100％＝90％，說明引物的擴(kuò)增效率高。

8、GmG10H基因的相對表達(dá)量

根據(jù)公式：相對表達(dá)量＝2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝(待測組目的基因Ct值-待測組內(nèi)參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值)，計(jì)算GmG10H基因片段的相對表達(dá)量。結(jié)果見圖4。

9、GmG10H基因的絕對表達(dá)量

根據(jù)步驟7得到的Ct隨GmG10H基因片段濃度的對數(shù)變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過熒光實(shí)時定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得秦艽葉受不同誘導(dǎo)子處理后GmG10H基因片段的Ct，以步驟7中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程(y＝-3.5735X+38.49)計(jì)算GmG10H基因片段在秦艽葉受誘導(dǎo)子處理后準(zhǔn)確的基因拷貝數(shù)，即GmG10H基因的絕對表達(dá)量，結(jié)果見圖5。

對比圖4和圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，在引入GmACT7作為內(nèi)參基因，GmG10H基因的絕對定量結(jié)果和相對定量結(jié)果表現(xiàn)趨勢基本一致，說明本發(fā)明GmACT7基因片段可以作為研究秦艽葉在受到不同誘導(dǎo)子處理?xiàng)l件下引入的內(nèi)參基因。