本發(fā)明提供一種用于11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒，用于11種不同種類的兔艾美爾球蟲感染的檢測，本發(fā)明還公開了上述11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒的制備方法，屬于分子生物學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：家兔由于體積小，繁殖力強等特點常作為實驗動物用于獸醫(yī)學(xué)及人類醫(yī)學(xué)的研究。其養(yǎng)殖最為常見疾病之一就是球蟲病，其中尤以艾美爾球蟲感染最為常見。國際上，兔艾美爾球蟲的種類有11種之多，且很容易產(chǎn)生新的耐藥性株，因此這也是兔球蟲病難以治療和預(yù)防，發(fā)病不易于控制的主要原因。同其他球蟲的生活史一樣，兔球蟲分為未孢子化卵囊和孢子化卵囊。兔球蟲病的檢測方法有多種，如鏡檢法、ELISA（包括直接ELISA和間接ELISA）、常規(guī)PCR檢測等。但是以上方法要么觀測困難、不便于批量實驗（如鏡檢法），要么對操作人員的素質(zhì)要求較高、直觀性不強（如ELISA），要么檢測的靈敏性、特異性不高（常規(guī)PCR）。糞樣基因組是最容易采集的樣品之一，且基因組DNA穩(wěn)定性強，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是目前靈敏度高且易于操作的DNA檢測技術(shù)。由于糞便樣本成分復(fù)雜，其中含有大量細(xì)菌，使用普通PCR方法進(jìn)行檢測時經(jīng)常會有非特異性條帶或假陽性結(jié)果出現(xiàn)。尤其一般的糞便基因組提取試劑盒，對于樣品的處理球蟲孢子囊內(nèi)的DNA提取不夠徹底。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是公開一種用于11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒，以兔艾美爾球蟲18SrRNA基因ITS-1（internaltranscribedspace-1）序列為目標(biāo)序列，設(shè)計一對屬特異性nestedPCR引物，再針對每一種蟲體設(shè)計11對種特異性nestedPCR引物，建立nestedPCR檢測方法，用于臨床糞樣中11種兔艾美爾球蟲的檢測。首先對于球蟲基因組由于其卵囊的存在，普通的基因組試劑盒提取情況往往不夠理想。因此在針對其特點，對實驗操作進(jìn)行改進(jìn)，即在糞便樣品中加入0.4-0.6mm的玻璃珠，并在加入溶解液后對樣品利用液氮進(jìn)行反復(fù)凍融4-6次。本發(fā)明公開的11種兔艾美爾球蟲巢氏PCR檢測試劑盒，可以用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明11種兔艾美爾球蟲試劑盒主要由以下幾種材料及試劑組成：（1）直徑0.4-0.6mm玻璃珠；（2）PCR反應(yīng)液：2.5mMdNTPs，終濃度為10pmol/μL的上游引物和下游引物，10×PCRbuffer，rTaqDNA聚合酶，DNA模板和ddH2O。除DNA模板外，其他試劑可配制為Mix液凍存于-20℃長期存放；（3）11種兔艾美爾球蟲特異性引物：第一輪PCR引物：ITS-1F:GGGAAGTTGCG；ITS-1R:CTGCGTCCTTCATCGAT；第二輪PCR引物如下：表2(4)對照：陽性對照為斯氏艾美爾球蟲蟲種，陰性為對照為ddH2O，用于比較PCR產(chǎn)物以及監(jiān)測PCR操作過程是否正確。本發(fā)明的11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒還可以含有瓊脂糖（Agarose）、溴酚藍(lán)點樣緩沖液和rTaq酶，其濃度優(yōu)選為溴化乙錠10μg/μl；溴酚藍(lán)點樣緩沖液。也還可以含有PCR反應(yīng)管。本發(fā)明所述的11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：1)基因組提取，除了正常應(yīng)用糞便基因組試劑盒外，還應(yīng)對每份樣品加入200mg玻璃珠以便于對球蟲孢子囊進(jìn)行破碎，以及在加入GSL(DNA裂解液)液后使樣品在液氮和沸水的反復(fù)凍融5次以上。2）PCR擴增：（1）準(zhǔn)備待檢樣品數(shù)+2的PCR反應(yīng)管并分別標(biāo)記，管內(nèi)加入PCR反應(yīng)液（DNA模板分別為待檢樣品、陰性對照和陽性對照），渦旋混勻后瞬時離心，待用。（2）第一輪PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min、94℃變性1min、44℃退火30s、72℃延伸1min,共33個循環(huán)，后72℃延伸8min。（3）以第一輪PCR產(chǎn)物可作為所有第二輪PCR的反應(yīng)模板，第二輪PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min、94℃變性1min、對應(yīng)退火溫度（見表一）退火30s、72℃延伸1min,共35個循環(huán)，后72℃延伸10min。（表一）蟲種條帶大小（bp）退火溫度(℃)E.sti21754E.fla19653E.med15450E.coe25653E.int24154E.irr22639E.mag21846E.per15744E.vej16649E.piri28942E.exi280393）PCR產(chǎn)物觀察：配制2%瓊脂糖凝膠，加樣后100V-120V電壓下電泳20-30min，之后在紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)下觀察實驗結(jié)果，如果樣品存在對應(yīng)大小的擴增條帶就證明該樣品感染了相應(yīng)的兔艾美爾球蟲（得到的蟲種見附圖1～圖11）。本發(fā)明的積極效果在于：首先在基因組提取上，由于玻璃珠的使用和反復(fù)凍融的應(yīng)用，對球蟲基因組的提取效率大大的提高。另外提供的11種兔艾美爾球蟲ITS-1基因診斷序列，根據(jù)該序列設(shè)計引物，通過優(yōu)化擴增條件來提高其敏感性，電泳分析直接觀察擴增結(jié)果。本發(fā)明11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)，簡單易操作，靈敏性高，特異性強，而且便于批量化操作，能鑒定兔艾美爾球蟲具體種類的感染，結(jié)果判定準(zhǔn)確客觀。附圖說明圖1～圖11：分別為檢測出的11種艾美爾球蟲第二輪PCR產(chǎn)物的特異性條帶；圖12：斯氏艾美爾球蟲特異性驗證；圖13：斯氏艾美爾球蟲靈敏度驗證。具體實施方式下列實施例旨在進(jìn)一步舉例說明，而不是限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明的任何平行改變和改動都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍內(nèi)。實施例1兔艾美爾球蟲特異基因選擇兔艾美爾球蟲蟲種特異診斷序列：選擇具有高度保守性的18SrRNA的ITS-1基因序列，NCBI中比對其為艾美爾球蟲所特有，且各種球蟲在該段內(nèi)具有差異性，符合種特異檢測研究標(biāo)準(zhǔn)。實施例2.nestPCR特異性測試：實驗的目的其一在于區(qū)分兔艾美爾球蟲與其他病原感染的差異，其二在于能夠分別檢測出不同的11種艾美爾球蟲。因此選取常見寄生蟲DNA樣品（賈第蟲，新孢子蟲，以及弓形蟲）作為對照進(jìn)行特異性檢測。以斯氏艾美爾球蟲為例，結(jié)果如下：方法能夠準(zhǔn)確檢測出兔艾美爾球蟲，且為斯氏艾美爾球蟲，其他蟲種（賈第蟲G，新孢子蟲N，等孢球蟲I，弓形蟲速殖子G.t，弓形蟲緩殖子G.b）利用該檢測方法不能顯示特定條帶。實施例3.nestPCR靈敏度測試：通過麥?zhǔn)嫌嫈?shù)法計算出每μl所得球蟲個數(shù)，最終結(jié)果如下圖，即在每μl至少含有100個球蟲情況下能夠成功檢測到兔艾美爾球蟲的存在。實例4.PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化第一輪設(shè)置引物的退火溫度分別為：40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃，實驗發(fā)現(xiàn)44℃退火溫度最佳。E.sti第二輪設(shè)置引物退火溫度分別為：50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃，實驗發(fā)現(xiàn)54℃（≈（Tm上游+Tm下下游）/2-5℃）退火溫度最佳。第二輪引物的退火溫度根據(jù)第一輪推算，按照上下游引物Tm值平均值-5℃分別設(shè)置其他種類艾美爾球蟲的第二輪PCR退火溫度。實例5.樣品檢測采集長春地區(qū)154份家兔的糞便樣品進(jìn)行檢測。用飽和鹽水漂浮法進(jìn)行抽樣檢測，在鏡檢的20份樣品中發(fā)現(xiàn)11份典型的球蟲結(jié)構(gòu)。采用巢式PCR方法檢測全部樣品，除去5份提取失敗的樣品，剩余149份樣品發(fā)現(xiàn)了85份陽性樣品。試驗例1試劑盒的組成常規(guī)糞樣基因組提取試劑，玻璃珠；PCR反應(yīng)液10管（20μl體系），其中各自dNTPs的濃度為250μM、上游引物，下游引物，內(nèi)側(cè)上游引物，內(nèi)側(cè)下游引物的終濃度各為10pmol/μl，Mg2+終濃度為1.5mM；4g瓊脂糖；50μl溴化乙錠（20μg/μl）；0.5%溴酚藍(lán)點樣緩沖液50μl；10μlTaq酶（5U/μl）；1份兔艾美爾球蟲基因組DNA陽性對照。試驗2試劑盒特異性試驗取斯氏艾美爾球蟲（Eimeriastidia），藍(lán)氏賈第蟲（Giardialamblia）、新孢子蟲（Neosporacaninum）、等孢球蟲（Isospora）、弓形蟲（Toxoplasmagondii）速殖子（tachyzoite）和緩殖子（bradyzoite），用建立的擴增體系分別對其進(jìn)行擴增。將陰性和陽性對照分別加入標(biāo)記好的管中，然后把樣品依次加入并標(biāo)記好，置于PCR儀中。第一輪PCR條件為：95℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、44℃退火30s、72℃延伸30s,共30個循環(huán)，后72℃延伸10min；第二輪PCR條件為：95℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、按照表格中退火溫度設(shè)定相應(yīng)的30s、72℃延伸30s,共30個循環(huán)，后72℃延伸10min.擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖進(jìn)行電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。結(jié)果顯示（見附圖12）：僅有斯氏艾美爾球蟲可以呈現(xiàn)出相應(yīng)條帶，其它樣本均無擴增，符合特異檢測標(biāo)準(zhǔn)。試驗3試劑盒敏感性試驗使用麥?zhǔn)嫌嫈?shù)法收集斯氏艾美爾球蟲5.75×106/mL。提取1ml球蟲全部DNA，并用57.5μL的TE收集。分別將濃度稀釋到第一個反應(yīng)體系中的含量為1.6×104、8000、4000、2000、1000、100、10、1。反應(yīng)條件同特異性檢測實施例，同時設(shè)陰性對照。產(chǎn)物用2%的瓊脂糖進(jìn)行電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。結(jié)果表明閾值為100，符合敏感性檢測標(biāo)準(zhǔn)（見附圖13）。試驗例4試劑盒的穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗陽性模板，PCR反應(yīng)液，rTaq酶在-20℃條件下貯存，裂解液、溴酚藍(lán)等其它物品4℃保存即可。當(dāng)貯存時間為30天、60天、100天、150天、200天時取出各組分，用已知PCR陽性的樣品檢測11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒穩(wěn)定性。另外，10份PCR陽性樣本用11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒重復(fù)試驗3次，15份PCR陰性樣本同樣重復(fù)3次，擴增條件如前所述。結(jié)果表明在以上各時段取出的組分在已知PCR陽性樣品和15份PCR陽性樣本均得到了單一明亮特異的目的條帶，而空白對照的陰性樣品均無任何擴增帶，故此試劑盒穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。試施例5試劑盒的保質(zhì)期試驗將分別在4℃和-20℃貯存1個月、2個月、3個月、4個月、5個月和6個月的11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒取出并對已知陽性樣品進(jìn)行檢測。擴增及檢查方法同前，結(jié)果表明在4℃和-20℃條件下保存達(dá)10月之久的11種兔艾美爾球蟲巢式PCR檢測試劑盒依然能擴增出清晰的目的條帶，無雜帶。序列表1<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>217<212>DNA<213>斯氏艾美爾球蟲(E.stiedai)<400>11GTGGGTTTTCTGTGCCCTCCCCCACCATGGGTCGGTTCGGTCACCTCTGCATTTTCCAAC61CTTTGAATCTTTTCTCACTCACTCTACAACGGATTTCTTGTAAGGCGGCTATTTTTTATG121TGGTCTGTCTTTCTTTCTGCATTGTTTTTGTTCCAGTAAATTGGAACGAAAGTGAGGAGG181CGGATGGACGTGCTGAATGAAGCAAAGCAGCAGCCTT序列表2<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>196<212>DNA<213>黃艾美爾球蟲（E.flavescens）<400>11GAATATTGTTGCAGTTTACCACCAATGGGGTTACTTTGTCACCTTTCTCAACTCTAGAATC61TGTTTTTTTCTTTTCTCCAACGACGCTTTTTCTTTTTCTCATTGAAGTTTTTTTTTTCCTC121TTCCAACCGCATAAACTTTTTTTTGTTCCATCATTCCGATGGAATAAGGGGAAGATTATGA181AGAACGGTTGTTGAGG序列表3<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>154<212>DNA<213>中型艾美爾球蟲（E.media）<400>11GATTTTTTTCCACTGCGTCCCTGTTTTTCAGTATAGTGGGAAAGAGGTGAGGCAGTTGG61GTGTGTAAAAGCATCTTTCGCCCATAGGTCACCACCACCTGTTGGTGGTGATACTTGGG121TGATAGAAGCTTTTTTTACCTTTTCTGTTATGAA序列表4<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>256<212>DNA<213>盲腸艾美爾球蟲（E.coecicola）<400>11AGCTTGGTGGGTTCTTATTATTGTACTCTATCTATCCCACCACTACTACTACGGTTCATC61ATATTCACCTCCTGCTCTCCATTTTCCAACTTTTGAATCTCTCTTTTCACTTCACAACGA121TTTTTTTATAGAAGAAGCCTTGTTATTTGGTTTCTTTCTTCTACTTTTATGTCTGCATTC181TTTTCTTTCCAATAAATTATTGGGATGAAATTGAGGCAGATATGGTATGATGATATGGAT241TTGTTGAAGCAACTAG序列表5<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>241<212>DNA<213>腸艾美爾球蟲（E.intestinalis）<400>11TGTTTGTACCACCGAGGGAATAACCTTTGCATTTTCGAACTCTTGAATCTTTTTTTCACT61CTACAACGATTTTCGAAAGTATGCTATTTGATCTAATTTCTCCTTCTGCACACTTTTTTT121TTCCAGTAAAATGGAATAATGGAAGTGTGGCAGGTGGATGTATTGAGAAGCGACAGACTC181GCCCGGGAATAACCAGCGTCAAAATGCTGGTTTTGCTGGATGAGGAGGGTAGCTTAATGT241T序列表6<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>226<212>DNA<213>無殘艾美爾球蟲（E.irresidua）<400>11TTTGGTGGGAAAAGATGATTCTACTACACTTAAAAGGCCAAAAGTTCCTTCTACTTTTGG61AGCTGTGGTAGGGTCGTCAGAGTACCGCCGGTGAGATCACCTCGATATCACTTCCAACTC121TTGAATCCTTTCTCCAACCTCCTCAACGTGTTCTCTTTTACTTTAATTAATATTAAGGTA181TTCATTTACCTTGATGCCATTTTGAATGGGTTAAAAATAATGCAAA序列表7<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>218<212>DNA<213>大型艾美爾球蟲（E.magna）<400>11TTTACTTATCACCGAGGGTTGATCACCTATGCATTTTGCCACACTTTTGAATCTTTTTCC61ATTCCACAACGATTTTAAGGCCCACTGCATCCTTCTTTCCCTCAGTACACAGTGGAATAG121AAGTGAGGTAGCTGGGTGTGTAAAAGCATCTTTTGCCCGCAAGTAACCGCCTGTTGGCGG181TGAAAGGTGGGTGGCGGTGGTAAGCTTTACCTTTCTCG序列表8<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>157<212>DNA<213>穿孔艾美爾球蟲（E.perforans）<400>11TTTTATTTCATTCCCATTTGCATCCCTTTTTTTCAGTATATTGATTGGAAAAGAGGTGAG61GCAGTTGGGTGTGTGAAAGCATCTCTCACCCAAAGGTGACCTCCTGTCGGTGGTGACAGT121TGGGTGACAGAAGCTTGACCTTTTCTGTTATGAAAAG序列表9<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>166<212>DNA<213>維氏艾美爾球蟲（E.vejdovskyi）<400>11GTGCTGCCACAAAAGTCACCGCTGAATTTTCCAACTTTTGAATGTTTTTTCACCCTACAA61CGATTTTCTAAGCTCTGCTATTTGATTGGTTTTCTGTTCTACCTGTGTCCTCTTTTTTTT121CCAGTAACTTGGAATGAAAGGTGAGGCGGGCGGAATGAATTGTAGC序列表10<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>289<212>DNA<213>梨形艾美爾球蟲（E.piriformis）<400>11ACGAATACATCCCTCTGCCTTACCCTTTAATTGGCTGAAAGCAGCTTCTATTTTGAGGTG61TGGCTTTCTGGGGCCGGTTGGGGTATGGGTGGGATTGTTGCAGTGTACCACCTCTATGGG121GTTACTTTGTCACCTTTCTCAACACTAGAATCTGTTTTCTTTTTCTCTCCATCGACGCGT181TTTCTTTTTCTCAATGAAGTTTTTTTTTTTCTCTTCAAACCGCATAAACTTTTGTCTTCC241ATTACTCCGATGGAATAAGTGGAAGAATGGTTGTGCAGGGGGAGACAAT序列表11<110>吉林大學(xué)<120><140><160>1<210>1<211>280<212>DNA<213>小型艾美爾球蟲（E.exigua）<400>11GAATAAGTTCTGCCTAAAGAGAGCCTTCTAATTGGACGAAAGTTCTACACTAGTTGGTGT61GGGTCTTTTGGGGCTGATTGGGGCTTTGGGGCTGGGGCTTGTTCGACGATCACCCTATCA121CAATTCTCAACTTTTGAATCGTTTTTTCTTTTCTCCATCGACGTATTTTTCTTTGATTTT181AGCGATAATTTTCCTTTTTTCTCTTGGAACCGTTAAAGATCTTTTCGCCCAAGTCAAAAT241ACCAACTGGTTTTTGAGGTGGGTTGGGGATGGTCTATATA。當(dāng)前第1頁1 2 3