本發(fā)明涉及一種檢測玉米分子標(biāo)記的試劑盒，特別是涉及一種檢測玉米品種良玉88號純度的SSR分子標(biāo)記試劑盒。

背景技術(shù)：

玉米是我國的重要作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。玉米種子質(zhì)量直接影響產(chǎn)量，玉米種子純度是評價種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。實踐中，我國玉米種子純度鑒定仍以籽粒形態(tài)鑒定、幼苗鑒定和田間小區(qū)種植鑒定為主體，輔以同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)。

利用種子、幼苗或者株型等形態(tài)差異鑒定純度的方法費時費力、受環(huán)境和基因顯隱性等的影響較大，檢測結(jié)果易出現(xiàn)偏差。同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)具有簡單、快速、成本低等優(yōu)點，然而，而且隨著玉米品種的數(shù)量逐年增多，種質(zhì)資源狹窄，同質(zhì)化問題愈顯突出，難以找到雜交種特征帶，難以進行有效的品種純度檢測。

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對玉米品種純度鑒定的優(yōu)越性在于：（1）SSR分子標(biāo)記數(shù)量大，特異性高，可鑒定表型難于鑒別的品種；（2）SSR分子標(biāo)記不受任何環(huán)境因素的影響，可在生長發(fā)育的任何階段取材鑒定；（3）SSR分子標(biāo)記呈共顯性遺傳，操作靈活、簡便、快速，易于分析；（4）利用SSR分子標(biāo)記鑒定品種，不僅準(zhǔn)確可靠，而且還便于實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。

玉米品種良玉88號是丹東登海良玉種業(yè)有限公司于2008年遼寧省審定的品種，編號為遼審玉[2008]387號，是以M54為母本，以S122為父本組配而成的。幼苗葉鞘紫色、苗勢強。株型緊湊，株高302厘米，花絲淡紫色，花藥綠色。穗軸紅色，籽粒黃色。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測玉米品種良玉88號純度的SSR分子標(biāo)記試劑盒，用以檢測玉米品種良玉88號的純度，可以及時準(zhǔn)確的檢測出純度結(jié)果，能夠減少假劣種子坑農(nóng)害農(nóng)案件的發(fā)生，保證糧食種植安全。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種玉米品種良玉88號純度檢測的SSR分子標(biāo)記試劑盒，以玉米品種良玉88號及父母本雙親的基因組DNA為模板，通過對覆蓋全基因組200對SSR引物進行篩選，獲得兩對雙親互補特異性高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定的SSR引物，SEQ ID NO：1和2和SEQ ID NO：3和4。

SEQ ID NO：1 序列（5'→3'） CGGAGGTCGTCAGATGGAGTTCGG

SEQ ID NO：2序列（5'→3'） CCACGTACGGCAATGCAGACAAGG

SEQ ID NO：3 序列（5'→3'） GATCCGCATTGTCAAATGACCAC

SEQ ID NO：4 序列（5'→3'） AGGACACGCCATCGTCATCA

所述的一種玉米品種良玉88號純度檢測SSR分子標(biāo)記試劑盒，以玉米品種良玉88號的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO：1和2或SEQ ID NO：3和4為SSR 特異性引物，進行 PCR擴增。

所述的一種玉米品種良玉88號純度檢測SSR分子標(biāo)記試劑盒，其PCR反應(yīng)體系總體積20μL，包括14.1μL超純水、2μL 10倍PCR緩沖液、1.2μL dNTPs（2.5mmol/L）、0.5μL SSR引物（0.25μmol/L）、0.2μL Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）、2μL DNA，混勻。

所述的一種玉米品種良玉88號純度檢測SSR分子標(biāo)記試劑盒，其反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；72℃延伸5min；4℃保存。

所述的一種玉米品種良玉88號純度檢測的SSR分子標(biāo)記試劑盒，其純度結(jié)果通過帶型統(tǒng)計，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示。

試劑盒中還可包括抽提樣品DNA所需的各種試劑。這些試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。

本發(fā)明的優(yōu)點與效果是：

1.本發(fā)明在對覆蓋玉米全基因組的200對SSR引物進行篩選，獲得兩對雙親互補特異性高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定的SSR引物，由其兩對特異性引物和Taq酶等試劑開發(fā)出針對玉米品種良玉88號純度檢測的試劑盒，可以快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測出玉米品種良玉88號的純度，為品種管理和市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐，還對保證糧食種植安全具有一定的指導(dǎo)意義。

2.本發(fā)明的試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、簡便等優(yōu)點，可以及時準(zhǔn)確的檢測出純度結(jié)果，能夠減少假劣種子坑農(nóng)害農(nóng)案件的發(fā)生，保證糧食種植安全，可為品種管理和市場監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的SEQ ID NO：1和2擴增玉米品種良玉88號及父母本結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明的SEQ ID NO：3和4擴增玉米品種良玉88號及父母本結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

本發(fā)明的檢測方法為：

（1）玉米品種良玉88號基因組DNA提取 隨機數(shù)取100粒種子，采取CTAB法進行DAN提取。

（2）PCR擴增以SEQ ID NO：1和2或SEQ ID NO：3和4為SSR 特異性引物，配制20ul PCR反應(yīng)體系。

（3）PCR反應(yīng)體系總體積20μL，包括14.1μL超純水、2μL 10倍PCR緩沖液、1.2μL dNTPs（2.5mmol/L）、0.5μL SSR特異性引物（0.25μmol/L）、0.2μL Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）、2μL DNA，混勻。

（4）反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；72℃延伸5min；4℃保存。

（5）電泳檢測對PCR產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

（6）純度結(jié)果通過帶型統(tǒng)計，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示。

實施例1

本實施例中用玉米品種良玉88號純度檢測SSR分子標(biāo)記試劑盒，檢測玉米品種良玉88號樣品A的純度。操作流程如下：

1）隨機數(shù)取玉米品種良玉88號樣品A100粒種子，采取CTAB法進行DAN提取。

（2）PCR擴增以SEQ ID NO：1和2為SSR 特異性引物，配制20ul PCR反應(yīng)體系。

（3）PCR反應(yīng)體系總體積20μL，包括14.1μL超純水、2μL 10倍PCR緩沖液、1.2μL dNTPs（2.5mmol/L）、0.5μL SSR特異性引物（0.25μmol/L）、0.2μL Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）、2μL DNA，混勻。

（4）反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；72℃延伸5min；4℃保存。

（5）電泳檢測對PCR產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

（6）純度結(jié)果通過帶型統(tǒng)計，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示。

具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)為97，按公式：

玉米品種良玉88號樣品A純度為=97/100=97%。

實施例2

本實施例中用玉米品種良玉88號純度檢測SSR分子標(biāo)記試劑盒，檢測玉米品種良玉88號樣品B的純度。操作流程如下：

1）隨機數(shù)取玉米品種良玉88號樣品B100粒種子，采取CTAB法進行DAN提取。

（2）PCR擴增以SEQ ID NO：3和4為SSR 特異性引物，配制20ul PCR反應(yīng)體系。

（3）PCR反應(yīng)體系總體積20μL，包括14.1μL超純水、2μL 10倍PCR緩沖液、1.2μL dNTPs（2.5mmol/L）、0.5μL SSR特異性引物（0.25μmol/L）、0.2μL Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）、2μL DNA，混勻。

（4）反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；72℃延伸5min；4℃保存。

（5）電泳檢測對PCR產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

（6）純度結(jié)果通過帶型統(tǒng)計，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測樣品種子粒數(shù)的百分率表示。

具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)為94，按公式：

玉米品種良玉88號樣品A純度為=94/100=94%。