本發(fā)明涉及生物技術和醫(yī)學領域。具體地說，本發(fā)明涉及hsa-miR-3074-5p基因在鑒別RM病理妊娠的方法和應用。
背景技術：
：人類正常妊娠的建立和維持需要經歷胚胎植入、胎盤形成、胚胎發(fā)育等一系列重要環(huán)節(jié)，受到多層面不同系統(tǒng)的協(xié)同調控，其中任一環(huán)節(jié)障礙均會導致自然流產等不良妊娠結局。2005年，人類生殖和胚胎學協(xié)會(ESHRE，EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology)將“流產”定義為：(1)尿妊娠試驗陽性或者血HCG水平升高，但超聲或組織學未能確認妊娠的情況為“生化流失”，一般發(fā)生于妊娠6周之前；(2)當超聲或組織學能夠確認為宮內妊娠時，稱之為“臨床流產”，又可細分為早期流產(妊娠12周之前)與晚期流產(妊娠12周到22周之間)。據(jù)估計，人類妊娠中生化流失率達60％；早期臨床妊娠流產率達15％，并且與年齡顯著相關，在20-24歲時臨床流產率為10％，而40-44歲時，流產率達51％；晚期流產率一般在4％。反復自然流產(recurrentspontaneousmiscarriages，RSM)又稱為RM(recurrentmiscarriages)或者是RPL(recurrentpregnancyloss)，是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次及2次以上的妊娠第20周之前的自然流產，在妊娠期婦女中的發(fā)病率約為1-2％。RSM病因復雜，涉及遺傳、生殖內分泌、生殖道解剖、感染及女性自身免疫等諸多方面，雖然已有大量研究聚焦于這個領域，但仍有半數(shù)以上原因不明。而臨床上對于如何鑒定以及預測RM的發(fā)生的研究，仍是空白。miRNA是一類在真核生物體內廣泛表達的非編碼RNA分子，多由21-25個核苷酸組成，通過與靶基因轉錄產物mRNA的3′-UTR互補結合，抑制其翻譯過程而調控靶基因的表達。目前人類成熟miRNAs的統(tǒng)計量已達2578個(miRBase20.0)，調控著近50％的蛋白編碼基因。miRNA的表達具有組織特異性及時序性(即只在特定的組織和發(fā)育階段表達)，這就意味著其在細胞生長 和發(fā)育過程中起多種調節(jié)作用，包括：細胞增殖、凋亡、代謝、維持干細胞多能性及分化等。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可能參與調控胚胎的發(fā)育和選擇、子宮內膜容受性的形成、母胎界面的血管重鑄和免疫功能調節(jié)等，而上述的這些生物過程均與人妊娠的建立有密切關系，因此有理由相信miRNA在妊娠建立過程中具有重要作用。雖然其確切的作用機制有待闡明，但miRNA作為鑒別RM的候選分子在臨床應用上具有廣闊前景意見顯露出來。綜上所述，從現(xiàn)有的研究可以看出，目前人們對RM的鑒別以及預測方法知之甚少。因此，本領域急需能夠用于RM鑒別和預測的分子，為RM發(fā)病機制的研究及其生物標志分子的篩選鑒定提供新的途徑。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了miRNA-3074與反復自然流產之間的相關性及其應用。本發(fā)明第一方面，提供了miRNA-3074或其檢測試劑的用途，用于制備判斷反復自然流產(recurrentspontaneousmiscarriages，RSM)的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述miRNA-3074來源于哺乳動物，優(yōu)選為小鼠、大鼠或人。在另一優(yōu)選例中，所述miRNA-3074包括miRNA-3074-3p或miRNA-3074-5P，優(yōu)選為miRNA-3074-5p。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有miRNA-3074作為陽性對照。在另一優(yōu)選例中，所述的判斷包括預先判斷。在另一優(yōu)選例中，所述檢測試劑盒的檢測樣本包括血液或組織。在另一優(yōu)選例中，所述的組織包括絨毛組織或蛻膜組織。在另一優(yōu)選例中，所述miRNA-3074的序列如SEQIDNO.:1所示。在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑包括引物、反義核酸、探針或芯片。本發(fā)明第二方面，提供了一種miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應于miRNA-3074。在另一優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸探針含有：互補結合區(qū)；和/或與固相載體相連的連接區(qū)。本發(fā)明第三方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒含有miRNA-3074或其檢測試劑，和說明書，所述的說明書中注明所述的試劑盒用于判斷反復自然流產。在另一優(yōu)選例中，所述的使用說明書注明以下內容：當所檢測的樣本中，miRNA-3074的表達量E1與對照基因表達量E0之比E1/E0≥2，則提示該檢測樣本為反復自然流產樣本。本發(fā)明第四方面，提供了一種體外非診斷性的判斷樣本是否為反復自然流產樣本的方法，包括步驟：測定所述樣本中，miRNA-3074的表達量E1，并將其與與對照基因表達量E0進行比較，若E1/E0≥2，則提示該檢測樣本為反復自然流產樣本。本發(fā)明第五方面，提供了一種分離的miRNA，所述的miRNA選自：(i)miRNA-3074家族的miRNA，或(ii)與miRNA-3074互補的miRNA。在另一優(yōu)選例中，所述的miRNA分離自人。在另一優(yōu)選例中，所述miRNA-3074包括miRNA-3074-3p或miRNA-3074-5P，優(yōu)選為miRNA-3074-5p。本發(fā)明第六方面，提供了一種分離的或人工構建的前體miRNA，所述的前體miRNA能在人細胞內剪切并表達成本發(fā)明第五方面所述的miRNA。本發(fā)明第七方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人細胞轉錄成前體miRNA，所述的前體miRNA能在人細胞內被剪切且表達成本發(fā)明第五方面所述的miRNA。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸具有式I所示的結構：Seq正向-X-Seq反向式I式I中，Seq正向為能在人細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列；Seq反向為與Seq正向基本上互補或完全互補的核苷酸序列；X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補；并且式I所示的結構在轉入人細胞后，形成式II所示的二級結構：式II，式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之間形成的堿基互補配對關系。本發(fā)明第八方面，提供了一種判斷檢測對象是否患有反復自然流產的方法，包括步驟：測定所述檢測對象的樣本中miRNA-3074的表達量E1，并將其與與對照基因表達量E0進行比較，若E1/E0≥2，則提示所述檢測對象患有反復自然流產。應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了hsa-miR-3074-5p的成熟體堿基序列；圖2顯示了采用Real-timePCR鑒定RM絨毛中hsa-miR-3074-5p的表達變化；圖3顯示了采用Real-timePCR鑒定RM血液中hsa-miR-3074-5p的表達。具體實施方式本發(fā)明人經過長期而廣泛的研究，通過檢測反復自然流產樣本血清和正常樣本血清的microRNA表達譜水平，首次從中篩選出特異性的microRNA：hsa-miR-3074。經檢驗證明，hsa-miR-3074作為microRNA標志物可非常有效地區(qū)分反復自然流產組織樣本和正常樣本。在此基礎上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明人利用實時PCR系統(tǒng)，采用△Ct方法(CtmiR-3074—CtU6)比較反復自然流產和正常人群血清中miR-3074表達差異。該microRNA可預測樣本是來自反復自然流產樣本還是正常樣本，其預測準確度高?；诒景l(fā)明的microRNA，可以開發(fā)成試劑盒，用于鑒別反復自然流產。miRNA及其前體本發(fā)明提供了一類新的從人中發(fā)現(xiàn)的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一種RNA分子，從可形成miRNA前體的轉錄物加工而來。成熟 的miRNA通常具有18-26個核苷酸(nt)(更特別的約19-22nt)，也不排除具有其它數(shù)目核苷酸的miRNA分子。miRNA通?？杀籒orthern印跡檢測到。人來源的miRNA可被從人細胞中分離。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。miRNA可從前體miRNA(PrecursormiRNA，Pre-miRNA)加工而來，所述的前體miRNA可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)(發(fā)夾)結構，所述的莖環(huán)結構長度一般在50-100bp之間。所述的前體miRNA可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結構，莖環(huán)結構的莖部兩側包含基本上互補的兩條序列。所述的前體miRNA可以是天然的或是人工合成的。前體miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可與編碼基因的mRNA的至少一部分序列基本上互補。如本文所用，“基本上互補”是指核苷酸的序列是足夠互補的，可以以一種可預見的方式發(fā)生相互作用，如形成二級結構(如莖環(huán)結構)。通常，兩條“基本上互補”的核苷酸序列互相之間至少有70％的核苷酸是互補的；優(yōu)選的，至少有80％的核苷酸是互補的；更優(yōu)選的，至少有90％的核苷酸是互補的；進一步優(yōu)選的，至少有95％的核苷酸是互補的；如98％、99％或100％。一般地，兩條足夠互補的分子之間可以具有最多40個不匹配的核苷酸；優(yōu)選的，具有最多30個不匹配的核苷酸；更優(yōu)選的，具有最多20個不匹配的核苷酸；進一步優(yōu)選的，具有最多10個不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11個不匹配的核苷酸。如本文所用，“莖環(huán)”結構也被稱作“發(fā)夾”結構，是指一種核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區(qū)域(莖部)的二級結構，所述的雙鏈區(qū)域由該核苷酸分子的兩個區(qū)域(位于同一分子上)形成，兩個區(qū)域分列雙鏈部分的兩側；其還包括至少一個“環(huán)”結構，包括非互補的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。即使該核苷酸分子的兩個區(qū)域不是完全互補的，核苷酸的雙鏈部分也可保持雙鏈狀態(tài)。例如，插入、缺失、取代等可導致一個小區(qū)域的不互補或該小區(qū)域自身形成莖環(huán)結構或其它形式的二級結構，然而，該兩個區(qū)域仍可基本上互補，并在可預見的方式中發(fā)生相互作用，形成莖環(huán)結構的雙鏈區(qū)域。莖環(huán)結構是本領域技術人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級結構的核苷酸序列的核酸后，本領域技術人員能夠確定該核酸是否能形成莖環(huán)結構。本發(fā)明所述的miRNA具有如SEQIDNO:1(GUUCCUGCUGAACUGAGCCAG)所示的序列。為了提高miRNA的穩(wěn)定性或其它性質，還可在所述的miRNA的至少一端加上至少一個保護性堿基，如“TT”等。本專利中所述miRNA-3074包括miRNA-3074-3p或miRNA-3074-5P，因為miRNA-3074-3p和miRNA-3074-5P分別是由miRNA-3074前體的5’端臂和3’端臂加工而來的，而且產生的兩種miRNA在表達上沒有明顯的表達差異。反義寡核苷酸根據(jù)本發(fā)明所提供的miRNA序列，可以設計出了其反義寡核苷酸，所述的反義寡核苷酸可在體內下調相應的miRNA的表達。如本文所用，“反義寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又稱為“反義核苷酸”，是指長度約為18-26nt(更特別的約19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其類似物。在本發(fā)明中，所述的“反義寡核苷酸”還包括采用如基于核酸鎖或核酸鏈骨架修飾技術等手段獲得的經修飾的反義核苷酸，所述的修飾基本不改變反義寡核苷酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義寡核苷酸的穩(wěn)定性、活性或治療效果。核酸鎖(lockednucleicacid，LNA)通常是指通過一個亞甲基橋將核糖的2’氧原子和4’碳原子連接起來的修飾技術。LNA能延長miRNA的血清半衰期，提高對靶標親和性，減少脫靶作用的范圍和程度?；诤怂徭湽羌艿男揎椉夹g發(fā)展出的反義藥物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修飾方法有多種，包括硫代法，例如將脫氧核苷酸鏈硫代修飾為硫代脫氧核苷酸鏈。該方法是將DNA骨架上的磷酸鍵的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。應理解，任何能夠保持所述反義寡核苷酸的大部分或全部活性的修飾都包含在本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，對反義寡核苷酸進行核酸鎖修飾；更佳地還進行硫代修飾。將本發(fā)明所述的反義寡核苷酸轉移到人體內后，它們能夠明顯下調相關miRNA的表達。多核苷酸構建物根據(jù)本發(fā)明所提供的miRNA序列，可設計出在被導入后可被加工成可影響 相應的mRNA表達的miRNA的多核苷酸構建物，也即所述多核苷酸構建物能夠在體內上調相應的miRNA的量。因此，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸(構建物)，所述的多核苷酸(構建物)可被人細胞轉錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被人細胞剪切且表達成所述的miRNA。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的多核苷酸構建物含有式I所示的結構：Seq正向-X-Seq反向式I式I中，Seq正向為可在細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向為與Seq正向基本上互補的核苷酸序列；或者，Seq反向為可在細胞中表達成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向為與Seq正向基本上互補的核苷酸序列；X為位于Seq正向和Seq反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正向和Seq反向不互補；式I所示的結構在轉入細胞后，形成式II所示的二級結構：式II式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述；||表示在Seq正向和Seq反向之間形成的堿基互補配對關系。通常，所述的多核苷酸構建物位于表達載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸構建物。所述的表達載體通常還含有啟動子、復制起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建本發(fā)明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。芯片microRNA表達譜芯片通常含有多達幾百個探針，涵蓋多種microRNA，利用DNA雙鏈同源互補的原理在全基因組水平上檢測樣本中所含各種microRNA的含量。因此，可在同一時間對待測樣本中全基因組范圍內的microRNA的轉 錄水平進行檢測。利用本發(fā)明所述的miRNA序列，還可以制備相應的miRNA芯片，進而研究其表達譜以及miRNAs的調節(jié)方式。在另一方面，本發(fā)明還提供一種用于分析miRNA表達譜的芯片，所述的芯片可用于區(qū)分自然反復流產樣本和正常樣本。本發(fā)明的所述的miRNA芯片包括固相載體以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針包括SEQIDNO:1所示的序列。具體地，可根據(jù)本發(fā)明所述的miRNA，設計出適合的探針，固定在固相載體上，形成“寡核苷酸陣列”。所述的“寡核苷酸陣列”是指具有可尋址位置(即以區(qū)別性的，可訪問的地址為特征的位置)的陣列，每個可尋址位置均含有一個與其相連的特征性寡核苷酸。根據(jù)需要，可將寡核苷酸陣列分成多個亞陣。所述固相載體可采用基因芯片領域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經活性基團(如醛基、氨基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。所述的miRNA芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修飾，則其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.Science,1997；278:680和馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京：化學工業(yè)出版社，2000，1-130。另一方面，本發(fā)明還提供了一種通過miRNA芯片檢測人組織中miRNA表達譜的方法，包括步驟：(1)提供分離自人組織的RNA樣品，在所述的RNA上設置標記物；(2)將(1)的RNA與所述的芯片接觸，使所述的RNA與固相載體上的寡核苷酸探針發(fā)生雜交反應，從而在固相載體上形成“寡核苷酸探針-RNA”二元復合物；(3)檢測(2)形成的二元復合物的標記物，從而確定人組織中相應的miRNA的表達譜。從人組織中提取RNA的方法是本領域技術人員熟知的方法，包括Trizol法。更優(yōu)選的，在步驟(1)中，在從人組織組織中分離出RNA樣品后，對RNA樣品進行適當處理，以富集具有一定長度的RNA，所述長度一般在10-100之間(小片段RNA)。在經過上述處理后，利用這些小片段RNA進行后續(xù)的雜交，這樣可提高芯片捕獲miRNA的準確性。本領域人員可方便地分離出具有一定片段長度的RNA，比如可采用凝膠電泳法來分離。對RNA進行標記也是本領域技術人員熟知的方法，其可通過在雜交時加入與RNA特異性結合的標記物的方法實現(xiàn)，所述標記物比如是標記基團。所述的標記基團包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等。這些標記及其標記方法都已是本領域眾所周知的常規(guī)技術。將上述的RNA與miRNA芯片進行雜交時，可以先將miRNA芯片與預雜交緩沖液進行預雜交。本發(fā)明所述的RNA與miRNA芯片之間的固相雜交按照本領域的經典方法進行，本領域一般人員依據(jù)經驗容易確定有關緩沖液、探針和樣本濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。或者也可以參照《分子克隆實驗指南》中所述的。然后根據(jù)標記信號在miRNA芯片上的位置、強度等信息獲取待測信息。若擴增產物用熒光基團標記，也可直接用熒光檢測設備(如激光共聚焦掃描儀Scanarray3000等)獲取待測信息。檢測試劑盒本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述的試劑盒中含有本發(fā)明的芯片。所述的試劑盒可用于檢測miRNA的表達譜；或用于診斷自然反復流產病理妊娠，優(yōu)選的，所述的試劑盒中還含有用于標記RNA樣品的標記物，以及與所述標記物相對應的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于：抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液、抗體等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。本發(fā)明的主要優(yōu)點(a)本發(fā)明提供了一種可用于鑒別診斷自然反復流產的microRNA標志物。(b)由本發(fā)明microRNA標志物可非常有效地對自然反復流產病理妊娠進行診斷和/或預測。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。實施例1血清標志物的篩選方法:選擇于醫(yī)院計劃生育門診就診的反復流產患者,按下列納入標準招募研究對象，再經研究對象知情同意后，收集反復流產15例。1.hsa-miR-3074-5p表達水平的實時熒光定量PCR檢測1)實驗試劑及其配制(1)RT引物：由銳博生物公司提供(RN：R10031.2)，按說明書進行操作，凍干粉配用Rnase-free的水配制成5μM的引物儲存液后，分裝存儲；使用前，稀釋10倍(45μl水+5μl儲存液)，配制成500nM的RT引物工作液。(2)RT酶：MulVReverseTranscriptase，為Roche公司產品。(3)10×PCRBuffer：為AB公司產品。(4)實時熒光定量PCR儀：美國ABI公司的7300Real-TimePCRSystem2)絨毛組織RNA的提取(1)將預先收集在TRIZOL試劑中組織從-80℃冰箱取出，放研缽中，用研棒將組織在液氮中研碎，待組織研成液體狀時，室溫放置5min；(2)吸取液體，4℃，12000rpm離心5min；(3)收集上清，按TRIZOL/ml加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min；(4)4℃，12000rpm離心15min；(5)吸取上層水相，按TRIZOL/ml加入500μl異丙醇，室溫放置10min；(6)4℃，12000rpm離心10min；棄上清，RNA沉于管底；(7)按TRIZOL/ml加入1ml75％乙醇，Vortex懸浮沉淀；(8)4℃，12000rpm離心5min，棄上清；(9)室溫干燥5-10min；(10)用DEPC水溶解RNA(20μl體積)；(11)測OD值(按1:200稀釋)，對RNA進行定量。3)全血RNA的提取(1)將預先收集在TRIZOL試劑中組織從-80℃冰箱取出，放研缽中，用研棒將組織在液氮中研碎，待組織研成液體狀時，室溫放置5min；(2)吸取液體，4℃，12000rpm離心5min；(3)收集上清，按TRIZOL/ml加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2-3min；(4)4℃，12000rpm離心15min；(5)吸取上層水相，按TRIZOL/ml加入500μl異丙醇，室溫放置10min；(6)4℃，12000rpm離心10min；棄上清，RNA沉于管底；(7)按TRIZOL/ml加入1ml75％乙醇，Vortex懸浮沉淀；(8)4℃，12000rpm離心5min，棄上清；(9)室溫干燥5-10min；(10)用DEPC水溶解RNA(20μl體積)；(11)測OD值(按1:200稀釋)，對RNA進行定量。4)RT反應：引物濃度按說明書設定，按下表配制RT反應溶液，所有操作均在冰浴中進行：混勻后瞬時離心，70℃中放置10分鐘后在冰浴中放置2分鐘，在上述引物反應液中，按下表加入試劑，建立50ul的RT反應體系：RT反應溶液19μl10×RTBuffer5μldNTPMix(10mM)1μlRNaseinhibitor(40U/μl)1μlRT酶0.5μlRNase-freeH2O23.5μl總體積50μl為了避免加樣誤差，實際操作中，將上述反應體系中相同的部分合并混勻后再分別上樣，其中設立一個陰性對照反應管(不加RT酶)。RT反應條件：42℃，60分鐘；70℃，10分鐘。5)PCR反應：用ddH2O將RT產物稀釋5倍，即：50μlRT產物+200μlddH2O；按下表建立10μl的PCR反應體系：稀釋后的RT產物2.0μlSYBRGreenMix5.0μlBulge-loopTMF(5uM)0.4μlBulge-loopTMR(5uM)0.4μlRNase-freeH2O2.2μl總體積10μl同理，為了減少避免加樣誤差，實際操作中同樣先準備混合物后再分別加入不同引物。設立1個對照反應(NE)，不加RT產物(用H2O代替)，將PCR反應液加到384孔PCR板(ABI公司)，設3個復孔。按下表設置熱循環(huán)參數(shù)：6)數(shù)據(jù)處理ΔCt＝(目的基因Ct-內參Ct)的平均值；ΔΔCt＝(待測樣品中目的基因ΔCt-參照樣品中目的基因ΔCt)的平均值，若無參照樣品則默認參照樣品ΔCt＝10進行計算，本實驗以CDA/VA樣品為參照樣品，相對樣品初始模板量＝(2-ΔΔCt)的平均值。結果：在反復流產患者外周血樣本中利用qPCR研究發(fā)現(xiàn)，miR-3074-5p的表達的平均Ct值為26.14，標準差為0.35；而在同樣的反應條件下，內參U6表達的的平均Ct值為17.7，標準差為0.54，說明在反復流產的外周血中，miR-3074-5p具有較高水平的表達，而且在不同病例之間的個體差異不顯著。實施例2制備miRNA芯片將本發(fā)明提供的miRNA序列(SEQIDNO:1)轉換成互補序列，根據(jù)產生序列的GC比等特征在序列兩端加上10-20nt的連接序列；核心序列不同，連接序列也不同。連接序列可以由程序隨機產生，連接序列和核心序列形成的探針滿足以下條件：1)探針序列中，同一種核苷酸(A、C、G、T)的數(shù)量不能超過序列總數(shù)的50％；2)任何連續(xù)的A、T或C、G的數(shù)量不能超過序列總數(shù)的25％；3)G、C含量占序列總數(shù)的40％-60％；4)探針序列不能自雜交，即探針序列中互補片段的長度不能超過探針長度的30％。為使合成的探針穩(wěn)定的結合在玻片上，采用常規(guī)的方法在合成后探針的 5’端進行糖基修飾。芯片的點制：先將玻片的表面進行烷基化修飾，以提高結合能力。采用常規(guī)的芯片點樣方法進行點樣，為了檢測雜交試驗的可重復性，每個探針在玻片上點3-6個雜交點。實施例3試劑盒制備將實施例3中制備的芯片封裝好，與使用說明書一起置于一盒中，構成試劑盒。實施例4芯片的檢測驗證對從醫(yī)院獲得多個自然反復流產樣本(包括20例自然反復流產絨毛樣本、20例血清樣本樣本和30例正常樣本)，按實施例1-2的方法制備和標記microRNA，按實施例3的方法制備的芯片，用雙盲法進行檢測。根據(jù)本發(fā)明所示的microRNA標志物的存在與否以及上調和下調情況來判斷樣本。其中，陽性對照和陰性對照分別為已知的自然反復流產樣本和正常樣本。結果表明，包括本發(fā)明的種特異性microRNA的芯片，其正確性以及重復性穩(wěn)定性很好(靈敏度可達88.5％，特異性達71.73％.)，可以有效區(qū)分自然反復流產樣本和正常樣本。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁1 2 3