本發(fā)明涉及到基因工程領域，具體涉及到一種真核生物細胞中3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(GPATs)基因和參與甘油酯合成途徑中第一步酰化反應酶的基因的分離和鑒定；GPATs酶抑制劑的篩選；以及GPATs基因序列的優(yōu)化與改造。

背景技術：

真核生物中，甘油脂的從頭生物合成的初始反應和第二步?；磻謩e是由3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(GPATs)和溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPATs)催化。目前，仍然不清楚高等植物和哺乳動物中究竟含有多少個編碼GPATs和LPATs的基因。

隨著大規(guī)模測序技術的發(fā)展與應用，人們發(fā)現(xiàn)很多基因編碼的蛋白含有保守?；D(zhuǎn)移酶特征序列。然而，大多數(shù)膜結(jié)合GPATs與LPATs都含有這些特征序列，因而通過生物信息學分析難以區(qū)分這些基因到底編碼哪一類?；D(zhuǎn)移酶(Lewin et al.,1999；Zheng et al.,2003)。另外，真核生物中是否存在一類不含有?；D(zhuǎn)移酶特征序列的GPATs，目前仍然不清晰。因此，為了有效的解析甘油脂合成途徑中的第一步關鍵反應，有必要建立一個高效的GPATs篩選鑒定體系。

GPATs酶活性鑒定主要通過體外酶學分析和體內(nèi)遺傳功能互補實驗(Zheng and Zou,2001；McIntyre et al.,1977；Lewin et al.,1999；Lindner et al.,2014)。體外酶學分析依賴于放射性同位素標記，且不適合于高通量篩選；而遺傳功能互補實驗被認為是一種體內(nèi)有效的篩選方法。在原核生物中，已報道的大腸桿菌突變體plsB是一種GPATs功能缺陷型菌株，適合于原核生物GPATs基因的篩選。然而，原核生物II型脂肪酸合成途徑的主要?；w是酰基載體蛋白(acyl-ACP)，區(qū)別于真核生物的酰基供體?；o酶A(acyl-CoA)，導致上述該體系不能應用于真核生物GPATs的篩選(Murata et al.,1997；Zheng and Zou,2001；Zhang and Rock,2008；Manas-Fernandez et al.,2010；Lindner et al.,2014)。

真核生物的甘油脂合成具有高度保守性，因此，可利用酵母GPATs功能缺陷型突變體，建立高效和特異的GPATs遺傳互補篩選體系(Wilkison and Bell,1997；Athenstaedt and Daum,1999；Zheng and Zou,2001；Zheng et al.,2003)。釀酒酵母含有兩個編碼sn-1位的3-磷酸甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因GAT1和 GAT2，催化甘油脂生物合成途徑的第一步?；磻?。研究表明，同時敲除這兩個基因會使酵母雙突變體致死(Zheng and Zou,2001；Zaremberg and McMaster,2002)。在W303菌株遺傳背景下，已構建出兩個條件型的雙敲除突變體CMY228(gat1△gat2△+[pGAL1::GAT1 URA3])和VZY23(gat1△gat2△+[pGAL1::GAT2 URA3])，在含有半乳糖的培養(yǎng)基中能正常生長，而在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中不能生長(Zaremberg and McMaster,2002；Bratschi et al.,2009)。

我們在BY4742菌株遺傳背景下構建了兩個條件型的雙敲除突變體BY-NIU8(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::GAT1 URA3])和BY-LEI5(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::GAT2 URA3])。結(jié)果顯示兩個突變體在含有半乳糖和葡萄糖的培養(yǎng)基中均能生長(GAL1是半乳糖誘導和葡萄糖抑制型的啟動子)。我們推測可能是由于酵母自身GAT1和GAT2互補基因在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中低水平表達，從而維持了酵母雙突變體的生長，這將導致候選GPATs篩選過程中可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，表明該條件型雙突變體不適于GPATs篩選，需進一步優(yōu)化改造。

人們普遍認為一個酶的催化活性在本體細胞中較高，而在異源的細胞中催化活性較低。我們試圖用一個低催化活性的異源互補基因來替代酵母本身的GAT1和GAT2基因，所構建的條件型雙突變體由于異源互補基因或其他編碼sn-1酰基轉(zhuǎn)移酶基因的高表達，在含有半乳糖的培養(yǎng)基中能恢復生長，但在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中低表達情況下不足以恢復生長。之前研究結(jié)果表明，擬南芥AtGPATs基因家族中AtGPAT1和AtGPAT5具有Gat1和Gat2相似的基因功能，但在酵母細胞內(nèi)異源表達的酶催化活性與酵母自身GPATs(Gat1p和Gat2p)活性相比低10倍(Zheng and Zou,2001；Zheng et al.,2003)?；谏鲜黾僭O和研究結(jié)果，我們將利用AtGPAT1和AtGPAT5的特性，擬構建一個新型、特異且穩(wěn)定的酵母遺傳互補體系用于真核生物GPATs篩選，該酵母遺傳互補篩選體系能快速有效的鑒定?；D(zhuǎn)移酶基因，促進甘油磷脂從頭生物合成途徑的研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明構建條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5LEU2])，建立快速和高效的體內(nèi)遺傳互補篩選體系，應用于真核生物中含有或不含有?；D(zhuǎn)移酶特征序列的GAPTs基因的篩選；同時，也可應用于醫(yī)學上抗肥胖病的藥物篩選。

本發(fā)明提供了一種3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶(GPATs)基因的篩選和鑒定方法，包括如下步驟：

步驟一、構建中間型酵母雙突變體：將帶有異源GPATs基因的表達載體通過酵母遺傳轉(zhuǎn)化手段，引入到帶有酵母自身GAT1或GAT2基因(編碼GPATs)的表達載體的酵母雙突變體，獲得含有分別帶有酵母GAT1(或GAT2)基因和一個異源GPAT基因的兩個表達載體的中間型酵母雙突變體；

步驟二、將步驟一所獲得的中間型酵母雙突變體經(jīng)含有尿嘧啶(URA)液體培養(yǎng)基搖菌過夜，然后在含有5-氟乳清酸(5-FOA)和URA的固體培養(yǎng)基上進行篩選，得到新的含有一個異源GPAT基因的表達載體的條件型致死酵母雙突變體；

步驟三、利用改造后的pYES2-yADH1-Kan新型質(zhì)粒構建候選GPATs基因表達載體，導入到新的條件型致死酵母雙突變體。

步驟四、采用含有葡萄糖的培養(yǎng)基作為篩選條件，能使新的條件型致死酵母雙突變體在葡萄糖培養(yǎng)基中恢復生長的異源基因，即為編碼具有GPAT酶活性的基因。

優(yōu)選地，所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法中的步驟一中的異源GPATs基因為擬南芥中的AtGPAT1與AtGPAT5。

優(yōu)選地，所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法中的步驟一中的異源GPATs基因編碼的蛋白序列與擬南芥中的AtGPAT1與AtGPAT5蛋白序列同源性達到85％以上的基因。

優(yōu)選地，所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法中的與擬南芥中的AtGPAT1與AtGPAT5蛋白序列同源性達到85％以上的基因，包括擬南芥(Arabidopsis lyrata)、亞麻薺(Camelina sativa)、薺菜(Capsella rubella)、山萮菜(Eutrema salsugineum)、歐洲油菜(Brassica napus)、高山南芥(Arabis alpina)，蕪菁(Brassica rapa)，醉蝶花(Tarenaya hassleriana)中分別與AtGPAT1和AtGPAT5蛋白序列同源性達到85％以上的基因序列。

優(yōu)選地，所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法中的中間型致死酵母雙突變體構建過程包括：

一、用BamHI和XhoI雙酶切YEplac181-GAT1-LEU2載體，去掉酵母GAT1基因，然后將擬南芥GPATs基因家族中具有GPAT活性的基因通過BamHI和XhoI 這兩個酶切位點克隆至該載體；

二、將上述已構建好的表達載體分別轉(zhuǎn)化酵母雙突變體NIU8和LEI5，獲得含有兩種表達載體的中間型酵母雙突變體。

優(yōu)選地，所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法中的擬南芥GPATs基因家族中具有GPAT活性的基因包括AtGPAT1，AtGPAT5，AtGPAT7。

優(yōu)選地，所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法中的酵母雙突變體NIU8的遺傳型為BY4742 gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT1 URA3，LEI5的遺傳型為BY4742gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT2 URA3，所述的雙突變體NIU8和LEI5是在BY4742菌株遺傳背景下構建而成。

優(yōu)選地，所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法中的中間型酵母雙突變體包括

BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT1 LEU2、

BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT5 LEU2、

BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT7 LEU2、

BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT1 LEU2、

BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT5 LEU2、

BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT7 LEU2、

優(yōu)選地，所述GPATs基因的篩選和鑒定方法中的步驟三中的pYES2-yADH1-Kan新型質(zhì)粒包括如下特征：(1)以酵母乙醇脫氫酶1為啟動子(yADH1)誘導外源候選基因的表達，該啟動子為葡萄糖誘導組成型表達啟動子；(2)引入卡那霉素抗性基因作為該穿梭質(zhì)粒在細菌中的篩選標記；(3)引入酶切位點HindIII、KpnI、SacI、BamHI、SpeI、EcoRI、NofI、XhoI、XbaI用于基因的克隆。

一種將所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于篩選或鑒定三磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。

一種將所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于篩選或鑒定三磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的抑制劑。

一種將所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于優(yōu)化或改造三磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的序列。

一種將所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于篩選或鑒定參與甘油脂合成途徑中第一步?；磻傅幕?。

本發(fā)明的更具體的技術解決方案如下：

1.新型條件型致死酵母雙突變體構建

1.1利用異源?；D(zhuǎn)移酶(GPATs)基因在酵母中表達產(chǎn)生的酶催化活性較低的特性，替代酵母雙突變體中自身編碼GPATs的基因。構建擬南芥?；D(zhuǎn)移酶基因表達載體YEplac181-AtGPAT1(pGAL1::AtGPAT1 LEU2)和YEplac181-AtGPAT5(pGAL1::AtGPAT5 LEU2)分別轉(zhuǎn)化酵母雙突變體BY-NIU8(BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3)和BY-LEI5(BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3)，獲得含有兩種表達載體的中間型酵母雙突變體(如：BY4742 gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT1 LEU2)。

1.2中間型酵母雙突變體經(jīng)含有尿嘧啶(URA)的液體培養(yǎng)基過夜搖菌，部分來源于NIU8突變體細胞丟失pYES2-GAT1(pGAL1::GAT1 URA3)或來源于LEI5突變體細胞丟失pYES2-GAT2(pGAL1::GAT2 URA3)載體，后經(jīng)在含有5-FOA和URA的固體培養(yǎng)基篩選，獲得新的條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2])。

BY4742：酵母基因型；GAT1和GAT2分別位于酵母K與B染色體；gat1△gat2△+pGAL1::GAT1 URA3代表含有pYES2-GAT1質(zhì)粒的酵母雙突變體；gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2代表含有YEplac181-AtGPAT1質(zhì)粒的新型酵母雙突變體。

2.基于新型條件型致死酵母雙突變體的互補體系的建立

2.1由于新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2])的異源擬南芥基因(AtGPAT1和AtGPAT5)在半乳糖誘導下能高效表達(GAL1為半乳糖誘導啟動子)，導致新型條件型致死酵母雙突變體在含有半乳糖的培養(yǎng)基中恢復生長；但在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中(GAL1為葡萄糖抑制型啟動子)，因異源擬南芥基因表達活性較低，新型條件型致死酵母雙突變體不足以恢復生長，表現(xiàn)為雙突致死表型。

2.2基于以上篩選原理，利用改造后的pYES2-yADH1-Kan新型質(zhì)粒(yADH1為葡萄糖誘導表達啟動子)構建候選GPATs基因表達載體，轉(zhuǎn)化新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2])，以含有葡萄糖的培養(yǎng)基作為篩選條件，能夠快速、高效地鑒定候選GPATs基因的功能。

本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點及效果：GPATs的體外酶學分析方法步驟繁瑣，依賴于放射性標記，且篩選效率較低。新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2])篩選體系能避開上述問題，并能解決之前構建的酵母雙突變體篩選體系的假陽性問題；同時，該新型條件型致死酵母雙突變體是一個特異性強且高效的體內(nèi)遺傳互補篩選體系，針對異源GPATs基因有穩(wěn)定可靠的篩選鑒定效果。

具體表現(xiàn)在：

1.利用那些在酵母細胞中異源高表達情況下能夠產(chǎn)生足夠的GPAT活性恢復致死雙突變體生長，但在低表達情況下不足以維持細胞的生長的基因構建條件型致死酵母雙突變體，并用此條件型致死雙突變體篩選鑒定GPATs基因。

2.利用擬南芥基因AtGPAT1和AtGPAT5構建條件型致死酵母雙突變體，并用此條件型致死雙突變體篩選鑒定GPATs基因。

3.利用與AtGPAT1和AtGPAT5同源性高于85％的異源基因構建條件型致死酵母雙突變體，并用此條件型致死雙突變體篩選鑒定GPATs基因。

4.利用其他非植物的異源物種中的GPATs基因，譬如哺乳動物中GPATs基因，構建條件型致死酵母雙突變體，并用此條件型致死雙突變體篩選鑒定GPATs基因。

5.新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2])應用于GPATs篩選鑒定。

6.新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2])應用于GPATs酶活性關鍵序列的鑒定。

7.新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2])和ZAFU2(BY4742，gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2])應用于GPATs抑制劑的篩選鑒定。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明新型酵母雙突變體的構建示意圖。

圖2為本發(fā)明的載體PCR2.1-GAT1和PCR2.1-GAT1的酶切驗證電泳圖。

圖3：表達載體pYES2-GAT1和pYES2-GAT2的酶切電泳圖。

圖4：表達載體pYES2-GAT1圖譜附圖說明。

圖5：GAT1和GAT2基因敲除載體構建示意圖。

圖6：GAT1和GAT2基因敲除載體酶切電泳圖

圖7：表達載體YEplac181-GAT1酶切電泳圖

圖8：YEplac181-GAT1載體圖譜

圖9：lei5、lei7突變體的PCR驗證引物位置圖

圖10：lei5、lei7突變體的PCR驗證PCR電泳圖

圖11：niu7、niu8突變體的PCR驗證引物位置圖

圖12：niu7、niu8突變體的PCR驗證電泳圖

圖13：雙突變體和單突變體在5-FOA培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)圖

圖14：pYES2-Kan-yADH1表達載體圖譜

圖15：新型條件型致死酵母雙突變體遺傳互補體系的篩選效率圖

圖16A：N端氨基酸殘基缺失對AtGAPT1酶活性的影響線形圖

圖16B：N端氨基酸殘基缺失對AtGAPT1酶活性的影響

上述附圖的簡要說明：

圖1：BY4742：酵母基因型；GAT1和GAT2分別位于酵母K與B染色體；gat1△gat2△+pGAL1::GAT1 URA3代表含有pYES2-GAT1質(zhì)粒的酵母雙突變體；gat1△gat2△+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2代表含有YEplac181-AtGPAT1質(zhì)粒的新型酵母雙突變體。

圖2：以酵母基因組為模板擴增出GAT1和GAT2基因，通過T克隆連接到PCR2.1載體上。

1：PCR2.1-GAT1(BamHI和XhoI)；

2：PCR2.1-GAT1(BamHI和XhoI)；

M：DNA Marker

圖3：從載體PCR2.1-GAT1和PCR2.1-GAT1用BamHI+XhoI切下GAT1和GAT2片段，分別連接到表達載體pYES2上。

1、2、3、4：pYES2-GAT1(BamHI+XhoI)；

5、6、7、8：pYES2-GAT2(BamHI+XhoI)；

M：DNA Marker

圖4：表達載體pYES2-GAT1的基因圖譜。

圖5：以pRS423為模板，擴增得到HIS3片段，以PCR2.1-GAT1為模板，擴增得到5’-GAT1-PCR2.1-GAT1-3’片段，同時通過SmaI和PstI雙酶切，連接，得到基因敲除載體PCR2.1-5’-GAT1-PCR2.1-GAT1-3’，并酶切電泳驗證。同理得到基因敲除載體PCR2.1-5’-GAT2-PCR2.1-GAT2-3’。

圖6：GAT1和GAT2基因敲除載體酶切電泳圖

1：GAT1基因敲除載體(SmaI+PstI)；

2：GAT2基因敲除載體(SamI+PstI)；

M：DNA Marker

圖7：以pYES2-GAT1為模板擴增得到pGAL1-GAT1-CYCTT片段，并與YEplac181載體經(jīng)PstI和SmaI雙酶切，連接，得到表達載體YEplac181-GAT1，然后用XhoI和BamHI雙酶切驗證；

M：DNA Marker；1：YEplac181-GAT1(XhoI+BamHI)

圖8：YEplac181-GAT1載體圖譜

圖9：lei5、lei7突變體的PCR驗證，提取突變體基因組，分別用三對引物進行驗證，該圖為驗證引物位置圖。

圖10：改圖為ei5、lei7突變體的PCR驗證的PCR電泳圖

1：以lei5基因組為模板

2：以lei7基因組為模板

1、2：以ZZF27+ZZF10為引物

1’、2’：以ZZF28+ZZF9為引物

1”、2”：以ZZF27+ZZF28為引物

M1：2.0bp DNA Marker

M2：10kb DNA Marker

圖11：niu7、niu8突變體的PCR驗證，提取突變體基因組，分別用三對引物進行驗證，該圖為其驗證引物位置圖。

圖12：niu7、niu8突變體的PCR驗證電泳圖，

1：以niu7基因組為模板

2：以niu8基因組為模板

1、2：以ZZF29+ZZF9為引物

1’、2’：以ZZF30+ZZF10為引物

1”、2”：以ZZF29+ZZF30為引物

M1：2.0bp DNA Marker

M2：10kb DNA Marker

圖13：雙突變體和單突變體在5-FOA培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)圖，取OD600＝0.5菌液，并依次4倍稀釋，5個濃度梯度，分別點到不同的SC培養(yǎng)基上，培養(yǎng)22或33小時。

圖14：pYES2-Kan-yADH1表達載體圖譜

圖15：新型條件型致死酵母雙突變體遺傳互補體系的篩選效率

圖16包括A與B：N端氨基酸殘基缺失對AtGAPT1酶活性的影響。(A)帶有AtGAPT1野生型基因和突變體基因(5’端1-237堿基刪除)的酵母雙突變體的生長曲線分析；(B)4種遺傳型的細胞在不同細胞濃度下的生長差異分析，這4種遺傳型分別為帶有空白質(zhì)粒的酵母雙突變體、帶有野生型AtGAPT1基因的酵母雙突變體、帶有5’端1-237堿基刪除的AtGAPT1基因和帶有5’端1-372堿基刪除的AtGAPT1基因的酵母突變體。最初細胞濃度為OD₆₀₀＝0.5，按1:5稀釋。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。

實施例：

1.遺傳互補體系的構建

1.1表達載體構建

1.1.1表達載體pYES2-GAT1和pYES2-GAT2的構建

以酵母基因組為模板，GAT1 FP和GAT1 RP為引物，擴增GAT1片段，GAT2 FP和GAT2 RP為引物，擴增GAT2片段，通過TA克隆，分別連接到載體PCR2.1上，構成載體PCR2.1-GAT1和PCR2.1-GAT1，并通過BamHI和XhoI雙酶切進行驗證，電泳如圖2，GAT1片段大小為2.2kb，GAT2片段大小約2.2kb，PCR2.1大小約3.9kb。

用BamHI和XhoI兩個限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR2.1-GAT1和pYES2載體，回收GAT1和pYES2兩個片段，連接得到過表達載體pYES2-GAT1，并通過BamHI和XhoI雙酶切驗證，電泳如圖3，GAT1大小約2.2kb，pYES2大小約5.9kb。

用BamHI和XhoI兩個限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR2.1-GAT2和pYES2載體，回收GAT2和pYES2兩個片段，連接得到過表達載體pYES2-GAT2，并通過BamHI和 XhoI雙酶切驗證，電泳如圖3，GAT2大小約2.2kb，pYES2大小約5.9kb。

1.1.2 GAT1和GAT2基因敲除載體的構建

以PCR2.1-GAT1為模板，ZZF11和ZZF12為引物，擴增5’-GAT1-PCR2.1-GAT1-3’片段；以pRS423為模板，ZZF15和ZZF16擴增HIS3片段，同時用SamI和PstI雙酶切，然后連接到一起，構成新載體PCR2.1-5’-GAT1-HIS3-GAT1-3’，并通過SamI和PstI雙酶切進行驗證，電泳如圖6，5’-GAT1-HIS3-GAT1-3’片段大小約2.0kb，PCR2.1大小約3.9kb。同理，以PCR2.1-GAT2為模板，ZZF13和ZZF14為引物，擴增5’-GAT2-PCR2.1-GAT2-3’片段，同時用SamI和PstI雙酶切，然后連接到一起，構成新載體PCR2.1-5’-GAT2-HIS3-GAT2-3’，并通過SamI和PstI雙酶切進行驗證，電泳如圖6，5’-GAT2-HIS3-GAT2-3’片段大小約2.0kb，PCR2.1大小約3.9kb。

以PCR2.1-5’-GAT1-HIS3-GAT1-3’為模板，ZZF17和ZZF18為引物，利用高保真酶擴增得到5’-GAT1-HIS3-GAT1-3片段，回收備用，用于敲除酵母基因組中的GAT1基因。

以PCR2.1-5’-GAT2-HIS3-GAT2-3’為模板，ZZF19和ZZF20為引物，利用高保真酶擴增得到5’-GAT2-HIS3-GAT2-3’片段，回收備用，用于敲除酵母基因組中的GAT2基因。

1.1.3表達載體YEPlac181-GAT1的構建

以pYES2-GAT1為模板，ZZF45和ZZF46為引物，用高保真酶擴增得到GAL1-GAT1-CYC1TT(啟動子+GAT1片段+終止子)片段。用PstI和SmaI雙酶切GAL1-GAT1-CYC1TT片段和YEplac181，連接得到過表達載體YEPlac181-GAT1，并通過BamHI+XhoI雙酶切驗證，電泳如圖7。

1.2.條件型雙突變體的構建

將載體pYES2-GAT2轉(zhuǎn)入到gat2△突變體中，通過SC-URA+Gal(半乳糖)培養(yǎng)基進行篩選，得到新突變體gat2△+[pGAL1::GAT2 URA3]。利用同源重組原理，將GAT1U-HIS3-GAT1D片段導入到突變體gat1△gat2△+[pGAL1::GAT2 URA3]中，代替突變體中的GAT1基因，通過SC-URA(尿嘧啶)-His(組氨酸)+Gal培養(yǎng)基進行篩選，并利用引物ZZF27+ZZF10、ZZF28+ZZF9和ZZF27+ZZF28(圖9)進行PCR驗證，電泳如圖10。得到兩個陽性克隆gat1△gat2△+[pGAL1::GAT2 URA3]，命名為LEI5-1、lEI5-2。

將載體pYES2-GAT1轉(zhuǎn)入到gat1△突變體中，通過SC-URA+Gal培養(yǎng)基進行篩選，得到新突變體gat1△+[pGAL1::GAT1 URA3]。利用同源重組原理，將GAT2U-His-GAT2D片段導入到突變體gat1△gat2△+[pGAL1::GAT1 URA3]中，代替突變體中的GAT2基因，通過SC-URA-His+Gal培養(yǎng)基進行篩選，并利用引物ZZF29+ZZF9、ZZF30+ZZF10和ZZF29+ZZF30進行PCR驗證，電泳如圖12。得到兩個陽性克隆gat1△gat2△+[pGAL1::GAT1 URA3]，命名為niu8-1、niu8-2。

1.3雙突變體的FOA驗證

5-FOA作為一種負篩選藥物，在酵母細胞能表達URA3時，URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5-磷酸脫羧酶，它能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎拘晕镔|(zhì)，使細胞無法生長。反之，細胞可以生長。

先用含URA的SC培養(yǎng)基搖菌，部分gat1△+pYES2、gat2△+pYES2-URA3、gat1△+pYES1-GAT2中的pYES2質(zhì)粒會丟失，分別形成gat1△、gat2△、gat1△突變體，能在含URA培養(yǎng)基上生長。而那些沒有丟失pYES2質(zhì)粒的酵母就會表達URA3，在含5-FOA的培養(yǎng)基上無法生長，在不含5-FOA的培養(yǎng)基上能生長。

先用含URA的SC培養(yǎng)基搖菌，使得部分LEI5、NIU8中的pYES2質(zhì)粒丟失，而不能生長，而那些沒有丟失pYES2質(zhì)粒的酵母就表達URA3，在含5-FOA的培養(yǎng)基上無法生長，在不含5-FOA的培養(yǎng)基上能生長。

根據(jù)以上結(jié)果，我們可以得出：在上述5-FOA的篩選體系中，雙突變體的存活依賴于GAT1或GAT2基因的表達。目的基因和YEplac181的組合表達載體轉(zhuǎn)到LEI5中，先用含URA的SC培養(yǎng)基搖菌，pYES2質(zhì)粒丟失，經(jīng)過5-FOA篩選得到的突變體，其導入的目的基因是與GAT1或GAT2功能相似的基因。由此，我們建立了一個新的GPATs的篩選體系，下一步就進行目的基因的篩選。

2.新型條件型致死酵母雙突變體構建

用BamHI和XhoI雙酶切YEplac181-GAT1-LEU2載體(圖8)，去掉酵母GAT1基因，然后將擬南芥GPATs基因家族中具有GPAT活性的基因(AtGPAT1，AtGPAT4，AtGPAT5，AtGPAT6，AtGPAT7，AtGPAT8)通過BamHI和XhoI這兩個酶切位點克隆至該載體。新構建的表達載體具有以下特征：i外源基因由半乳糖(GAL1)誘導啟動子驅(qū)動；ii同時引入相應的CYC終止子。

將上述已構建好的表達載體分別轉(zhuǎn)化酵母雙突變體NIU8(BY4742 gat1Δ gat2Δ+[pGAL1::GAT1 URA3])和LEI5(BY4742 gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT2URA3])，獲得含有兩種表達載體的中間型酵母雙突變體(BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT1 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT4 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT5 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT6 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT7 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1 URA3+pGAL1::AtGPAT8 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT1 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT4 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT5 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT6 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT7 LEU2、BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2 URA3+pGAL1::AtGPAT8 LEU2)。

將中間型酵母雙突變體在含有半乳糖和尿嘧啶且不含有組氨酸和亮氨酸的SC液體培養(yǎng)中過夜搖菌，約有1％的中間型酵母雙突變體會丟失含有尿嘧啶篩選標記的表達載體pGAL::GAT1 URA3或pGAL::GAT2 URA3；然后分別涂布于含有尿嘧啶和5-氟乳清酸且不含有組氨酸和亮氨酸的半乳糖固體培養(yǎng)基平板以及含有尿嘧啶和5-氟乳清酸且不含有組氨酸和亮氨酸的葡萄糖固體培養(yǎng)基平板上。而未丟失尿嘧啶篩選標記表達載體的酵母細胞在含有5-氟乳清酸的培養(yǎng)基中由于尿嘧啶基因的表達使5-氟乳清酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘缘奈镔|(zhì)，使酵母細胞無法生長。上述篩選結(jié)果顯示，來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT1、YEPlac181-AtGPAT5和YEPlac181-AtGPAT7載體的原始遺傳型雙突變體的部分酵母細胞在含有半乳糖的培養(yǎng)基中能正常生長，而在葡萄糖的培養(yǎng)中則完全不能生長；且來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT7載體的原始遺傳型雙突變體生長速度明顯慢于來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT1和YEPlac181-AtGPAT5載體的原始遺傳型雙突變體；另外，來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT4、YEPlac181-AtGPAT6和YEPlac181-AtGPAT8載體的原始遺傳型雙突變體在半乳糖和葡萄糖的培養(yǎng)基中均不能生長(表1)。

對來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT1、YEPlac181-AtGPAT5和YEPlac181-AtGPAT7載體的原始遺傳型雙突變體隨機挑選單克隆進行URA3、GAT1、AtGPAT1、AtGPAT5、和AtGPAT7基因的PCR檢測。結(jié)果顯示，來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT1、YEPlac181-AtGPAT5和YEPlac181-AtGPAT7的酵母單克 隆分別含有擬南芥外源基因AtGPAT1、AtGPAT5和AtGPAT7；其中，來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT1和YEPlac181-AtGPAT5載體的原始遺傳型雙突變體單克隆且不含有URA3和GAT1基因，而來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT7載體的5個單克隆中僅有1個存在GAT1基因(表1)，表明擬南芥AtGPAT1、AtGPAT5和AtGPAT7基因具有與酵母GAT1和GAT2相同的GPAT催化活性，使新形成的酵母雙突變體(gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2]、gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT5LEU2]和gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT7 LEU2])在半乳糖誘導條件下能恢復生長，而在葡萄糖培養(yǎng)基中由于外源基因活性較低而不能恢復生長。

我們將上述新形成的條件型致死酵母雙突變體gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1LEU2、gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT5 LEU2和gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT7 LEU2分別命名為ZAFU1、ZAFU2和ZAFU3。

表1 NIU8遺傳型酵母雙突變體自身GAT1基因被擬南芥AtGPAT基因家族基因替換后的表型及PCR檢測結(jié)果

*來源于轉(zhuǎn)化YEPlac181-AtGPAT1和YEPlac181-AtGPAT5的原始遺傳型雙突變體酵母細胞在SC+URA-His-leu+gal+FOA固體培養(yǎng)基上涂板1x10⁶個細胞，對照和其他候選基因涂板5x10⁷個細胞。

**被檢測含有目的基因的細胞占全部檢測細胞的比例

3.新型條件型致死酵母雙突變體的互補體系的建立

以新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1(gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1LEU2)為基礎，利用葡萄糖特異誘導啟動子表達載體，構建一個篩選異源GPATs基因的酵母體內(nèi)遺傳互補體系。我們已成功改造并獲得了用于條件型致死酵母雙突變體遺傳互補篩選的表達載體pYES2-Kan-yADH1(圖14)，它具有以下特征：i以酵母乙醇脫氫酶1為啟動子(yADH1)誘導外源候選基因的表達，該啟動子為葡萄糖誘導組成型表達啟動子；ii表達載體引入卡那霉素作為原核表達 篩選標記，不同于條件型致死酵母雙突變體的互補載體的氨芐青霉素篩選標，易于分離候選互補基因；iii引入多克隆位點HindIII、KpnI、SacI、BamHI、SpeI、EcoRI、NofI、XhoI、XbaI，便于外源獲選基因的克隆。

我們將4個已知的酵母基因(GAT1，GAT2，SCL1和PST1)和一個擬南芥基因(LPAT4)克隆至pYES2-Kan-yADH1表達載體，并轉(zhuǎn)化至新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1，利用含有葡萄糖的培養(yǎng)基作為篩選條件。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化具有GAPT催化活性的酵母GAT1和GAT2基因能使條件型致死酵母雙突變體ZAFU1在葡萄糖培養(yǎng)基中恢復生長，而其余無GAPT催化活性的基因則不能使條件型致死酵母雙突變體ZAFU1恢復生長(表2)。另外，轉(zhuǎn)化酵母GAT1和GAT2基因的條件型致死酵母雙突變體ZAFU1不僅能在葡萄糖培養(yǎng)中恢復生長，而且突變體在半乳糖培養(yǎng)基中的生長速率也隨之提高，表明突變體的生長速率與GAPT催化活性緊密相關，同時，也表明我們所構建的新型條件型致死酵母雙突變體是一個非常可行、穩(wěn)定和特異的真核生物GAPTs基因篩選體系。

表2 基于新型條件型致死酵母雙突變體遺傳互補篩選體系的GPAT基因篩選

我們利用酵母GAT1基因?qū)ι鲜鲂滦蜅l件型致死酵母雙突變體ZAFU1遺傳互補篩選體系的高效性進行進一步的檢測。將空載體(對照)、pYES2-Kan-yADH1+GAT1表達載體以及二者按1:1000和1:5000的比例混合后的載體轉(zhuǎn)化新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1，再進行半乳糖和葡萄糖培養(yǎng)基篩選。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化pYES2-Kan-yADH1+GAT1表達載體條件型致死酵母雙突變體ZAFU1能很好的恢復生長，而對照則完全沒有細胞生長(圖15)；同時，空載體(對照)和pYES2-Kan-yADH1+GAT1表達載體在濃度為1:1000的條件下也能 獲得較好的陽性互補實驗結(jié)果(圖15)，表明該新型條件型致死酵母雙突變體ZAFU1遺傳互補篩選體系具有較高的篩選效率。

4.控制AtGPAT1酶活性的關鍵氨基酸殘基的發(fā)掘

我們將AtGPAT1基因5‘端不同長度堿基對缺失的突變體克隆至pYES2-Kan-yADH1載體，然后轉(zhuǎn)化條件致死型突變體ZAFU1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將AtGPAT1基因5‘端237個堿基對(對應多肽N端氨基酸殘基1-79)刪除，的AtGPAT1突變體與野生型AtGPAT1一樣，都能使酵母突變體恢復生長，因而表明N端氨基酸殘基1-79并不顯著影響GPAT酶的活性(圖16A，B)。但是當把AtGPAT1基因5‘端372個堿基對(對應多肽N端氨基酸殘基1-124)刪除，AtGPAT1基因的突變體不能恢復條件致死型酵母突變體的生長能力，因而表明多肽N端氨基酸殘基80-124是GPAT酶活性所必需的。

此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實施例，其提到的一些物質(zhì)所取名稱等可以不同，凡依本發(fā)明專利構思所述的特征及原理所做的等效或簡單變化，均包括于本發(fā)明專利的保護范圍內(nèi)，本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結(jié)構或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。