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一種3-磷酸甘油?;D(zhuǎn)移酶基因的篩選和鑒定方法與流程

文檔序號(hào):12577694閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種3-磷酸甘油?;D(zhuǎn)移酶(GPATs)基因的篩選和鑒定方法,其特征在于包括如下步驟:

步驟一、構(gòu)建中間型酵母雙突變體:將帶有異源GPATs基因的表達(dá)載體通過酵母遺傳轉(zhuǎn)化手段,引入到帶有酵母自身GAT1或GAT2基因(編碼GPATs)的表達(dá)載體的酵母雙突變體,獲得含有分別帶有酵母GAT1(或GAT2)基因和一個(gè)異源GPAT基因的兩個(gè)表達(dá)載體的中間型酵母雙突變體;

步驟二、將步驟一所獲得的中間型酵母雙突變體經(jīng)含有尿嘧啶(URA)液體培養(yǎng)基搖菌過夜,然后在含有5-氟乳清酸(5-FOA)和URA的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,得到新的含有一個(gè)異源GPAT基因的表達(dá)載體的條件型致死酵母雙突變體;

步驟三、利用改造后的pYES2-yADH1-Kan新型質(zhì)粒構(gòu)建候選GPATs基因表達(dá)載體,導(dǎo)入到新的條件型致死酵母雙突變體。

步驟四、采用含有葡萄糖的培養(yǎng)基作為篩選條件,能使新的條件型致死酵母雙突變體在葡萄糖培養(yǎng)基中恢復(fù)生長的異源基因,即為編碼具有GPAT酶活性的基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的步驟一中的異源GPATs基因?yàn)閿M南芥中的AtGPAT1與AtGPAT5。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的步驟一中的異源GPATs基因編碼的蛋白序列與擬南芥中的AtGPAT1與AtGPAT5蛋白序列同源性達(dá)到85%以上的基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的與擬南芥中的AtGPAT1與AtGPAT5蛋白序列同源性達(dá)到85%以上的基因,包括擬南芥(Arabidopsis lyrata)、亞麻薺(Camelina sativa)、薺菜(Capsella rubella)、山萮菜(Eutrema salsugineum)、歐洲油菜(Brassica napus)、高山南芥(Arabis alpina),蕪菁(Brassica rapa),醉蝶花(Tarenaya hassleriana)中分別與AtGPAT1和AtGPAT5蛋白序列同源性達(dá)到85%以上的基因序列。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的中間型致死酵母雙突變體構(gòu)建過程包括:

一、用BamHI和XhoI雙酶切YEplac181-GAT1-LEU2載體,去掉酵母GAT1基因,然后將擬南芥GPATs基因家族中具有GPAT活性的基因通過BamHI和XhoI 這兩個(gè)酶切位點(diǎn)克隆至該載體;

二、將上述已構(gòu)建好的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化酵母雙突變體NIU8和LEI5,獲得含有兩種表達(dá)載體的中間型酵母雙突變體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的擬南芥GPATs基因家族中具有GPAT活性的基因包括AtGPAT1,AtGPAT5,AtGPAT7。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的酵母雙突變體NIU8的遺傳型為BY4742gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT1URA3,LEI5的遺傳型為BY4742gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT2URA3,所述的雙突變體NIU8和LEI5是在BY4742菌株遺傳背景下構(gòu)建而成。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的中間型酵母雙突變體包括

BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1URA3+pGAL1::AtGPAT1LEU2、

BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1URA3+pGAL1::AtGPAT5LEU2、

BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT1URA3+pGAL1::AtGPAT7LEU2、

BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2URA3+pGAL1::AtGPAT1LEU2、

BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2URA3+pGAL1::AtGPAT5LEU2、

BY4742gat1△gat2△+pGAL::GAT2URA3+pGAL1::AtGPAT7LEU2。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述GPATs基因的篩選和鑒定方法,其特征在于所述的步驟三中的pYES2-yADH1-Kan新型質(zhì)粒包括如下特征:(1)以酵母乙醇脫氫酶1為啟動(dòng)子(yADH1)誘導(dǎo)外源候選基因的表達(dá),該啟動(dòng)子為葡萄糖誘導(dǎo)組成型表達(dá)啟動(dòng)子;(2)引入卡那霉素抗性基因作為該穿梭質(zhì)粒在細(xì)菌中的篩選標(biāo)記;(3)引入酶切位點(diǎn)HindIII、KpnI、SacI、BamHI、SpeI、EcoRI、NofI、XhoI、XbaI用于基因的克隆。

10.一種將權(quán)利要求1至9任一所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于篩選或鑒定三磷酸甘油?;D(zhuǎn)移酶基因。

11.一種將權(quán)利要求1至9任一所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于篩選或鑒定三磷酸甘油?;D(zhuǎn)移酶基因的抑制劑。

12.一種將權(quán)利要求1至9任一所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于優(yōu)化或改造三磷酸甘油?;D(zhuǎn)移酶基因的序列。

13.一種將權(quán)利要求1至9任一所述的GPATs基因的篩選和鑒定方法用于篩選或鑒定參與甘油脂合成途徑中第一步?;磻?yīng)酶的基因。

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