本發(fā)明屬于海洋天然產(chǎn)物領(lǐng)域，涉及一種鯊魚(yú)軟骨中具有生物活性Ⅱ型膠原蛋白的制備方法。
背景技術(shù)：
Ⅱ型膠原蛋白以原骨膠原同型三聚體的超螺旋結(jié)構(gòu)存在于哺乳動(dòng)物軟骨，是由3條相同的α1(Ⅱ)鏈組成的，在合成過(guò)程中原骨膠原α鏈的修飾是通過(guò)脯氨酰、賴氨酰羥化酶在細(xì)胞內(nèi)對(duì)脯氨酸，賴氨酸羥基化，特定的羥賴氨酸的糖基化，鏈的結(jié)合以及鏈內(nèi)二硫鍵的產(chǎn)生，從而形成了三鏈螺旋結(jié)構(gòu)。Ⅱ型膠原蛋白只在軟骨組織中發(fā)現(xiàn)，它構(gòu)成了60％的軟骨干重，在哺乳動(dòng)物透明軟骨中含量豐富，約占軟骨組織蛋白質(zhì)總量的80％。軟骨的兩種主要成分分別是纖維狀的Ⅱ型膠原蛋白和大分子量的蛋白聚糖，能夠起到保護(hù)組織的作用。軟骨的大多數(shù)生理特征是依賴于完整的Ⅱ型膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)。
Ⅱ型膠原蛋白最初以前體的形式在軟骨結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞合成，隨后被拼接成前膠原ⅡA和前膠原ⅡB兩種方式，不同分子形式的Ⅱ型膠原蛋白是由于氨基端前肽的半胱氨酸富集區(qū)的選擇性切割而形成的。前膠原ⅡA在N末端有一段半胱氨酸富集區(qū)，稱(chēng)為Ⅱ型前膠原A氨基端前肽，主要見(jiàn)于前期軟骨組織成纖維細(xì)胞和胚胎組織中，而前膠原ⅡB的N末端缺乏這種半胱氨酸富集區(qū)，主要存在于成年哺乳動(dòng)物軟骨成纖維細(xì)胞中。Ⅱ型膠原前體剪切掉氨基端前肽，經(jīng)羥基化修飾后，通過(guò)二硫鍵連接成三螺旋結(jié)構(gòu)分泌至細(xì)胞外成為軟骨基質(zhì)中的結(jié)構(gòu)蛋白。
Ⅱ型膠原蛋白作為典型的結(jié)構(gòu)蛋白，含有大部分常見(jiàn)氨基酸，其中甘氨酸和羥脯氨酸的含量很高，但不含有色氨酸或其它氨基酸含量很少?；诎被針?gòu)成的膠原蛋白3條肽鏈形成的空間超螺旋結(jié)構(gòu)，和每一條肽鏈重復(fù)出現(xiàn)的Gly-X-Y三肽單元密切相關(guān)。甘氨酸的空間位置能優(yōu)化多肽鏈折疊構(gòu)象，而且甘氨酸是唯一適合肽鏈折疊內(nèi)部位置的氨基酸，產(chǎn)生(Gly-X-Y)n氨基酸序列的重復(fù)，最為常見(jiàn)的三肽單元Gly-Pro-Hyp有助于三股螺旋的穩(wěn)定。Phanat等從鯊魚(yú)軟骨中分離的膠原蛋白熱變性溫度34.56～36.73℃。陳申汝等人從灰星鯊魚(yú)軟骨中提取膠原蛋白的方法把鯊魚(yú)軟骨規(guī)則切成小塊，將脫鈣洗滌時(shí)間需要5天左右。
Ⅱ型膠原蛋白一般是從豬、羊和雞等陸生生物軟骨中分離得到。Ⅱ型膠原蛋白的提取方法主要是胃蛋白酶水解法，但軟骨粉的前處理去除非膠原成分部分與純化步驟是本發(fā)明的特殊之處，本發(fā)明采用0.1mol/L NaOH和0.5mol/L EDTA除去軟骨中的非膠原成分，消除了鹽酸胍殘留存在的安全隱患，安全性更高，應(yīng)用范圍更廣。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生物活性Ⅱ型膠原蛋白生產(chǎn)方法，膠原蛋白的提取過(guò)程較簡(jiǎn)便，安全性更高，應(yīng)用范圍更廣。
.一種鯊魚(yú)軟骨中具有生物活性Ⅱ型膠原蛋白的制備方法，包括如下步驟：
(1)獲取鯊魚(yú)軟骨材料，將獲取的軟骨處理后切成3-5mm薄片，將切碎的軟骨薄片冷凍干燥；通過(guò)冷凍干燥后粉碎可以最大限度提高膠原的提取率和維持其部分生物活性功能。
(2)再將冷凍干燥后的軟骨粉碎成80-200目的粉末，進(jìn)行除雜過(guò)程；
(3)胃蛋白酶水解提?、蛐湍z原蛋白，獲得含Ⅱ型膠原蛋白的混合液；酸性環(huán)境下Ⅱ型膠原蛋白的提取效率更高。
(4)通過(guò)鹽析、透析、冷凍干燥后得到具有生物活性的Ⅱ型膠原蛋白。
進(jìn)一步，所述鯊魚(yú)軟骨材料選自藍(lán)鯊軟骨。稍高于其他鯊魚(yú)軟骨的提取效率。
進(jìn)一步，所述步驟(2)中的除雜過(guò)程具體如下：將鯊魚(yú)軟骨粉0.1-0.2mol/L NaOH 1：5-15體積比混合，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，?-3小時(shí)更換一次堿液，攪拌結(jié)束后用去離子水反復(fù)洗滌，直至pH為7.0-7.6,再用0.5-1mol/L，pH7.0-7.6EDTA溶液連續(xù)攪拌除去礦物質(zhì)，每8-10h更換一次溶液，攪拌結(jié)束后用20-30倍體積的去離子水連續(xù)攪拌10-20min，共2-5次，最后得到去除雜質(zhì)后脹潤(rùn)的鯊魚(yú)軟骨粉。Ⅱ型膠原蛋白存在條件相對(duì)緩和，有利于其生物活性的維持。
進(jìn)一步，所述步驟(3)胃蛋白酶水解提取Ⅱ型膠原蛋白的具體步驟如下：將除去雜質(zhì)后脹潤(rùn)的鯊魚(yú)軟骨粉與用0.5-1mol/L乙酸配成的1-2％胃蛋白酶液以1：10-20體積比混合，經(jīng)過(guò)充分?jǐn)嚢韬螅?000-10000rpm離心，取上清液，用NaOH將pH調(diào)至7.4-7.6；加入NaCl鹽析，并攪拌使Ⅱ型膠原蛋白充分析出，6000-10000rpm離心得沉淀；透析，沉淀用的0.5-1mol/L乙酸使之恰好溶解，用20-30倍體積的0.1-0.2mol/L乙酸透析12-36h，再用20-30倍體積的去離子水透析24-72h；透析液冷凍干燥后保藏。
進(jìn)一步，除冷凍干燥外所有操作在3-5℃條件下進(jìn)行。
進(jìn)一步，除冷凍干燥外所有操作在4℃條件下進(jìn)行，以保持Ⅱ型膠原蛋白的生物活性。
本發(fā)明的有益效果是：
1.本發(fā)明對(duì)原料進(jìn)行冷凍干燥后再粉碎，既保持了其生物活性，又為原料的后續(xù)處理提供了方便。
2.本發(fā)明技術(shù)方案簡(jiǎn)便易行、標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)、產(chǎn)量高。
3.本發(fā)明中，Ⅱ型膠原蛋白的提取過(guò)程較簡(jiǎn)便，便于放大。
4.本發(fā)明中，軟骨粉的處理過(guò)程更有獨(dú)創(chuàng)性，且簡(jiǎn)便易行，污染小，能耗低。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1、取10kg的鯊魚(yú)軟骨。人工去除殘肉、骨膜等雜質(zhì)，生理鹽水洗滌3次并晾干。
2、將軟骨切成3mm的薄片，于冷凍干燥機(jī)中-25℃、10Pa下凍干。
3、將軟骨粉碎成200目的粉末。
4、將鯊魚(yú)軟骨粉與0.1mol/L NaOH 1：10體積比混合，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，?小時(shí)更換一次堿液，攪拌結(jié)束后用去離子水反復(fù)洗滌，直至pH為7.0,用0.5mol/L，pH7.4EDTA溶液連續(xù)攪拌除去礦物質(zhì)，每8h更換一次溶液，攪拌結(jié)束后用20倍體積的去離子水連續(xù)攪拌10min，共3次，最后得到去除雜質(zhì)后脹潤(rùn)的鯊魚(yú)軟骨粉。
5、將脹潤(rùn)的鯊魚(yú)軟骨粉與用0.5mol/L乙酸配成的1％胃蛋白酶液以1：10體積比混合，經(jīng)過(guò)充分?jǐn)嚢韬螅?000-10000rpm離心，取上清液，用NaOH將pH調(diào)至7.5；加入NaCl至2.6mol/L鹽析，并攪拌使Ⅱ型膠原蛋白充分析出，8000rpm離心得沉淀；透析，沉淀用的0.5mol/L乙酸使之恰好溶解，用25倍體積的0.1mol/L乙酸透析24h，再用25倍體積的去離子水透析48h；透析液冷凍干燥后保藏。
獲得1.16kgⅡ型膠原蛋白，經(jīng)測(cè)定Ⅱ型膠原蛋白純度在93.4％，分子量為130kD，在SDS-PAGE顯示出α1鏈及其二聚體，提取出的Ⅱ型膠原蛋白中羥脯氨酸和甘氨酸的含量達(dá)到7.09％，Gly殘基占氨基酸殘基總數(shù)的30％以上，藍(lán)鯊Ⅱ型膠原蛋白具有(Gly-Xaa-Yaa)的氨基酸殘基構(gòu)成特點(diǎn)，符合膠原蛋白的特征。
經(jīng)測(cè)試熱變形溫度達(dá)到了41℃。
通過(guò)抗氧化試劑盒測(cè)定，Ⅱ型膠原蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率為21.85％。
對(duì)比例1
1、取10kg的鯊魚(yú)軟骨。人工去除殘肉、骨膜等雜質(zhì)，生理鹽水洗滌3次并晾干。
2、將軟骨切成3mm的薄片。
3、將軟骨粉碎成200目的粉末。
4、將鯊魚(yú)軟骨粉與0.1mol/LNaOH 1：10體積比混合，進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，?小時(shí)更換一次堿液，攪拌結(jié)束后用去離子水反復(fù)洗滌，直至pH為7.0,用0.5mol/L，pH7.4EDTA溶液連續(xù)攪拌除去礦物質(zhì)，每8h更換一次溶液，攪拌結(jié)束后用20倍體積的去離子水連續(xù)攪拌10min，共3次，最后得到去除雜質(zhì)后脹潤(rùn)的鯊魚(yú)軟骨粉。
5、將脹潤(rùn)的鯊魚(yú)軟骨粉與用0.5mol/L乙酸配成的1％胃蛋白酶液以1：15體積比混合，經(jīng)過(guò)充分?jǐn)嚢韬螅?000-10000rpm離心，取上清液，用NaOH將pH調(diào)至7.5；加入NaCl至2.6mol/L鹽析，并攪拌使Ⅱ型膠原蛋白充分析出，8000rpm離心得沉淀；透析，沉淀用的0.5mol/L乙酸使之恰好溶解，用25倍體積的0.1mol/L乙酸透析24h，再用25倍體積的去離子水透析48h；透析液冷凍干燥后保藏。
獲得1.09kgⅡ型膠原蛋白，經(jīng)測(cè)定Ⅱ型膠原蛋白純度在91.7％。
通過(guò)抗氧化試劑盒測(cè)定，Ⅱ型膠原蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率為16.56％。
由上述實(shí)施例可得通過(guò)冷凍干燥后再粉碎鯊魚(yú)骨最大限度提高膠原的提取率和維持其部分生物活性功能。Ⅱ型膠原蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到了20％左右，這數(shù)值遠(yuǎn)大于干貝肉等動(dòng)物蛋白提取物，且提取率在10％左右，同類(lèi)型提取膠原蛋白的方法相比，本方法的提取率更高，且熱變形溫度提高到了41℃,提高Ⅱ型膠原蛋白的潛在適用范圍。