本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于檢測C-KIT基因突變的引物、探針及相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)：

C-KIT是一種原癌基因，位于染色體4q11-12，全長約80kb。C-KIT編碼的C-KIT蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員，它是分子量約為145KD的跨膜蛋白，包含了胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)、跨膜區(qū)和配體結(jié)合位點(diǎn)胞外區(qū)。當(dāng)配體與其結(jié)合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通過一系列反應(yīng)激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與增殖。

胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)是消化道最常見的間葉源性腫瘤。研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突變率約為90％。

目前Sanger測序法是C-KIT基因突變檢測的主要方法。然而，該方法的靈敏度低，會導(dǎo)致漏檢及假陰性的發(fā)生，而且檢測時(shí)間長，無法滿足臨床檢測的實(shí)際需求。臨床上迫切需要開發(fā)一種高靈敏度、快速的C-KIT基因突變檢測技術(shù)。

本發(fā)明的發(fā)明人在胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)的日常檢測中發(fā)現(xiàn)了與胃腸道間質(zhì)瘤有關(guān)的位于C-KIT基因的新突變位點(diǎn)，即1670-1690位缺失突變。本發(fā)明的發(fā)明人針對該突變開發(fā)了一種快速、高靈敏、操作簡便的檢測試劑盒及相關(guān)的檢測方法，可以用于GIST化療預(yù)后。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測C-KIT基因突變的引物和探針，所述突變是1670-1690位缺失21堿基突變(1670_1690 del 21，W557_N564＞Y)。本發(fā)明的引物與探針包括如下序列：

正向引物(F)：CCCATGTATGAAGTACAGTATGG(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：GACCAAAACTCAGCCTGT(SEQ ID No：2)

探針(PB)：TCTGGGAAACTCCCATTTGTGATCA-BHQ-1(SEQ ID No：3)

本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變的檢測試劑盒，所述試劑盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探針。

根據(jù)所采用的PCR方法，本發(fā)明的試劑盒還可以包括內(nèi)參基因和內(nèi)控基因。

本發(fā)明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因突變方法，其包括以下步驟：

(1)針對C-KIT的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物和探針；

(2)提取檢測樣本中基因組DNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全血和血漿等；

(3)建立實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系；

(4)根據(jù)熒光PCR儀顯示的Ct值判斷檢測結(jié)果；檢測反應(yīng)體系的FAM熒光強(qiáng)度，以FAM達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所需要的循環(huán)次數(shù)Ct值作為陰性、陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，Ct值＞38或無擴(kuò)增為陰性，Ct值≤38為陽性。

本發(fā)明采用了特異性引物和探針技術(shù)，可以特異性檢測C-KIT基因突變。此方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快。

附圖說明

圖1為檢測陰性樣本的PCR圖。

圖2為檢測突變陽性樣本的PCR圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，或者按照制造廠商建議的條件。

一.原理

本發(fā)明的特異性引物與探針同DNA模板結(jié)合后，Taq DNA聚合酶以脫氧核苷酸(dNTP)為底物，對內(nèi)參基因(Internal Reference，IR)及 C-KIT基因突變型基因進(jìn)行體外擴(kuò)增。檢測采用熒光PCR技術(shù)，通過特異性探針?biāo)忉尫艧晒?，監(jiān)測PCR反應(yīng)的進(jìn)行，確定C-KIT基因突變情況。

本發(fā)明的試劑盒單獨(dú)設(shè)置了內(nèi)參基因檢測體系。內(nèi)參基因是區(qū)別于待檢C-KIT基因的管家基因。通過檢測內(nèi)參基因的擴(kuò)增情況(FAM通道)，可分析待檢DNA是否能被正常擴(kuò)增，從而排除DNA純度、濃度不佳，或者含有PCR抑制劑等造成PCR檢測失敗的情況。

本發(fā)明的試劑盒在C-KIT基因突變型檢測體系中同時(shí)設(shè)置了內(nèi)控基因(Internal Control，IC)檢測體系。兩種體系在同一PCR管中同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。內(nèi)控基因也是區(qū)別于待檢基因C-KIT的管家基因。將識別C-KIT基因突變模板的探針修飾為FAM熒光基團(tuán)，而將識別內(nèi)控基因模板的探針修飾為HEX熒光基團(tuán)。通過檢測內(nèi)控基因擴(kuò)增情況(HEX通道)，可分析待檢DNA是否能被正常擴(kuò)增，從而排除漏加試劑或樣本、樣本含有PCR抑制劑等造成PCR檢測失敗的情況。

進(jìn)行本試劑盒檢測結(jié)果判定時(shí)，陰性質(zhì)控品(NC)中FAM、HEX通道檢測均應(yīng)無擴(kuò)增(不呈典型的S型曲線。注：典型的S型曲線依次表現(xiàn)為指數(shù)期、直線期及平臺期)或無Ct值，陽性質(zhì)控品(PC)中FAM、HEX通道檢測均應(yīng)有擴(kuò)增(呈典型的S型曲線)且Ct值≤28；否則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)無效，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

二.實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

1.針對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針

針對C-KIT基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物和探針。通過特異性引物和探針優(yōu)化，以便實(shí)現(xiàn)高靈敏和快速檢測。

優(yōu)化后的引物與探針如下：

正向引物(F)：CCCATGTATGAAGTACAGTATGG(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：GACCAAAACTCAGCCTGT(SEQ ID No：2)

探針(PB)：FAM-TCTGGGAAACTCCCATTTGTGATCA-BHQ-1(SEQ ID No：3，含熒光標(biāo)記)

2.檢測樣本處理與DNA的提取

檢測樣本可以是新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全血、血漿和腹 腔積液。以下僅以石蠟包埋組織樣本為例進(jìn)行說明。

在樣本采集之前，病人未經(jīng)過酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)類藥物治療；由于DNA樣品質(zhì)量會影響檢測結(jié)果，因此應(yīng)確定DNA樣品來源的石蠟包埋組織樣本中含有癌組織細(xì)胞，并且不少于整個(gè)樣本的25％；且DNA樣品OD260/OD280＝1.8±0.2，OD260/OD230≥1.7；濃度為5-10ng/μl。

石蠟包埋組織樣本在室溫下保存時(shí)限不超過12個(gè)月，提取后的DNA樣品在-20℃冷凍條件下保存時(shí)限不超過6個(gè)月。

3.適用儀器

Stratagene Mx3000P。

4.試劑盒的組成

試劑盒組成見表1。試劑盒中不含核酸提取成份，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司生產(chǎn)，貨號：56404)試劑盒完成石蠟包埋組織樣本DNA提取。檢測試劑組成及C-KIT基因待檢突變位點(diǎn)見表2。IR檢測試劑只含內(nèi)參基因檢測體系(FAM通道)，C-KIT檢測試劑同時(shí)含有C-KIT基因突變檢測體系(FAM通道)及內(nèi)控基因檢測體系(HEX通道)。

表1：試劑盒組成

其中所述內(nèi)參基因和內(nèi)控基因的具體序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況容易地確定。

三.檢測方法

1.使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen公司生產(chǎn))試劑盒，按照使用說明書進(jìn)行石蠟包埋組織樣本DNA提取。

2.取試劑盒中的檢測試劑以及陽性質(zhì)控品(PC)。待檢測試劑及陽性質(zhì)控品PC融化后短暫離心，置于冰上。

3.按17∶0.3的體積比例混合IR檢測試劑和Taq DNA聚合酶，按17∶0.3的體積比例混合C-KIT檢測試劑和Taq DNA聚合酶。按17.3/孔分裝IR檢測試劑和C-KIT檢測試劑至八連管中。向裝有IR檢測試劑和C-KIT檢測試劑的八連管中分別加入2.7μl待檢DNA樣品、陰性質(zhì)控品(NC，溶解DNA的緩沖液，由使用者自備)及陽性質(zhì)控品PC，吹打混勻，蓋緊管蓋后短暫離心。注意：混勻時(shí)不要使用漩渦振蕩儀；混勻后立即進(jìn)行后續(xù)操作。

4.熒光PCR儀檢測通道設(shè)定需同時(shí)選擇FAM、HEX通道(參比染料設(shè)置為“無”)。反應(yīng)程序設(shè)置如下(表2)：

表2：

四.檢測結(jié)果的解釋

1.Ct值確定：首先設(shè)定Stratagene MX3000P熒光PCR儀的基線：選擇“適合基線(Adaptive baseline)”設(shè)定時(shí)的熒光信號，閾值(threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性質(zhì)控品NC擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點(diǎn)，即令陰性質(zhì)控品NC擴(kuò)增曲線顯示“No Ct”為準(zhǔn)。從軟件中讀取各樣本在各位點(diǎn)檢測的Ct值。

2.定性分析：

(1)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量評判：若NC中FAM、HEX通道檢測均無擴(kuò)增(不呈 典型的S型曲線。注：典型的S型曲線依次表現(xiàn)為指數(shù)期、直線期及平臺期)或無Ct值，PC中FAM、HEX通道檢測均有擴(kuò)增(呈典型的S型曲線)且Ct值≤28，則可繼續(xù)分析；否則認(rèn)為實(shí)驗(yàn)無效，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(2)待檢DNA樣品中內(nèi)參基因(IR)檢測情況評判：若內(nèi)參基因檢測(FAM通道)有擴(kuò)增且19≤Ct值≤25，則可繼續(xù)分析；若其Ct值較小，則認(rèn)為DNA樣品濃度過高；若其Ct值較大或無擴(kuò)增，則認(rèn)為DNA樣品濃度過低、發(fā)生降解，或其中可能含有PCR抑制劑。

(3)待檢DNA樣品中內(nèi)控基因檢測情況評判：若內(nèi)控基因檢測(HEX通道)有擴(kuò)增且Ct值≤25，則可繼續(xù)分析；若內(nèi)控基因檢測(HEX通道)Ct值較大或無擴(kuò)增，但突變位點(diǎn)檢測(FAM通道)有擴(kuò)增且Ct值≤38，則可繼續(xù)分析(可能由于突變位點(diǎn)擴(kuò)增對內(nèi)控基因擴(kuò)增產(chǎn)生抑制)；若內(nèi)控基因檢測(HEX通道)Ct值較大或無擴(kuò)增，而突變位點(diǎn)檢測(FAM通道)無擴(kuò)增或有擴(kuò)增但Ct值＞38，則無法繼續(xù)分析，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)(可能由于DNA樣品發(fā)生降解、其中含有PCR抑制劑或未加樣品)。

(4)待檢DNA樣品中基因突變情況評判：若樣品中某突變位點(diǎn)檢測(FAM通道)有擴(kuò)增且Ct值≤38，則判定該樣本突變結(jié)果為陽性；若Ct值＞38或無擴(kuò)增，則判定該樣本突變結(jié)果為陰性。

注意：同一DNA樣品中可能同時(shí)存在多種突變。

圖1為檢測結(jié)果為陰性的樣本的PCR圖，圖2為檢測結(jié)果為陽性的樣本的PCR圖。

通過對比檢測，證實(shí)本發(fā)明的熒光PCR方法和傳統(tǒng)測序方法的結(jié)果是相符的，而本發(fā)明的熒光PCR方法的靈敏度和選擇性高于傳統(tǒng)測序方法。

因此，本發(fā)明熒光PCR反應(yīng)體系可檢測C-KIT基因1670-1690位缺失21堿基突變，檢測方便快捷，準(zhǔn)確性高，可滿足C-KIT基因突變快速檢測的要求。