本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種納米微粒多色多重檢測試紙的制備方法。

背景技術(shù)：

核酸檢測技術(shù)可以用來檢測病原體核酸，包括DNA和RNA。比起常規(guī)的血清學檢測，核酸檢測是直接檢測病原體的脫氧核糖核酸或核糖核酸，具有特異性強、靈敏度高等特點，可以大幅提高病原體檢出率、縮短檢測窗口期，極大提高了監(jiān)測效率。

現(xiàn)在的核酸檢測技術(shù)大多是基于PCR原理，如常見的包括熒光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)技術(shù)，依賴核酸序列的擴增技術(shù)(NucleicAcidSequence-basedAmplification，NASBA)，滾環(huán)擴增技術(shù)(RollingCircleAmplification，RCA)，環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)，轉(zhuǎn)錄介導的擴增技術(shù)(TranscriptionMediatedAmplifi-cation，TMA)等。無論是熒光定量PCR還是其它PCR擴增技術(shù)，在檢測核酸時都要借助高端、昂貴的儀器設備，操作復雜，監(jiān)測條件要求高，而且很難實現(xiàn)病原體的多重檢測。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)一種操作簡單、快速、價格低廉，可實現(xiàn)多重核酸檢測的技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種納米微粒多色多重檢測試紙及其制備方法。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于核酸檢測的納米微粒檢測試紙的制備方法，包括步驟：

(1)提供指示探針

所述指示探針被設置用于與目標核酸序列的第一互補結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合，所述指示探針的5’端結(jié)合有顯色納米微球結(jié)合，所述指示探針的3’端結(jié)合有生物素；

(2)提供捕獲探針

所述捕獲探針被設置用于與目標核酸序列的第二互補結(jié)合區(qū)特異性結(jié)合，并且所述第一互補結(jié)合區(qū)和所述第二互補結(jié)合區(qū)至少間隔3個核苷酸；

(3)試紙條的制備

所述試紙條包括依次排布的上樣區(qū)、檢測區(qū)、和吸水區(qū)；所述檢測區(qū)靠近所述上樣區(qū)一側(cè)包括檢測線，所述檢測線固定有所述捕獲探針，所述檢測區(qū)靠近所述吸水區(qū)一側(cè)包括質(zhì)控線，所述質(zhì)控線固定有鏈霉親和素。

優(yōu)選地，所述目標核酸序列數(shù)目≥2個；所述指示探針分別對應于各目標核酸序列，并且各指示探針5’端結(jié)合有不同顏色的顯色納米微球；所述捕獲探針分別對應于各目標核酸序列，并且各捕獲探針一次分別固定于所述檢測區(qū)的不同位置。

優(yōu)選地，所述目標核酸序列數(shù)目≥3個，更優(yōu)選地所述目標核酸序列數(shù)目≥5個。

優(yōu)選地，所述指示探針包括10～50個核苷酸。

優(yōu)選地，所述捕獲探針包括10～50個核苷酸。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，將所述捕獲探針固定于硝酸纖維素膜上靠近所述上樣區(qū)一側(cè)形成所述檢測線，將鏈霉親和素固定于硝酸纖維素膜上靠近所述吸水區(qū)一側(cè)形成所述質(zhì)控線。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，先使用CaCl₂溶液在硝酸纖維素膜上劃線，兩條線之間的距離≥1.5mm，干燥后78℃～82℃烘烤15min～20min；將捕獲探針和鏈霉親和素溶于水后劃于CaCl₂溶液劃線上，干燥后60℃～65℃烘烤1h～2h。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，CaCl₂溶液質(zhì)量分數(shù)為5％～15％。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，CaCl₂溶液劃線寬度為1mm。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，CaCl₂溶液質(zhì)量分數(shù)為10％。

應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明的納米微粒多色多重檢測試紙的結(jié)構(gòu)。

圖2顯示了本發(fā)明的納米微粒多色多重檢測試紙的檢測原理。

具體實施方式

本發(fā)明將可以捕獲目標基因(DNA、RNA)的單鏈DNA序列(捕獲探針)固定在硝酸纖維素膜的特定位置上，質(zhì)量控制區(qū)域固定鏈霉親和素。另外，可以和該目標基因的其他位點序列互補的單鏈DNA被用作DNA探針，該單鏈DNA探針的兩段分別與生物素和特定顏色的納米微球相偶聯(lián)成為指示探針。當目標基因、指示探針同時存在并和硝酸纖維素膜上的捕獲探針相互作用，攜帶顏色的納米微球被富集到捕獲探針的位置，從而觀察到特定位置顏色的變化。而當目標基因不存在時捕獲探針所在的特定位置顏色不發(fā)生變化。

在一張硝酸纖維素膜上的不同位置同時放置不同的捕獲探針，而與之對應的指示探針攜帶不同顏色的納米微球，這些指示探針在同一個體系中和目標基因結(jié)合，然后同時與已經(jīng)固定有捕獲探針的硝酸纖維素膜作用，捕獲探針顯色處則該目標基因為陽性，質(zhì)控區(qū)域由于捕獲了未結(jié)合指示探針而呈現(xiàn)特定的顏色(根據(jù)探針數(shù)量和攜帶顏色而不同，如黑色)。

適用范圍與優(yōu)勢：

PCR擴增產(chǎn)物分析，可替代PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，具有操作簡單、檢測時間短、結(jié)果直觀、可同時分析多個大小相近產(chǎn)物，結(jié)果保存時間長等優(yōu)點；進行核酸雜交分析，較普通雜交分析具有分辨率更高、結(jié)果更直觀等優(yōu)勢；用于核酸信號放大系統(tǒng)，高分辨率分析核算信號，避免出現(xiàn)分析誤差，具有檢測周期短、技術(shù)要求低、誤差小等優(yōu)勢。

根據(jù)本發(fā)明的納米微粒多色多重檢測試紙根據(jù)以下原理設計：

1.探針設計

捕獲探針：可與目標核酸序列的特定區(qū)域特異性互補結(jié)合。

指示探針：5‘端與多色的納米微粒結(jié)合，3’端與生物素結(jié)合，序列與目標核酸序列特定區(qū)域特異性互補結(jié)合(區(qū)別于捕獲探針區(qū)域)。

2.顯色膜設計

條形：從左到右依次為“上樣區(qū)”、“試紙區(qū)”、“吸水區(qū)”。試紙區(qū)從左到右依次用特異的捕獲探針劃線，干燥后熱烤的方式固定，最右端用鏈霉親和素劃線作為質(zhì)控線。

3.指示探針捕獲目標基因

單鏈目標基因直接室溫反應20分鐘。

雙鏈目標基因90℃反應5分鐘，迅速降溫至室溫。

4.顯色試紙反應

條形：指示探針捕獲后的反應體系加到上樣區(qū)，1-10分鐘后觀察各條檢測線和質(zhì)控線的顯色情況。

5.結(jié)果分析

質(zhì)控線(顏色根據(jù)多色微球的數(shù)量確定)反應作為反應可信的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上檢測線或檢測點顯示正確的顏色的為陽性，不顯色或顯色與設計顏色不同為陰性或錯誤檢測。

上述探針均可用人工合成的方法進行制備，可以采用本領(lǐng)域的已知技術(shù)將指示探針與顯色納米微粒(微球)的結(jié)合，以及和生物素進行結(jié)合。探針的合成以及探針與標記物的結(jié)合，一般委托商業(yè)化的生物科技公司完成。

下面結(jié)合具體實施例，進一步陳述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如美國Sambrook.J等著《分子克隆實驗室指南》(黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。

實施例1試紙條分析目標基因

(一)人工合成以下目標基因片段

A、5’ATCTAGGTACTCTAGGACTAATAGCCAACCGCTACT 3’(SEQ ID NO.1)

B、5’CCTAAGTCATGGCTTGAATCTGAGTCCTGAATCT 3’(SEQ ID NO.2)

C、5’AGAGTTCGAATCGTACAAGTTACTACGTATATCGT 3’(SEQ ID NO.3)

D、5’TGAACGTCCAGTGCAGTACTGCCTCGAGTCGACTT 3’(SEQ ID NO.4)

E、5’TCGACTGCTAGTCAGACACAGGATCAATCCAATGCA 3’(SEQ ID NO.5)

以上全為人工序列，為單鏈DNA序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將這些序列溶解后進行不同組合的混合，將混合的不同組合做好標記。

(二)指示探針

人工合成如下指示探針a、b、c、d、e，分別與步驟(一)中的目標基因片段A、B、C、D、E的5’端下劃線部分互補配對：

a、5’CTAGAGTACCTAGAT 3’(SEQ ID NO.6)(綠色微球)

b、5’AAGCCATGACTTAGG 3’(SEQ ID NO.7)(紅色微球)

c、5’TACGATTCGAACTCT3’(SEQ ID NO.8)(藍色微球)

d、5’TGCACTGGACGTTCA 3’(SEQ ID NO.9)(紫色微球)

e、5’CTGACTAGCAGTCGA 3’(SEQ ID NO.10)(黃色微球)

以上人工序列5’端以氨基、羧基的方式連接不同顏色的顯色納米微球，3’端以生物素標記，人工序列的合成和標記由上海捷瑞生物工程有限公司完成。將5個彩色微球標記的序列混合，記作“指示探針混合液”。

(三)捕獲探針

人工合成如下指示探針a’、b’、c’、d’、e’，分別與步驟(一)中的目標基因片段A、B、C、D、E的3’端下劃線部分互補配對：

a’、5’AGTAGCGGTTGGCTATTA 3’(SEQ ID NO.11)

b’、5’AGATTCAGGACTCAG 3’(SEQ ID NO.12)

c’、5’ACGATATACGTAGTA 3’(SEQ ID NO.13)

d’、5’AAGTCGACTCGAGGC 3’(SEQ ID NO.14)

e’、5’TGCATTGGATTGATC 3’(SEQ ID NO.15)

以上序列全為人工序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

(四)試紙條制備：

將CaCl₂溶于水中(質(zhì)量分數(shù)為10％)，然后使用CaCl₂溶液在硝酸纖維素膜上劃線，劃線寬度1mm，兩條線的間隔距離為2mm，劃線位置即為后續(xù)捕獲探針的固定位置，干燥后80℃烘烤20min；將上述制備的捕獲探針a’、b’、c’、d’、e’和鏈霉親和素溶于水(50μg/ml)后，劃于CaCl₂溶液劃線上(劃線寬度1mm，兩條線的間隔距離為2mm)，干燥后60℃烘烤2小時。在硝酸纖維素膜左側(cè)設置上樣區(qū)，右側(cè)與吸水紙相連。

本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，短的核苷酸序列(低于100bp)很難牢固的固定于硝酸纖維素膜上，捕獲探針固定不良會導致后續(xù)檢測過程中，條帶彌散，甚至無法顯示條帶，近而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。經(jīng)過反復試驗，申請人發(fā)現(xiàn)，先用CaCl₂溶液在硝酸纖維素膜上劃線，烘烤后在相同位置使用捕獲探針進行劃線，能夠非常牢固的將較短的核苷酸序列固定于硝酸纖維素膜。經(jīng)過優(yōu)化，確定了最優(yōu)的CaCl₂溶液濃度(質(zhì)量分數(shù))為5％～15％，CaCl₂溶液劃線后烘烤條件為78℃～82℃烘烤15min～20min。

(五)目標基因檢測：

1、序列標記：向目標基因的混合物100μl中加入指示探針混合液100μl，充分混合，室溫反應20分鐘。

2、上樣：將試紙條平放，反應液加到左側(cè)的上樣區(qū)，等待液體逐漸往右側(cè)吸水紙移動。

結(jié)果判定：反應完畢，以最右側(cè)黑色條帶為系統(tǒng)質(zhì)控標志，若最右側(cè)條帶為黑色則進行分析其他條帶。其他條帶區(qū)域顏色與設計顏色一致或無色則可進一步分析。顏色顯色與設計條帶顏色一致的顯色條帶，表示樣本目標條帶陽性。條帶無顏色，表示樣本目標條帶陰性，如圖2所示。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。