專利名稱：：球蟲重組卡介苗及制備方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明提供了一種球蟲重組卡介苗，包括穿梭表達載體球蟲重組卡介苗和整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗，同時還公開了其制備方法，屬于基因工程
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：雞球蟲病是由艾美爾屬的一種單細胞寄生性原蟲引起的嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，遍及世界各地。長期以來本病防治主要依賴于藥物，但由于雞球蟲的抗藥性日趨嚴重，加之普遍存在的藥物殘留、研制開發(fā)新藥成本高、周期長，免疫效果差，免疫程序復雜等問題，使人們將目光轉(zhuǎn)向了分子疫苗。加強免疫效果以及對免疫增強劑的研究已成為當前球蟲疫苗研究的熱點。人們曾嘗試過將球蟲的抗原基因在不同的表達環(huán)境迸行表達，但目前仍沒有一種抗原基因能夠提供完全的免疫保護，而且受表達系統(tǒng)的限制，以大腸桿菌為原核表達系統(tǒng)的重組蛋白抗原性較差。因此，有必要采用基因工程方法發(fā)展一種高效，廉價的新型雞球蟲疫苗。卡介苗是目前世界上應用最廣泛、最安全的疫苗。它本身是一種很好的非特異免疫增強劑，能增加機體免疫功能，單次接種即能誘導機體產(chǎn)生完全持久的細胞免疫和體液免疫，并且易于生產(chǎn)，價格低廉，適宜于廣大農(nóng)村。這些優(yōu)勢使卡介苗成為表達重組外源基因的一種非常理想的活菌疫苗載體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種球蟲重組卡介苗，包括兩種抗柔嫩艾美耳球蟲的新型疫苗，即穿梭表達載體球蟲重組卡介苗和整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下首先獲得柔嫩艾美耳球蟲保護性抗原基因，進行TA克隆，測序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進行酶切反應的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261和整合表達載體PMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG，經(jīng)抗性和PCR篩選得到陽性柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗，包括穿梭表達載體球蟲重組卡介苗和整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗。本發(fā)明所提供的兩種重組卡介苗疫苗菌株，將其命名為rBCGPMV26卜RH0和rBCGPMV361-RHO.本發(fā)明以球蟲保護性抗原Rhomboid基因為例，進行穿梭表達載體和整合表達載體的構(gòu)建。1、穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備從構(gòu)建的柔嫩艾美耳球蟲雜交蟲株F2cDNA表達文庫中篩選出l個Rhomboid蛋白家族相關基因，根據(jù)己克隆的柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid新基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，TA克隆。測序鑒定正確后進行雙酶切，切膠回收，與進行同樣酶切的pMV261穿梭表達載體進行連接，轉(zhuǎn)入DH5a中，將重組質(zhì)粒Rho-261電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37。C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，篩選BCG重組子，PCR證實為陽性克隆后進行45。C熱誘導表達，對基因表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。將制備好的穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RH0以100ug/只的劑量通過滴鼻點眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，并同時設BCG組和紅、白對照組，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊進行攻蟲試驗，對保護率、相對增重率、0PG、ACI、體液免疫水平和細胞免疫水平檢測等指標進行綜合評價。穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO可對抗中等劑量球蟲的攻擊,試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著增加，盲腸病變較小,保護率達到78.8%以上。各項指標均明顯優(yōu)于對照組(結(jié)果見表l)。其中陰性對照組ACI值為90.6，而rBCGPMV261-RHO免疫組ACI值分別為208.1、181.4、167.2，說明使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數(shù)，而滴鼻點眼和口服組ACI值均達到180以上，以這兩種途徑免疫抗球蟲效果非常有效。BCG免疫的三組其ACI值在154.6171.0之間，效果也明顯高于對照組，提示我們單獨使用BCG對增強雞球蟲免疫保護力也有一定的效果，其中以口服方式免疫效果更好。穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗免疫雛雞后能誘導有效的細胞免疫和體液免疫，表現(xiàn)為CD4+、CD8+T細胞數(shù)量和特異性抗體滴虔明顯高于對照組(P〈0.01)。2、整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid新基因序列的開放閱讀框設計引物設計引物并引入酶切位點，進行PCR，TA克隆，測序鑒定正確后進行雙酶切，切膠回收，與進行同樣酶切的pMV361整合表達載體進行連接，轉(zhuǎn)入DH5a中，將重組質(zhì)粒Rho-361電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37t:培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，篩選BCG重組子，PCR證實為陽性克隆后進行45'C熱誘導表達，對基因表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。將重組卡介苗rBCGPMV361-RH0以100ug/只的劑量通過滴鼻點眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，同時進行陰性對照實驗，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊進行攻蟲試驗，對保護率、相對增重率、OPG、ACI、體液免疫水平和細胞免疫水平檢測等指標進行綜合評價。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數(shù)，其中rBCGPMV36卜RH0滴鼻點眼和口服免疫組ACI值達到188.2和187.8，具有很好的抗球蟲效果。整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGPMV361-RHO可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著增加，盲腸病變較小，三種免疫途徑保護率分別為80%、70.6%、63.5%(結(jié)果見表2)。以滴鼻點眼免疫方式效果更為明顯。用整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗免疫雛雞后能誘導有效的細胞免疫和體液免疫，CD4+、CD8+T細胞數(shù)量和特異性抗體滴度均較之陰性對熙組有不同程度的提高(P〈0.05)。將本發(fā)明提供的兩種球蟲重組卡介苗通過滴鼻點眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞后，口服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊進行攻蟲試驗，通過保護率、相對增重率、OPG、ACI、體液免疫水平和細胞免疫水平檢測等指標進行綜合評價。結(jié)果顯示，球蟲重組卡介苗rBCGPMV261-RHO和rBCGPMV361-RHO組均具有明顯的免疫促進作用，各指標均強于陰性對照組，能夠有效地抵抗柔嫩艾美耳球蟲卵囊的攻擊，ACI值到達180以上，具有很好的抗球蟲效果。本發(fā)明的積極效果在于卡介苗活載體疫苗本身具有較強的細胞免疫和體液免疫佐劑作用，而且又能高效表達球蟲蛋白，使表達的蛋白發(fā)揮很好的免疫保護作用，兩者優(yōu)勢組合，達到更好的預防雞球蟲病的目的。并且這一新型疫苗熱穩(wěn)定性好，運輸和保存較為容易，易于生產(chǎn)，產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護試驗.免去了蛋白質(zhì)后處理的復雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農(nóng)村。本發(fā)明所用到的Rhomboid基因是我實驗室獲得的一個柔嫩艾美耳球蟲的新基因。Rhomboid蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的參與表皮生長因子及表皮生長因子受體信號轉(zhuǎn)導過程的調(diào)節(jié)器，而且已發(fā)現(xiàn)Rhomboid與頂器門原蟲的黏附和侵入宿主細胞有關，說明Rhomboid基因作為疫苗候選基因的價值。這樣的活載體疫苗既能發(fā)揮卡介苗本身較強的細胞免疫佐劑作用，又能使表達的蛋白發(fā)揮免疫保護作用，達到更好的預防雞球蟲病的目的。因此這兩種疫苗的研制具有非常廣闊的前景和應用價值。圖l為PMV261-Rho載體構(gòu)建示意圖。圖2為PMV361-Rho載體構(gòu)建示意圖。具體實施方式本發(fā)明以球蟲保護性抗原Rhomboid基因為例，進行穿梭表達載體和整合表達載體的構(gòu)建，并不以任何形式限制本發(fā)明。本發(fā)明球蟲重組卡介苗疫苗的制備實施例l穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟.參照Rhomboid基因DNA序列及穿梭載體pMV261物理圖譜設計兩對引物并引入酶切位點。上游引物QF1:5、-CTGACTGCAGATGTCGGACATCGAATCCCAGAG-3、；其中5、端含有Pstl位點；下游引物QR:5、-GACTATCGATTTATGCGCATCCCATGGGCAAAGG-3';5、端含有Clal位點。將PCR純化產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體并進行PCR、酶切及測序鑒定，凝膠回收片段與同樣進行酶切的穿梭表達載體pMV261連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化AcoWDH5a感受態(tài)細胞后篩選重組質(zhì)粒，用PstI、ClaI進行雙酶切反應，重組質(zhì)粒命名為PMV261-Rho(如圖l所示)。將BCG接種于MB7H9ADC液體培養(yǎng)基中，37t:培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，沉淀用10%甘油洗滌，最后重懸lml10%甘油中，用于電轉(zhuǎn)化。取60-80ulBCG感受態(tài)菌液加入O.lug重組質(zhì)粒PMV261-Rho置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓2.5KV，電容25uF，電阻1000Q。電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入MB7H9ADC培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)2d后涂布于含20ug/mlKanMB7H9ADC培養(yǎng)基平板，約3w后長出轉(zhuǎn)化菌落。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基(含Kan)，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PCR證實陽性克隆后，45'C水浴中誘導4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液，10(TC5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Westernblotting鑒定。實施例2整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備步驟參照Rhomboid基因DNA序列及穿梭載體pMV361物理圖譜設計兩對引物并引入酶切位點。上游引物QF2:CTGACAGCTGATGTCGGACATCGMTCCCAGAG;其中5、端含有PvuII位點；下游引物QR:5、-GACTATCGATTTATGCGCATCCCATGGGCAAAGG-3';5'端含有Clal位點。將PCR純化產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體并迸行PCR、酶切及測序鑒定，凝膠回收片斷與整合表達載體pMV361連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡h'DH5a感受態(tài)細胞后篩選重組質(zhì)粒，用和PvuII、ClaI進行雙酶切反應，重組質(zhì)粒命名為PMV361-Rho(如圖2所示)。取60-80ul感受態(tài)BCG菌液加入O.lug重組質(zhì)粒PMV361-Rho置于電轉(zhuǎn)杯中。電穿參數(shù)電壓2.5KV，電容25uF，電阻1000Q。電穿孔轉(zhuǎn)化后立即加入MB7H9ADC培養(yǎng)基中，37r培養(yǎng)2d后涂布于MB7H9ADC培養(yǎng)基平板。從培養(yǎng)基平板上挑取BCG重組子，接種于液體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PCR證實陽性克隆后45"水浴中誘導4h，離心收集菌體，并處理，最后加入等體積2XSDS-PAGE上樣緩沖液，100。C5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析及Westernblotting鑒定。試驗例l穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的用途實驗動物采用剛出殼的海蘭小公雛，雛雞6日齡時，隨機分為8組，每組20只。7日齡時將穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RH0以100ug/只的劑量通過滴鼻點眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，并同時設BCG滴鼻點眼免疫組、BCG口服免疫組，BCG頸部皮下注射免疫組和紅白對照組。紅白對照組接種PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。分三次免疫，每次間隔一周，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊lX104個/只進行攻蟲試驗，進行以下各項指標判定，包括保護率、相對增重率、0PG、ACI等，免疫后采血，流式細胞儀對CD4+、CD8+進行細胞水平免疫檢測，分離血清ELISA方法對體液免疫水平進行檢測。攻蟲前每組雞隨機取10只逐只分別稱重并標號記錄，攻蟲后每隔一天對對應的雞逐只稱重，觀察攻蟲后雞的體重變化情況，以及最后的增重情況，計算相對增重；攻蟲后每天檢査糞便，并從第五天開始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取lg，加入10tnL自來水制成10倍稀釋液，取一滴置于血細胞計數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)球蟲卵囊總數(shù)；于攻蟲后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按Johnson設計的病變記分法記分。計算ACI二相對增重率+存活率-病變值-卵囊記分。結(jié)果顯示各項指標均明顯優(yōu)于不免疫攻蟲對照組。說明我們所采用的免疫程序是安全有效的，陰性對照組的ACI僅為90.6，而單獨使用BCG能不同的提高抗球蟲指數(shù)，其中BCG口服組ACI達到了171.0，發(fā)揮了BCG作為免疫增強劑的效果，效果尤為突出的是本發(fā)明所提供的穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO，免疫方式采用滴鼻點眼和口服，抗球蟲指數(shù)ACI值均達到180以上，說明抗球蟲效果非常有效。穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGPMV261-RHO可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著增加，盲腸病變較小，保護率達到78.8%以上(結(jié)果見表l)。將發(fā)明的新型疫苗rBCGPMV261-RHO免疫雛雞后，于第三次免疫后l周，每組隨機各取10只雞放血處死，取脾臟，力B2mLPBS，在200目篩上研磨，用PBS稀釋成細胞懸液(10MVmL)。取100uL細胞懸液，加？1^標記的抗004+和？￡標記的抗008+兔抗雞單克隆抗體，避光作用40min，然后用PBS洗液洗2遍，加入O.5mL熒光保存液，用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明免疫組及8〔6組004+、CD8+變量明顯高于陰性對照組，而^〔0匿261-朋0滴鼻組雞的004+、CD8+T淋巴細胞數(shù)均升高，與其他個組相比差異均極顯著(P〈0.01)。每次免疫前心臟采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲F2株子孢子蛋白作為包被抗原，通過間接ELISA方法對雞血清中IgG變化情況進行檢測。結(jié)果一免后各實驗組與對照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。二免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實驗組均顯示一定的抗體效價，其中，rBCGPMV261-RHO滴鼻組和rBCGPMV261-RHO口服組血清抗體吸光度最高，于其它組相比差異極顯著(P〈0.01)。試驗例2整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的用途實驗動物采用剛出殼的海蘭小公雛，雛雞6日齡時，隨機分為8組，每組20只。7日齡時將整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGP匿361-RH0以100ug/只的劑量通過滴鼻點眼、口服、頸部皮下注射三種不同免疫途徑免疫雛雞，并同時設BCG滴鼻點眼免疫組、BCG口服免疫組，BCG頸部皮下注射免疫組和紅白對照組。紅白對照組接種PBS，紅對照組最后攻蟲，白對照組不攻蟲。分三次免疫，每次間隔一周，三免一周后口服接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊1X10MV只進行攻蟲試驗，進行以下各項指標判定，包括保護率、相對增重率、OPG、ACI等，免疫后采血，流式細胞儀對CD4+、CD8+進行細胞水平免疫檢測，分離血清ELISA方法對體液免疫水平進行檢測。攻蟲前每組雞隨機取10只逐只分別稱重并標號記錄，攻蟲后每隔一天對對應的雞逐只稱重，觀察攻蟲后雞的體重變化情況，以及最后的增重情況，計算相對增重；攻蟲后每天檢查糞便，并從第五天開始分別收集各組糞便，混勻后，每組各取lg，加入10mL自來水制成10倍稀釋液，取一滴置于血細胞計數(shù)板中，在低倍鏡下記數(shù)球蟲卵囊總數(shù)；于攻蟲后第七天，每組取5只雞剖殺，觀察盲腸病變，按Johnson設計的病變記分法記分。計算AO相對增重率+存活率-病變值-卵囊記分。使用重組卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球蟲指數(shù)，其中rBCGPMV361-RH0滴鼻點眼和口服免疫組ACI值達到188.2和187.8，具有很好的抗球蟲效果。整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗rBCGPMV361-RHO可對抗中等劑量球蟲的攻擊，試驗組和對照組相比，攻蟲后卵囊排出量顯著減少，體重增長顯著增加，盲腸病變較小，三種免疫途徑保護率分別為80%、70.6%、63.5%(結(jié)果見表2)。以滴鼻點眼免疫方式效果更為明顯。將發(fā)明的新型疫苗rBCGPMV36卜RH0免疫雛雞后，于第三次免疫后l周，每組隨機各取10只雞放血處死，取脾臟，用PBS稀釋成細胞懸液，取100uL細胞懸液，加？11^標記的抗004+和？￡標記的抗008+兔抗雞單克隆抗體，用流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞的數(shù)量，并用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明免疫組及8〔0組[04+、CD8+變量明顯高于陰性對照組。每次免疫前心臟采血，分離血清，用柔嫩艾美耳球蟲F2株子孢子蛋白作為包被抗原，通過間接ELISA方法對雞血清中IgG變化情況進行檢測。結(jié)果一免后各實驗組與對照組相比IgG滴度變化不大，差異不顯著。二免后IgG滴度逐漸上升，第三次免疫后，各實驗組均顯示一定的抗體效價。表l穿梭載體重組卡介苗rBCGPMV261-RHO對E.tenella攻擊的保護效果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2整合載體重組卡介苗rBCGPMV361-RHO對E.tenella攻擊的保護效果OPG值Xl(f個增重(g)盲腸病變記分ACI分組平均值保護率平均值相對增重平均值相對病變ACI<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1、一種球蟲重組卡介苗，其特征在于首先獲得球蟲保護性抗原基因，進行TA克隆，測序鑒定正確后酶切回收目的片段，再分別與同樣進行酶切反應的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261或整合表達載體PMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG，經(jīng)抗性和PCR篩選得到陽性球蟲重組卡介苗。2、一種穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗，是通過以下步驟制備的從構(gòu)建球蟲雜交蟲株F2cDNA表達文庫中篩選出1個Rhomboid蛋白家族相關基因，根據(jù)已克隆的柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid新基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，TA克?。粶y序鑒定正確后進行雙酶切，切膠回收，與進行同樣酶切的pMV261穿梭表達載體進行連接，轉(zhuǎn)入DH5ct中，將重組質(zhì)粒Rho-261電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37'C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，篩選BCG重組子，PCR證實為陽性克隆后進行45'C熱誘導表達，對基因表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。3、一種整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗，是通過以下步驟制備的根據(jù)己克隆的球蟲Rhomboid新基因序列的開放閱讀框設計引物設計引物并引入酶切位點，進行PCR，TA克隆，測序鑒定正確后進行雙酶切，切膠回收，與進行同樣酶切的pMV361整合表達載體進行連接，轉(zhuǎn)入DH5a中，將重組質(zhì)粒Rho-361電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37。C培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，篩選BCG重組子，PCR證實為陽性克隆后進行45"熱誘導表達，對基因表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析及Westernblotting鑒定。全文摘要本發(fā)明提供一種球蟲重組卡介苗，包括穿梭表達載體球蟲重組卡介苗和整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗?？ń槊缁钶d體疫苗本身具有較強的細胞免疫和體液免疫佐劑作用，能高效表達球蟲蛋白，使表達的蛋白發(fā)揮很好的免疫保護作用，兩者優(yōu)勢組合，達到更好的預防雞球蟲病的目的。疫苗具有非常好的抗球蟲效果，熱穩(wěn)定性好，運輸和保存較為容易；免疫力持久，單次接種可持續(xù)誘導長期對“靶抗原”的免疫反應，可減少接種次數(shù)，簡化免疫程序，增強對球蟲病的免疫效果；基因操作和生產(chǎn)過程較為簡單，安全性高，球蟲抗原可在BCG細胞壁上持續(xù)穩(wěn)定表達；產(chǎn)品不需純化，可直接用于免疫保護試驗，免去了蛋白質(zhì)后處理的復雜工序，大大降低了成本，便于推廣。文檔編號A61K39/002GK101234196SQ200710056370公開日2008年8月6日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者宮鵬濤,張西臣,李建華,舉楊,王秋悅申請人:吉林大學