專利名稱：紫堇塊莖堿在制備抗柔嫩艾美耳球蟲藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)，具體涉及一種雜環(huán)化合物。

背景技術(shù)：
紫堇塊莖堿[(+)-紫堇塊莖堿]是一種從植物中提取的天然生物堿，微量存在于罌粟科等植物中。該化合物的分子式是C19H21NO4，分子量327.374，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(1)所示。

紫堇塊莖堿作為一種植物的天然提取物，已經(jīng)從罌粟殼、大花地不容等多種藥用植物中提取得到，但尚未見有將其作為藥用的報道。有文獻(xiàn)報道紫堇塊莖堿能夠抑制幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)II型脂肪酸合成途徑中的丙二酰單酰輔酶A∶ACP轉(zhuǎn)?；傅幕钚?，其IC50值為33.1±3.291M，作者進(jìn)一步的研究證實紫堇塊莖堿是通過非競爭抑制的方式抑制了幽門螺旋桿菌中丙二酰單酰輔酶A∶ACP轉(zhuǎn)?；傅幕钚?Liu等2006年)。但是幽門螺旋桿菌是原核生物，而艾美耳球蟲是原生生物(雖然原生生物是真核生物中最低等的生物，但也和原核生物有本質(zhì)上的區(qū)別)，且目前對于艾美耳球蟲中的丙二酰單酰輔酶A∶ACP轉(zhuǎn)酰基酶的結(jié)構(gòu)等信息無任何報道，因此，紫堇塊莖堿是否能起到抗艾美耳球蟲的作用以及效果如何均屬未知。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供紫堇塊莖堿[(+)-紫堇塊莖堿]的新用途。
本發(fā)明提供的紫堇塊莖堿的新用途是用于制備抗柔嫩艾美耳球蟲的藥物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，紫堇塊莖堿能有效地抑制氨基酸序列如SEQ NO.1所示的丙二酰單酰輔酶A∶ACP轉(zhuǎn)?；傅幕钚?。該酶為柔嫩艾美耳球蟲II型脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，紫堇塊莖堿通過抑制該酶的活性導(dǎo)致柔嫩艾美耳球蟲脂肪酸代謝的紊亂，引起球蟲死亡，但對其宿主的脂肪酸代謝沒有影響，從而達(dá)到抑制柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞目的。本發(fā)明人同時也通過體外抗球蟲實驗證明了紫堇塊莖堿確實能抑制柔嫩艾美耳球蟲入侵雞球蟲細(xì)胞。
體現(xiàn)本發(fā)明上述用途的藥物由紫堇塊莖堿和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，可以制成散劑或可溶性粉劑；其中，散劑的用法是將所述散劑拌入飼料，使每100公斤飼料中混有2克所述紫堇塊莖堿，然后按日常飼料量喂食；可溶性粉劑的用法是將所述的粉劑溶于飲用水中，使紫堇塊莖堿的濃度為1g/100Kg水，然后按日常飲水量飲水。
為了更好地理解本發(fā)明，下面將通過相關(guān)實驗證明紫堇塊莖堿的抗柔嫩艾美耳球蟲作用。
一、紫堇塊莖堿的體外抗雞球蟲實驗 1、雞球蟲細(xì)胞培養(yǎng) 采用常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備雞腎原代細(xì)胞，參見1970年Do ran報道的方法。
試驗球蟲為柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella，廣東株)，子孢子制備方法參照1994年Xie報道的方法。
將Corytuberine溶于0.1％的二甲基亞砜(DMSO)配制成1000ug/mL的母液。
取細(xì)胞培養(yǎng)液，分裝為4瓶，先分別加入制備好10000個的柔嫩艾美耳球蟲子孢子，然后加入Corytuberine母液使Corytuberine的最終濃度為1、10、20、50和100ug/mL，混勻后分別加入到已培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)板面積>70％的貼壁雞腎細(xì)胞上。
同時，在制備的細(xì)胞培養(yǎng)板上，只加入數(shù)量梯度為100個、1000個、10000個和100000個的子孢子，為藥物評價時制備標(biāo)準(zhǔn)曲線所用。
培養(yǎng)8小時后，用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液洗去沒有入侵的子孢子和加入的Corytuberine，繼續(xù)培養(yǎng)16小時。
上述各樣品均進(jìn)行3次重復(fù)試驗。
上述方法中所述的細(xì)胞培養(yǎng)液由以下方法制備得到每毫升完全培養(yǎng)基RPMI-1640中加青霉100IU、鏈霉素100μg和10％滅活胎牛血清，然后調(diào)pH值為7.4。
2、藥物作用效果的檢測 (1)將上述培養(yǎng)物分別用0.05％ ED TA和0.25％胰酶洗脫，離心收集洗脫的腎細(xì)胞和入侵的子孢子，用高通量的RNA抽提試劑盒同時提取各樣品的總RNA。
立即用Real-time專用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的不同樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得各樣品的cDNA，4℃保存待用。
(2)根據(jù)已報道的雞18SrRNA基因序列和雞柔嫩艾美耳球蟲的β-actin基因序列設(shè)計Real-time RT-PCR引物 用于擴(kuò)增雞18SrRNA基因長為170個核苷酸的序列片段的引物 上游C18FAGAAACGGCTACCACATCC(SEQ NO.2) 下游C18RGCACCAGACTTGCTC(SEQ NO.3) 用于擴(kuò)增雞柔嫩艾美耳球蟲的β-actin基因長為305個核苷酸的序列片段的引物 上游PactinFCACACCGCCGAGAAGA(SEQ NO.4) 下游PactinRGAACAACATTGCCGTAGAGG(SEQ NO.5) 分別以步驟(1)所得的各樣品的cDNA為模板在熒光定量PCR儀中進(jìn)行檢測。
(3)將利用引物對PactinF+PactinR檢測的各樣品CT值表示為CT[Pactin]，引物對C18F+C18R檢測的相同樣品CT值表示為CT[18S]。
將同一樣品中二者的差值表示為△CT，如下 △CT＝CT[Pactin]-CT[C18s] 然后將各樣品的△CT值(△CTn)與最低的△CT值(△CT1)相減得到△△CT值表示為△△CTn △△CTn＝△CTn-△CT1 將只加入100個、1000個、10000個和10000個的子孢子的樣品和△△CTn值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)子孢子數(shù)目和△△CTn成如線性關(guān)系，Log[子孢子劑量]＝-0.5630△△CTn+2.9787，如圖1所述。
從而推導(dǎo)不同處理對于子孢子入侵細(xì)胞的抑制率如下
根據(jù)本發(fā)明的方法測定不同濃度Corytuberine處理所得到的△CT如表1所示，Corytuberine的助溶劑DMSO對照與不加藥物和DMSO樣品的△CT一致，可知DMSO對是試驗的結(jié)果沒有影響。以Corytuberine濃度值的對數(shù)作為X值用方程y＝min+(max-min)/[1+(x/EC50)^Hillslope]，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，結(jié)果圖2所示，Corytuberine對抑制子孢子入侵細(xì)胞的效果隨其濃度增大而提高，其半數(shù)抑制濃度為212.33ug/mL，證明Corytuberine具有抗球蟲的作用，同時也驗證了本發(fā)明柔嫩艾美耳球蟲藥物篩選方法的可靠性。
表1 此外，本發(fā)明還分析了Corytuberine對雞細(xì)胞的影響。不同濃度藥物處理的樣品的CT[18S]表示樣品中活細(xì)胞的水平，從表2可知，Corytuberine對雞細(xì)胞沒有影響。
表2 二、紫堇塊莖堿抗柔嫩艾美耳球蟲機(jī)理的探索 1、柔嫩艾美耳球蟲丙二酰單酰輔酶A∶ACP轉(zhuǎn)?；?EtMCAT)的獲得 (1)制備方法 A.根據(jù)序列表中的SEQ No.1的序列設(shè)計特異性引物，在引物的上游序列中引入BamH I酶切位點(diǎn)，在下游引物引入Sal I酶切位點(diǎn)；并分別加“CGC”3個堿基以保證內(nèi)切酶發(fā)揮作用。
EtMCAT3F5′CGCGGATCCCCAATGAAGCGAGTGGCGCTGTTCT 3′(SEQ NO.6) EtMCAT3R5′CGCGTCGACTCACTCGACTCTGACGGTGCGGAC 3′(SEQ NO.7) 以步驟1所得總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得EtMCAT的功能片段； B.將擴(kuò)增的片段和表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行BamH I和Sal I雙酶切后，進(jìn)行連接，構(gòu)建含有序列表中的SEQ ID No4所示基因的重組表達(dá)載體，利用CaCl2法轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E.coliRosseta(DE3)，30℃下用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)NTA Agarose純化。
將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示，表達(dá)產(chǎn)物的分子量為52.5kDa，為載體TrxA蛋白+His標(biāo)簽(共20kDa)和EtMCAT(32.5kDa)的融合蛋白，和設(shè)計相符。
(2)所得融合蛋白的功能檢測 利用酮戊二酸脫氫酶(KDH)偶連系統(tǒng)測定表達(dá)產(chǎn)物酶活性。在這個測定系統(tǒng)中，所述表達(dá)產(chǎn)物催化底物丙二酰單酰輔酶A(Malonyl-CoA)和?；d體蛋白(holo-ACP)生成產(chǎn)物輔酶A(coASH)和?；d體蛋白，如反應(yīng)式①，而生成的輔酶A又可作為酮戊二酸脫氫酶(KDH)的底物，在酮戊二酸脫氫酶的催化下，與底物NAD和α酮戊二酸生成終產(chǎn)物NADH，?；o酶A和CO2，如反應(yīng)式②；NADH可在340nm激發(fā)波長和465nm發(fā)射波長的條件下，發(fā)射熒光，通過檢測熒光值的變化，參照此條件下NADH的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定EtMAT的酶活性。本試驗用PerkinElmer公司VictorTM3 1420-524型多功能讀板儀動態(tài)檢測熒光數(shù)值。


①

② 具體測定方法如下 ①配制以下3種反應(yīng)液 A液將待測酶活的樣品加到含50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA，1mM DTT和0.1mg/ml BSA的溶液中。
B液將Malonyl-CoA溶于含50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA和1mM DTT的溶液中。
C液將ACP和KDH共溶于含8mM a-ketoglutaric acid，1mM NAD和0.8mM TPP的溶液中。
②將上述3種反應(yīng)液及圓底黑色96孔板放入已設(shè)定為28℃的讀板儀中預(yù)加熱5分鐘。
③依次將A液、C液和B液加入到圓底黑色96孔板中，并在同一板上設(shè)定無EtMCAT而用Tag、無KDH、無malonyl-CoA、無E.coli holo-ACP的對照。
④混勻后立即開始用VictorTM3 1420-524型多功能讀板儀在激發(fā)波長340nm和發(fā)射波長465nm在28℃測定相對熒光值(RFU)，設(shè)定儀器30秒一個循環(huán)動態(tài)讀取熒光值共15分鐘，每一反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)。
酶活檢測結(jié)果顯示，所得融合蛋白具有將催化底物Malonyl-CoA和holo-ACP生成產(chǎn)物coASH和?；d體蛋白的活性，其酶活為73.25±4.86nmol/mg/min，說明該融合蛋白確實為載體TrxA蛋白+His標(biāo)簽與EtMCAT的融合蛋白，且載體TrxA蛋白+His標(biāo)簽對EtMCAT的催化活性沒有影響。
2、紫堇塊莖堿對EtMCAT酶活的抑制作用 (1)方法 將紫堇塊莖堿(紫堇塊莖堿)溶于1％的二甲基亞砜(DMSO)配制成以下濃度的溶液1、10、50和250uM。
將不同濃度的紫堇塊莖堿與EtMCAT在28℃預(yù)孵育1小時，同時設(shè)DMSO對照(即用等體積不含紫堇塊莖堿的DMSO同方法處理EtMCAT)。按照本實驗第1節(jié)第(2)小節(jié)測定酶活的方法測定不同濃度紫堇塊莖堿處理后的EtMCAT的RFU動態(tài)值，建立RFU/時間的動態(tài)曲線。
另外在按下述方法檢測紫堇塊莖堿對KDH酶活的影響 首先配制以下反應(yīng)液 A反應(yīng)液的配制CoA加到含50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA，1mM DTT配制成60uM的存儲液； B反應(yīng)液的配制KDH加入到75μL含有50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA，1mMDTT，2.67mM a-ketoglutaric acid，0.33mM NAD，0.267mM TPP； 然后按反應(yīng)方程

建立反應(yīng)體系反應(yīng)體系為100μL，其中所含各物質(zhì)終濃度分別為PB buffer(pH6.8)50mM，EDTA 1mM，DTT 1mM，a-ketoglutaric acid 2mM，NAD 0.25mM，TPP 0.2mM，CoA 15uM，KDH 3.75mU/100μL； 最后設(shè)4個反應(yīng)體系，按順序加入A反應(yīng)液21.5μL、B溶液75μL和經(jīng)不同濃度的紫堇塊莖堿處理過的EtMCAT 3.5μL，混勻后立即開始用VictorTM3 1420-524型多功能讀板儀在激發(fā)波長340nm和發(fā)射波長465nm在28℃測定NADH的相對熒光值(RFU)，設(shè)定儀器30秒一個循環(huán)動態(tài)讀取熒光值共15分鐘，每一反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)；另外，同一板上設(shè)定無KDH、無CoA、無NAD、無α-ketoglutarate以及DMSO的對照。
(2)結(jié)果 Corytuberine對EtMCAT酶活的影響如表3所示，DMSO對照對EtMCAT的酶活性沒有影響，各陰性對照均不能催化反應(yīng)。反應(yīng)體系的速率隨著Corytuberine濃度的增加而降低，可見Corytuberine可有效地抑制EtMCAT的酶活。
表3 Corytuberine對KDH酶活的影響如表4所示，Corytuberine對KDH酶活無影響。
表4 以紫堇塊莖堿濃度值的對數(shù)作為X值用方程y＝min+(max-min)/[1+(x/EC50)^Hillslope]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析；結(jié)果圖4所示，紫堇塊莖堿對EtMCAT的IC50為16.47+2.38uM，進(jìn)一步說明紫堇塊莖堿能夠有效的抑制EtMCAT活性。由此可以推測，紫堇塊莖堿是以EtMCAT為作用靶標(biāo)，通過抑制EtMCAT的酶活，造成球蟲脂肪酸代謝紊亂，進(jìn)而抑制球蟲入侵宿主細(xì)胞。



圖1是子孢子數(shù)目與△△CTn值的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖2是紫堇塊莖堿的濃度與子孢子入侵雞細(xì)胞抑制率的曲線圖。
圖3是融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，kDa一欄表示的是標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量，泳道2是融合蛋白。
圖4是紫堇塊莖堿的濃度與酶活抑制率的關(guān)系曲線圖。

具體實施例方式 例1 散劑的制備取2.5g紫堇塊莖堿(含量不低于99％)和97.5g淀粉混勻，即可。
用法用量將上述100克散劑拌入125公斤飼料中，按日常食量喂食。
例2 可溶性粉劑的制備取2.5g紫堇塊莖堿(含量不低于99％)和97.5g葡萄糖混勻，即可。
用法用量將上述100g粉劑溶于250升水中。在用藥前給病雞斷水2小時，然后按正常飲水量喂食。
序列表
<110>廣東省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所
<120>紫堇塊莖堿在制備抗柔嫩艾美耳球蟲藥物中的應(yīng)用
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>311
<212>PRT
<213>Eimeria tenella
<400>1
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>權(quán)利要求
1、紫堇塊莖堿在制備抗柔嫩艾美耳球蟲的藥物中的應(yīng)用。
2、一種抗球蟲藥物，該藥物由紫堇塊莖堿和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成。
3、如權(quán)利要求2所述的藥物，其特征是所述的藥物為水溶性粉劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了紫堇塊莖堿的新用途，該用途是用于制備抗柔嫩艾美耳球蟲藥物。紫堇塊莖堿能有效地抑制氨基酸序列如SEQ NO.1所示的丙二酰單酰輔酶A∶ACP轉(zhuǎn)酰基酶的活性。該酶為柔嫩艾美耳球蟲II型脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，抑制該酶的活性可導(dǎo)致柔嫩艾美耳球蟲脂肪酸代謝的紊亂，但對柔嫩艾美耳球蟲宿主的脂肪酸代謝沒有影響，從而達(dá)到抑制柔嫩艾美耳球蟲入侵雞腸上皮細(xì)胞目的。
文檔編號A61K31/473GK101474181SQ200910037240
公開日2009年7月8日 申請日期2009年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日
發(fā)明者蔡建平, 孫銘飛, 覃宗華, 袁建豐, 呂敏娜, 余勁術(shù), 吳彩艷 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所