專利名稱：顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及顯齒蛇葡萄總黃酮醫(yī)藥新用途，特別是涉及顯齒蛇葡萄總黃酮在制備 防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用，具體是作為防治腫瘤放化療的不良反應(yīng)和毒副作 用、預(yù)防腫瘤發(fā)生與腫瘤轉(zhuǎn)移、防治腫瘤治療中的并發(fā)性感染疾病等藥物或保健食品。
背景技術(shù)：
顯齒蛇葡萄".^r^se^/7&^)為葡萄科蛇葡萄屬植物，其幼嫩的莖葉和芽經(jīng)過 加工和干燥，即為白茶，也稱為藤茶、田婆茶等。兩廣地區(qū)的白茶除顯齒蛇葡萄，還包括 粵蛇葡萄"'ca/ to/ ie57'51)。
顯齒蛇葡萄廣泛分布于我國的廣東、廣西、云南、湖南、湖北、江西等省區(qū)，其幼 嫩莖葉THT干重中含量達20%以上，系天然植物中生理活性成分單體含量最高的植物之 一。據(jù)調(diào)査，顯齒蛇葡萄即為"藤茶"、"白茶"，是廣東省清遠的特產(chǎn)，在兩廣民間食用 記載有1000多年歷史。白茶具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀破結(jié)等功效。
顯齒蛇葡萄(白茶)中的總黃酮具有多種藥理藥效作用，申請?zhí)?1109641. l本發(fā)明 公開了一種具有治療肝炎，保肝護肝，抗菌消炎和增強免疫系統(tǒng)免疫力作用的總黃酮組合 物；申請?zhí)?00810071687. 2提供富含蛇葡萄素的總黃酮有效部位在制備防治前列腺癌藥 物中的應(yīng)用；申請?zhí)?1106978. 3公開顯齒蛇葡萄總黃酮作為冶療口腔潰瘍的藥物及其制 備方法；申請?zhí)?00410048628.5公開了蛇葡萄屬植物及其提取物在制備防治睡眠障礙 藥物和保健品中的應(yīng)用。但上述專利申請未闡明顯齒蛇葡萄總黃酮在抑制和清除自由基的 化學(xué)損傷而防治機體的化學(xué)毒害、預(yù)防突變和繼發(fā)性腫瘤發(fā)生與腫瘤轉(zhuǎn)移，也未闡述THT 防治腫瘤放化療治療的不良反應(yīng)、預(yù)防腫瘤治療并發(fā)性感染等疾病的藥物及保健食品中的 應(yīng)用。
國內(nèi)外抗腫瘤的臨床藥物中，主要包括細胞毒類藥物、激素類藥物和生物耙向治療藥， 其中的細胞毒類化療藥物包括作用與DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物(如絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、順鈾 等)、影響核酸合成的藥物(如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、巰嘌呤等)、作用于核酸轉(zhuǎn)運的藥物 (如放線菌素D、平陽霉素等)、拓撲異構(gòu)酶I抑制藥(如羥喜樹堿、拓撲替康等)、作用 于微管蛋白的藥物(長春新堿、紫杉醇等)等，這些化療藥物往往對腫瘤患者產(chǎn)生諸多嚴(yán) 重不良反應(yīng)，包括骨髓抑制、白細胞降低、心肌毒性、肝功能損傷、免疫力低下、抵抗力 降低易引發(fā)細菌和病毒性感染、細胞突變和繼發(fā)性腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移等。在腫瘤的放療治療 中，由于輻射對機體產(chǎn)生顯著傷害，也引發(fā)了腫瘤患者的多方面的不良反應(yīng)?；熕幬锖?放療可以抗腫瘤，但本身都或多或少產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，也難以控制和消除不良反應(yīng)，尤 其是機體突變和繼發(fā)性腫瘤等。放化療治療中，化療藥物在體內(nèi)引發(fā)自由基，或本身能轉(zhuǎn) 化為自由基形式的化學(xué)結(jié)構(gòu)，攻擊細胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子，破壞這些大分子的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，致使大分子的功能被損害或逐漸失活；由于大分子蛋白的功能失活、核 酸(DNA和RNA)的線性結(jié)構(gòu)斷裂，導(dǎo)致基因突變發(fā)生，細胞修復(fù)功能嚴(yán)重下降，基因突 變的累積將引發(fā)新的繼發(fā)性腫瘤；器官應(yīng)急反應(yīng)機能和細胞逆境修復(fù)能力降低、化學(xué)毒副 作用的累積將導(dǎo)致組織和器官傷害如骨髓抑制與白細胞低下導(dǎo)致免疫力下降而并發(fā)性感 染難以控制、毛囊和真皮層損傷而導(dǎo)致脫發(fā)或皮疹，消化道和消化器官往往更易受到細胞 毒類化療藥物的毒性作用，引發(fā)厭食、嘔吐、惡心、體力嚴(yán)重下降等。
腫瘤患者一般免疫力低下，對外源化學(xué)物質(zhì)的應(yīng)急反應(yīng)和毒性作用的修復(fù)的能力也很 低，因此腫瘤臨床治療中迫切需要既能預(yù)防腫瘤發(fā)生、控制腫瘤進展和腫瘤轉(zhuǎn)移，又能控 制、減輕或防治腫瘤藥物治療的不良反應(yīng)，本身卻很少產(chǎn)生藥物不良反應(yīng)或毒副作用的新 型防治腫瘤藥物。而本發(fā)明中提供的顯齒蛇葡萄總黃酮作為防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥 物，又能抗腫瘤、預(yù)防細胞突變和繼發(fā)性腫瘤與腫瘤轉(zhuǎn)移、感染、或骨髓抑制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供顯齒蛇葡萄總黃酮(簡稱THT)在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng) 的藥物的應(yīng)用。其化療優(yōu)選為細胞毒類藥物化療，所述細胞毒類化療藥物優(yōu)選為作用于 DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物、作用于核酸轉(zhuǎn)運的藥物、拓撲異構(gòu)酶I抑制藥或作用于微管蛋白的 藥物。所述優(yōu)選為作用于核酸合成的藥物為氟尿嘧啶。所述作用于微管蛋白的藥物優(yōu)選為 長春新堿或紫杉醇。所述作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物優(yōu)選為環(huán)磷酰胺、絲裂霉素或順鉑。
所述防治腫瘤放化療不良反應(yīng)為骨髓抑制、血細胞降低、細胞突變、脫發(fā)或繼發(fā)性腫瘤。
所述腫瘤放化療不良反應(yīng)為乳腺癌、宮頸癌或腸癌放化療不良反應(yīng)，與化療藥物聯(lián)合 用藥提高腫瘤治療療效。
所述藥物為用藥學(xué)上可接受的輔料制備的口服固體制劑(包括片劑、膠囊劑、丸劑和 顆粒劑)、口服液體制劑、注射液、凍干粉針劑或大輸液劑型。
所述藥物用藥學(xué)上可接受的輔料制備的貼劑、軟膏劑、凝膠劑、搽劑、噴霧劑、軟膠 囊劑或栓劑。
本發(fā)明的還提供THT的制備方法和含量測定的方法。
本發(fā)明創(chuàng)造性發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄總黃酮清除自由基、抑制自由基反應(yīng)鏈，從而預(yù)防、控 制或消除化學(xué)藥物和輻射對組織細胞和器官的傷害或毒害，也發(fā)現(xiàn)THT抗突變和抑制腫瘤 基因表達和引發(fā)腫瘤細胞凋亡而防治腫瘤發(fā)生、防治繼發(fā)性腫瘤及轉(zhuǎn)移，還發(fā)現(xiàn)THT抑制 病毒轉(zhuǎn)染而防治感染。因此，THT作為防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物，抑制和減輕化學(xué) 傷害、防治致突變劑的損害而預(yù)防基因突變或繼發(fā)性腫瘤，將與放化療聯(lián)合用藥而實現(xiàn)防 治腫瘤放化療不良反應(yīng)和預(yù)防腫瘤發(fā)生。絕大多數(shù)腫瘤患者死亡的直接原因并非腫瘤本 身，而是腫瘤放化療的不良反應(yīng)及并發(fā)性感染等。因此，腫瘤臨床治療的目標(biāo)是，結(jié)合切 除手術(shù)，通過藥物治療，有效控制和消除腫瘤，降低放化療治療中的不良反應(yīng)，消除腫瘤 治療中的并發(fā)癥，提高患者的生存質(zhì)量和遠期療效。THT集多種藥理與藥效作用于一身的 多功能的特點是目前腫瘤臨床治療中單一藥物所不具備的，將使得它在腫瘤治療中得到廣
4泛應(yīng)用。


圖1 (a)為用DMPO捕集的光照核黃素/EDTA)體系產(chǎn)生的0—2自由基的ESR特征波譜。 圖l (b)為體系中加入THT對該體系產(chǎn)生的C^自由基的ESR特征波譜。
具體實施例方式
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，通過下面的實施例詳細說明本發(fā)明，但是應(yīng)該理解這 些實施例只是說明本發(fā)明，而不是在任何方面限制本發(fā)明的范圍。 實施例1: THT的提取與分離制備
提取工藝方法將干燥的顯齒蛇葡萄植物的幼嫩葉和嫩芽的混合物，按l: 8 10的 重量比(原料水)加入純化水，加熱至7(TC浸泡0.5-1小時后，加熱至沸騰，保溫提 取30 60分鐘，趁熱以陶瓷膜(30KD截留)切向流超濾，收集提取液；再次按l: 5 1:
8的重量比(干原料水)加入純化水，加熱至沸騰，保溫提取20 40分鐘，趁熱以陶 瓷膜(30KD截留)切向流超濾，合并收集提取液；將提取液減壓濃縮至體積為原體積的 20% 40% (或相對密度為1. 06-1. 10)時，加入食用酒精至乙醇終濃度為50% 75%，加熱 至沸騰回流保溫20 60分鐘，壓濾或離心去沉淀，回收乙醇后，將濾液冷卻靜置1 2 天，收集沉積物(將上清液倒出，中間的渾濁液壓濾或離心收集沉淀)，此沉積物即為THT 粗提取物；在總黃酮粗提取物中加入適量的純化水，攪拌混勻，靜置1天，收集沉積物， 85'C以下(減壓)干燥，獲得的干燥物即為THT。粉碎后為淺灰色至黃白色粉末。
實施例2: THT的黃酮含量的比色法測定
1. 原理黃酮化合物中的酚羥基能與Al3+離子形成黃色絡(luò)合物，特征吸收波長為 314nm。顯色濃度與黃酮含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。
2. 儀器和試劑
分析天平，靈敏度0.0001g;紫外-可見分光光度計； 無水甲醇(AR); 5XA1C13溶液；二氫楊梅素(對照標(biāo)準(zhǔn)品)。
3. 檢測方法
(1) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制將二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品置稱量皿內(nèi)，于105'C干燥至恒重， 取出置干燥器內(nèi)自然冷卻，立即精密稱取0.0504g，甲醇溶解，定容至50ml。
(2) 標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度樣液配制分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 (作為空白對照)、2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0ml,置10ml容量瓶中，以無水甲醇定容至10ml，搖勻后室溫放置 待用。
(3) 比色操作:將標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度樣液均準(zhǔn)確取樣0. 3ml，置10ml容量瓶中，移取3. Oml 5XAlCl3溶液混合，加甲醇定容至刻度，搖勾后轉(zhuǎn)入10ml具塞試管內(nèi)，室溫放置。40min 后，以空白對照為參比、在波長314nm測定各樣品吸光值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4) 樣品測定精密稱取THT約0. 0406g,甲醇溶解定容50ml。按照標(biāo)準(zhǔn)品比色過 程進行測定。
54.結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)對照品二氫楊梅素的濃度梯度(mg/ml)與吸光值(0D314nm)有很好的 線性關(guān)系，其關(guān)系式為Y-2.0574x-0.0012[R2=0. 9999，其中x為濃度(mg/ml) ,y為吸光 值(0D314nm)]。測定的THT樣品的0D314為1. 598，經(jīng)計算，其總黃酮的濃度為0. 7761 mg/ml 總黃酮的含量為95. 58%。
實施例3: THT對過氧化特丁烷(T朋P)引起的高鐵血紅蛋白生成的抑制作用
1、 實驗方法
將壓積紅細胞加入雙蒸水，制成1%紅細胞的完全溶血液，分別加入各樣品組分37。C 溫孵30min,加入TBHP使其終濃度達到250uM，繼續(xù)溫孵30min，測定OD咖檢測高鐵血紅 蛋白含量的相對變化。高鐵蛋白生成抑制率的計算
生成抑制率=(氧化損傷組0D63。-樣品組0D63。)/(氧化損傷組OD咖-對照組0D63。)
2、 實驗結(jié)果
TBHP在水相中逐漸釋放出H202， HA被游離的或血紅素中結(jié)合的鐵催化，通過Fenton
反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子和羥基自由基。正常紅細胞血紅蛋白的ci 、 e肽鏈的最大光吸收值分
別在540、 577nm，當(dāng)紅細胞受到TBHP的氧化攻擊后，部分氧合血紅蛋白迅速轉(zhuǎn)換成高鐵 血紅蛋白，在630nm附近有最高吸收峰。在TBHP的作用下，氧合血紅蛋白(其最大吸收 峰在540rnn和575nm處)被破壞，部分被轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白(其最大吸收峰在630ran 處)。如表1所示，THT的添加量與其對高鐵血紅蛋白生成的抑制作用呈正相關(guān)且量效關(guān) 系明顯。說明THT加入到紅細胞的完全溶血液中后，T朋P對氧合血紅蛋白的破壞和高鐵 血紅蛋白的促進生成都受到了抑制作用，氧合血紅蛋白的吸收峰升高，而高鐵血紅蛋白的 吸收峰降低。
表l、 THT對TBHP引起的高鐵血紅蛋白生成的影響
THT (ug/ml) 高鐵血紅蛋白生成抑制率(％)
10 9.3
20 17.6
40 31.5
80 37.2
實施例4: ESR技術(shù)檢測THT對自由基的清除作用
ESR技術(shù)是研究自由基和抗氧化劑最直接最有效的方法。為了檢測和辨認短壽命自由 基，需將一不飽和的抗磁性物質(zhì)一自由基捕集劑，加入反應(yīng)體系，捕捉瞬時自由基，從而 可以得到能用ESR波譜儀在常溫下檢測到的壽命較長的自由基。 1.材料和方法
材料DMPO(5, 5-imethyl-1-pyrroline-l-oxide)在使用前用活性炭提純，提純后無雜 質(zhì)ESR信號。丙酮、乙酸乙酯、核黃素、二苯基苦基苯肼(DPPH)等試劑均為分析純。THT 為分離純化制備。
6ESR測試使用Brucker 200型ESR波譜儀，測試條件為X波段，微波功率20raW,調(diào) 制100kHz,調(diào)幅O. lmT，掃寬20mT，中心磁場324. 5mT，室溫下檢測。
利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生 0H自由基，用DMP0捕集 0H自由基反應(yīng)體系共50 u L， pH=7.4，其中含有0. 04M DMP0、 0. 01%H202、 0. 025mM FeS04、樣品溶液或PBS (磷酸鹽緩沖 液PH=7.4)5uL，迅速混勻，吸入石英毛細管中，記錄一分鐘時的ESR波譜。光照核黃素 產(chǎn)生02—自由基，DMP0捕集(V自由基。反應(yīng)體系共30uL， pH=7.4，其中含有0. 08M DMPO、 0.3M核黃素、5mM EDTA鈉鹽、2mM DETAPAC、樣品或PBS 5uL，迅速混勻，吸入石英毛 細管中，光照90秒后，進行測試。 2.結(jié)果
由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的ESR波譜是由4條譜線組成高度比為1: 2: 2: 1 的典型圖譜(g-2. 0045， aN=aH=l. 49mT)。加入THT對波譜信號的超精細分裂常數(shù)和g值沒 有影響，隨著THT濃度的增加，其ESR信號強度遞減。故用波譜信號第二峰的峰對峰高度 h(mm)表示ESR信號的相對強度。在Fenton反應(yīng)體系中，加入不同濃度的THT對該體系產(chǎn) 生的羥基自由基進行了清除,清除后的ESR波譜如圖l所示。加入不同濃度的THT后，ESR 信號強度明顯減小，而且具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。
如圖la、圖b所示，用DMP0捕集光照核黃素/EDTA體系產(chǎn)生的0—2自由基的ESR波譜 是由12條譜線組成的典型圖譜(aN二1.42mT， aBH=l. 12mT， aCH=0. 13mT)。加或不加THT 對波譜信號的超精細分裂常數(shù)沒有影響，僅信號強度不同。如表2所示，加入不同濃度的 THT后，其中(b) (c) (d)的波譜峰高顯著降低，隨著樣品濃度的增加，清除0—2自由基的
在樣品濃度為100li g/ml時，已將產(chǎn)生的0—2自由基100%清除。 表2 ESR法檢測THT對自由基的清除能力
效果也越來越明顯。
加入THT濃度(u g/ml) 20 40 100 200 對照為PBS
清除0H自由基(百分數(shù)y。 27.4 50.3 65.5 100 0
加入THT濃度(ng/ml) 3 15 30 100 對照為PBS
清除02自由基(％) 27,2 60.9 79.4 100 0
加入THT濃度Ug/ml)
10
20
對照為無水乙
清除DPPH自由基(％)
40. 5 50. 7 85. 5
100
0
注清除率可以用某樣品濃度的峰高除以對照的峰高計算。峰高的計算方法
由基取第二峰的高度，超氧自由基取第一峰，DPPH取第3峰。二苯基苦基苯肼(DPPH)自
由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基。
THT能夠清除超氧自由基、羥基自由基和含氮自由基，是由于他本身的分子結(jié)構(gòu)， 不僅可螯合消除金屬離子作為自由基鏈反應(yīng)的引發(fā)劑，阻止和抑制自由基的產(chǎn)生，而且可 以清除、捕集自由基使其反應(yīng)鏈中斷，在機體中的細胞及其生化代謝反應(yīng)中發(fā)揮抗氧化作
7用，以此廣泛地參與、介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機體，發(fā)揮其藥理與藥效作用。自由基是許多化學(xué)物質(zhì) 和輻射對機體細胞產(chǎn)生傷害或毒害的主要原因。自由基對細胞膜產(chǎn)生損傷、對脂質(zhì)、蛋白 質(zhì)和核酸的分子構(gòu)象實施非特異性氫抽提和化學(xué)加成而形成高分子自由基，這些高分子自 由基將和其他的蛋白質(zhì)高分子形成高分子聚合物或?qū)е潞怂峋€性分子斷裂，從而破壞高分 子的結(jié)構(gòu)及功能。
實施例5: THT對HA引起紅細胞溶血及MDA生成的作用
1. 方法
取新鮮抗凝人靜脈血，3000r/min離心10min，棄上清液，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS， pH二7.4)洗滌，3000r/min離心10min，重復(fù)2次，得到壓積紅細胞；以PH7. 4 PBS將壓 積紅細胞配成1%。各取lmliy。紅細胞懸液分別加入THT至10、 20、 40、 80ug/ml， 37°C 溫育30min，然后分別加入終濃度為300畫1/L H202， 37"溫孵3小時，3000r/min離心 lOmin，取上清液測定OD54。(A);以壓積紅細胞，用蒸餾水稀釋成1%紅細胞，作為完全溶 血的對照，同樣處理，測定0D54。(B)。按公式(A/B)X100。/。計算溶血的變化。再取上述反應(yīng) 混合液檢測丙二醛(MDA)的含量(按MDA試劑盒的測定方法)。
2. 實驗結(jié)果
THT對&02誘導(dǎo)的紅細胞溶血以及MDA的生成都有顯著的抑制作用。在氧化損傷組中， 紅細胞溶血率高達65. 12±3. 13%， MDA生成量高達9. 35±0.20 nmol/ml;當(dāng)THT濃度為 10ug/ml時，紅細胞溶血率降到52. 60±2. 91%, MDA生成量降到7. 98±0.19 nmol/ral; THT 濃度升高到20ug/ml時紅細胞溶血率降到36.75±1.43%， MDA生成量降到3.94土0. 14 nmol/ml，相鄰THT濃度間，紅細胞溶血率及MDA生成量均有極顯著差異(P〈0. 01)，且THT 組與氧化損傷組均有極顯著差異(P<0. 01)。
表3 THT對H202引起的紅細胞溶血及MDA生成的影響
THT (ug/ml) MDA (nmol/ml)
(%)
065.129.35
1052. 617.98
2036. 753. 94
4033.803.36
8030. 963. 15
MDA的實際含量反映了脂質(zhì)過氧化物的濃度，老年退行性疾病發(fā)展的重要原因。
紅細胞的溶血率與MDA的生成量有著密切的聯(lián)系，在THT濃度升高的過程中，它們的 降幅保持一致。紅細胞膜在自由基的攻擊下引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，MDA是脂質(zhì)過氧化過程 的中間產(chǎn)物，其生成量是脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)；而隨著膜脂質(zhì)過氧化損傷的加劇， 紅細胞膜的完整性遭到破壞，最終導(dǎo)致了溶血。由于紅細胞溶血率和MDA生成量都是脂質(zhì)
8過氧化損傷在不同層次上的反映，因此他們之間也表現(xiàn)出了相當(dāng)?shù)囊恢滦浴?實施例6: THT對HA誘導(dǎo)的細胞氧化損傷的抑制作用
Hela細胞以含10y。滅活的新生牛血清、lOOU/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素以及含 2 mmol/ml谷氨酸鹽的DMEM培養(yǎng)基，在5%C02、 37°C、相對濕度95%條件下培養(yǎng)。培養(yǎng) 細胞單層生長、當(dāng)瓶底細胞的覆蓋度達90%時，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。每兩 天換液一次，僅指數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。
指數(shù)生長期的細胞以0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用含10%新生牛血清的 DMEM培養(yǎng)基稀釋，調(diào)整細胞密度至2X107ml，以每孔100ul接種于96孔培養(yǎng)板，37°C、 5% C02條件培養(yǎng)24小時。加入THT使其終濃度分別為5ug/ral、 10ug/ml和15ug/ml。溫 育30分鐘后Hela細胞中加入不同劑量的&02作為氧化損傷劑；
在各個不同的仏02濃度下，HA都能顯著降低Hela細胞的活力。當(dāng)HA的濃度等于或 低于1. 2mM時，THT處理組相對于不加THT組，Hela細胞活力大多得到顯著增高且增高程 度與THT的終濃度呈正相關(guān)(表4)。
_表4 THT對H2(U秀導(dǎo)的Hela細胞氧化損傷的影響_
不同濃度的THT(ug/ml)的細胞相對活力 H2o2 (mM) -
0 5 10 15
0100±1.32 101.35±4.37 99.29±1.30 97.74±3.66
0.2 81.84±2.67 94.42±4.79 95.21土1.57' 95.62±2. 15'
0.4 58.09±1.81 77. 32±2. 18' 83.47士1.39' 90.37±3. 14'
0.6 36.77±2.20 58.23士4.31' 60.44±4. 14' 71.38土1.63'
1.2 20.01±2.42 21.81±1.37 36.39±3. 19' 40.97±2.65'
2.4 17.81±1.05 18.03±4.91 18.35±2.84 18. 12±3.76
實施例7: THT對骨髓抑制小鼠模型的藥效試驗-
1、材料和方法
環(huán)磷酰胺；THT。昆明鼠，18 22g， 30只，8 12周齡。雌雄不拘，由中山大學(xué)實驗 動物中心提供。
造模方法環(huán)磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，0.2ml/次，每日一次，連續(xù)三次。 動物分組與處理10只/組，
① 造模組環(huán)磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每日一次，連續(xù)三次。
② 正常對照組在其它組注射環(huán)磷酰胺時注射生理鹽水0.2ml/次。
③ THT組環(huán)磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每日一次，連續(xù)三次。按照THT 125mg/kg每天灌胃一次，連續(xù)10天。觀察體征變化。在最后一次THT后的次日處理動物進行觀察。采用尾靜脈采血，進行血細胞計數(shù)。 小鼠處死后，取出股骨，剔除肌肉和結(jié)締組織，剪開股骨兩頭，用6號針頭以RPMI1640 液沖出骨髓細胞，檢測骨髓有核細胞數(shù)。 2、實驗結(jié)果
THT對環(huán)磷酰胺的骨髓抑制有顯著的保護作用(表5)，環(huán)磷酰胺組的骨髓有核細胞數(shù) 目與對照組相比明顯減少，而THT加速損傷骨髓造血功能的恢復(fù)。
表5各組外周血象與體征變化
RBC PLT 有核細胞數(shù)體重抑皮毛脫
(xio'7l) (xio7l) (xioVl) 制(％) 落
WBC (X10VL)
組別
正常對照組5.4±0.9
4.6±0.7
7.35±0.113
2.08±0.14
極少
造豐莫纟且 2.7±0.6 3.0±0.6 2.45±0.101 1.2±0.3
7.2 多，易
脫落
THT組 4.3±0.5* 4.0±0.5*4.78±0.118* 1.89±0.16* l.f
極少
實施例8: THT的抗突變作用
1、 實驗方法
環(huán)磷酞胺(CyCloPhosphamide簡稱CP)、絲裂霉素C(Mitomyein簡稱MMC) ， N-甲基-N ' -硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N' -nltro-N-nitrosogua-nidine簡稱MNNG),秋水仙堿。
(1)小白鼠骨髓PCE微核試驗將NIH小白鼠隨機分成5組，即一個陰性對照組， 3個THT試驗組和1個陽性對照組。陰性對照組小鼠每日每只ig 0. 3ml生理鹽水，3個 THT給藥組分別以20、 40和60mg/kg的THT劑量ig小鼠給藥，給藥至第7天的同時腹腔 注射100mg/kg劑量的CP， 24h后再以相同劑量的CP腹腔注射小鼠，6h后處死小鼠。陽 性對照組小鼠僅ig生理鹽水，腹腔注射CP的時間、劑量既處理與給藥組一致。制備小鼠 骨髓細胞微核玻片標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)嗜多染紅細胞(PCE)總數(shù)和含微核的PCE數(shù)， 當(dāng)1個PCE中出現(xiàn)2個以上微核均按1個細胞計，并按下列公式計算各組微核細胞率 (麗CF):
MNCF^含微核的PCE數(shù)/觀察到的PCE總數(shù))X 1000%。 (2)小鼠骨髓細胞染色體崎變(CA)試驗動物分組及THT劑量均與"小鼠骨髓細胞 PCE微核試驗"相同，所不同的是在給藥第7天的同時給藥組和陽性對照組小鼠均腹腔注 射1次2mg/kg劑量的MMC，在處死小鼠前3h再腹腔注射4mg/kg劑量的秋水仙堿溶液進 行預(yù)處理，按常規(guī)法制備骨髓細胞染色體玻片標(biāo)本。每一實驗組鏡檢觀察500-1000個中 期細胞分裂相，記錄染色體畸變細胞數(shù)和畸變類型，主要觀察染色單體斷裂，無著絲粒染 色體斷片和環(huán)狀染色體等，然后計算各組的畸變細胞率-含CA的細胞數(shù)/觀察的分裂中
期細胞數(shù)。
2、 實驗結(jié)果
10(1) THT對由CP誘發(fā)小鼠骨髓細胞微核的抑制作用
THT對由CP誘發(fā)的小鼠骨髓PCE微核的抑制效應(yīng)實驗表明，高、中和低3個劑量的 THT抗突變試驗組CP誘發(fā)的小鼠骨髓細胞MNCF顯著低于陽性對照組，THT試驗組對由CP 誘發(fā)的MNCF的抑制率分別為69. 5%， 60. 1%和41. 5%(抑制率=[(陽性對照組的腦CT 一試 驗組的顧CF)/陽性對照組的MNCF] X 100%)，在所測的劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。
(2) THT對由MMc誘發(fā)的小鼠骨髓細胞cA的抑制作用
THT試驗組的CA細胞率(CAF)與MMC陽性對照組的CAF比較，均達顯著性差異(P〈0. 05)， 低、中和高3個劑量的THT抗突變試驗組對由MMC誘發(fā)的CAF的抑制率分別為64. 6%，57. 3% 和48. 5%，低劑量THT試驗組對CA的抑制效應(yīng)略高于高劑量組，劑量與效應(yīng)關(guān)系呈負相 關(guān)性。
THT的抗突變作用表明其具有抑制致癌物的作用，即具有抗致癌和抗致突變作用，從 而預(yù)防機體細胞發(fā)生突變和癌變。目前腫瘤的發(fā)生大多為致突變化學(xué)物質(zhì)造成機體損傷、 或誘導(dǎo)細胞突變和癌變，因此，THT具有預(yù)防腫瘤發(fā)生、預(yù)防癌癥患者在長期化療中的繼 發(fā)性腫瘤、控制和減少高致癌條件下的癌變形成等藥效作用。
實施例9: THT對荷瘤小鼠輻射損傷的保護作用 1、實驗方法
NIH小白鼠;THT。
(1) THT對NIH小白鼠輻照的影響
NIH小白鼠6-7周齡，每組10只，，雌雄兼用，分組包括
① 正常對照組飲服生理鹽水；
② 照射組60COY射線照射；
③ 照前飲服O. 1% THT生理鹽水溶液，照后不服THT; 照后灌胃(ig) 100mg/kg;
照后ig 200 mg/(bw d)生血寶。照射前7 d均自由飲服。
照射前7d均自由飲服，照射后7 d每天ig. 100 mg/kg，第10天股動脈取血，計數(shù) WBC和RBC，再將各組鼠處死后計數(shù)胸腺和脾臟指數(shù)。照射:60Co源由華南農(nóng)大輻照中心 提供，Y射線一次性照射，總吸收劑量為4. 5 Gy,吸收劑量率為0. 97Gy/min。
(2) THT對荷瘤小鼠輻照的影響
18周齡的小鼠，體重22 24g，隨機分成6組，每組10只，A組:CK; B組:荷瘤；C
組荷瘤+THT+照射；D組荷瘤+照射+THT; E組荷瘤+照射；F組荷瘤+THT。飼養(yǎng)7d
后，除A組外其余按移植性腫瘤研究法接種。5ml—次性注射器抽取S180腹水癌小鼠腹 水，生理鹽水稀釋5倍后，每只小鼠注射0.3ml(A組除外)。第2天開始，C組和F組小 鼠每天ig.THT，劑量為100/kg。 15 d后，C、 D和E組進行60CoY射線照射，吸收劑量 為100 cGy。照射后對D組小鼠ig THT(劑量同上)，C組則停止ig. THT。再經(jīng)15 d后， 脫頸處死，解剖，按前述方法檢測紅細胞、白細胞、免疫器官指數(shù)。2、實驗結(jié)果
(1) THT對免疫器官輻射損傷影響
Y射線照射后，小鼠胸腺和脾臟嚴(yán)重損傷。小鼠在受照前或后THT ig胸腺指數(shù)和脾臟指 數(shù)均顯著高于對照組。
(2) THT對小鼠造血功能的影響
輻照前ig. THT組和輻照后ig. THT組小鼠的紅細胞、白細胞均明顯高于照射組(表6)。 表明THT對輻照所致的血象損傷具有明顯的防護效應(yīng)。
表6 THT對輻照小鼠血象的作用
處理組紅細胞(xio7l)白細胞(xio7l)
①9. 53±0, 857. 35±0. 59
②4. 45±0. 75tt1. 89±0. 53 #
③5. 47±0. 46*4. 31 ±0. 42*
7.61±0. 53**5. 25±0. 65**
⑤8. 15±0. 53**6. 27±0. 53**
注與照射組比較* p<0.05，** p<0. 01;與對照組比較弁p〈0. 01
(3) THT對荷瘤小鼠照射的影響
小鼠血象和體重增重的實驗結(jié)果見表7。與A組比較,荷瘤小鼠的3種生理指標(biāo)均低 于生理鹽水對照組,受照射各組的指標(biāo)達到顯著性水平，說明小鼠荷瘤后，體質(zhì)下降，受照 后下降更明顯。F組3種生理指標(biāo)均高于B組，說明THT對荷瘤小鼠的生活質(zhì)量具有一定 的保障。C、 D、 F組的白細胞水平都高于E組，且達到顯著水平，說明THT對小鼠白細胞的 照射損傷具有顯著的保護作用。
表7 THT對輻照小鼠血象的作用 處理組 紅細胞(X107L)白細胞(X107L) 體重平均增重(g)
A 5.53土0.40眾 5.45±1.25* 5.90士0.82眾并A
B 2.45±1.25*tt 2.89±1.13*# 1.51±0.95眾#血
C 3.78±1. 10眾* 4.55±0.52*# 3.57士0.85眾并A
D 3.21±0.65* 4. 19±0.75眾# 2.32±0.81**
E 3.55±0.55眾 3.46±0.85#A 2.45±1.32*A
F 4. 18±0.50眾 4. 75±0.50眾 2.85±1.51*眾
注與對照組比較* p<0.05,與B組比較眾p<0. 01;與E組比較并p〈0. 01;與C組比較Ap〈0. 01 荷瘤小鼠免疫器官實驗結(jié)果(表8)表明，B組小鼠荷瘤后每克脾臟、胸腺的細胞數(shù) 和脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著低于A組空白對照。C、 D禾n F組荷瘤小鼠的4種指標(biāo)均高于B 組荷瘤小鼠，且差異顯著。說明THT能夠維持荷瘤小鼠的免疫細胞的增殖生長,并且接近正 常水平。C、 D的4種指標(biāo)均高于E組,除D的每克胸腺細胞數(shù)外，其他都達到顯著水平,表 明THT在腫瘤的輻射治療中保持機體免疫功能具有顯著藥效作用。
12表8 THT對輻照小鼠血象的作用 處理組 器官指數(shù)(mg/10g體重) 免疫器官細胞數(shù)(Xl(f個/g)
脾 胸腺 脾 胸腺
A B C D E F
4. 53±0. 40眾 2. 41±0. 75 * 4, 28±0. 51眾* 4. 59±0. 88眾* 2.65±0. 55*A
2. 65±0. 20眾1.73±0. 20眾#
1. 72±0. 53* 0, 73±0. 35*
2. 85±0. 45眾 1.57±0. 32眾# 2. 30±0. 53眾 1.45±0. 49眾# 2. 57±0. 75眾 0.93±0.
4. 35±0. 65眾# 3. 60±0. 55眾 1. 76±0. 15眾# 注與對照組比較* p〈0.05，與B組比較眾p<0.01;與E組比較并p〈0.01;與C組比較Ap〈0. 01 本試驗研究表明THT具有抑制輻射對免疫細胞和免疫器官的損傷與毒害作用，這對于 腫瘤放療治療的機體保護、減輕和控制化療中的不良反應(yīng)與骨髓抑制、提高機體免疫力的 藥效作用。
1. 71±0. 19眾
0. 80±0. 41* 2. 05±0. 582眾# 1, 49±0. 53*眾 1.29土0. 75眾A 2.08土0. 52眾#
實施例10: THT對人宮頸癌HeLa細胞及移植瘤的抑制和凋亡作用 1、實驗方法
人宮頸癌HeLa細胞；BALB/c-nu裸鼠。
RPMI-1640培養(yǎng)基和胰酶(EDTA)美國Gibco公司產(chǎn)品。新生小牛血清購自杭州四季青 生物工程材料有限公司，噻唑藍(MTT)染液為北京中山公司產(chǎn)品。Annexin V-FITC/PI凋亡 檢測試劑盒為Bender Medsystem公司產(chǎn)品。
(1) THT對宮頸癌HeLa細胞的抑制與凋亡作用
宮頸癌HeLa細胞培養(yǎng)于含10%新生小牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于 5%C02、 37°C、 95%飽和濕度的恒溫密閉孵箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，每日觀察細胞的生長情況。 3d傳代l次。在0—80ug/mlTHT濃度遞增時，多孔板培養(yǎng)HeLa細胞，3個復(fù)孔，MTT 法檢測細胞活力，流式細胞儀觀察細胞凋亡作用。
(2) THT對宮頸癌HeLa細胞移植瘤的抑制作用
BALB/c-nu裸鼠，4-6周齡，18-22g，雌性，取對數(shù)生長期的人宮頸癌Hela細胞(1 X107ml)，在無菌條件下于裸鼠背側(cè)近右后肢處皮下接種，0.2ml/只。接種后第14天可 見腫瘤生長，腫瘤呈菜花狀，色紅，質(zhì)硬，可活動，腫瘤長至約50-80mm3，時開始抑瘤實 驗。
裸鼠皮下接種腫瘤6 d后，32只小鼠皮下移植處均成瘤，將小鼠隨機分成4組。對照 組，生理鹽水0.5ml/只；THT組，60mg/kg， 1次/天，ip0.5ml;氟尿嘧啶(5-Fu)組， 30mg/kg， ip， 1次/4d，共6次；THT-5-Fu組，30mg/kg， 1次/天，ipO. 5ml， 5-Fu， 30 mg/kg， ip， l次/4d，共6次。腹腔注射給藥，連續(xù)用藥24d，每只小鼠注射液體量相等， 均為0. 4 mL，第26天處死全部小鼠進行指標(biāo)檢測。
抑瘤率測定:按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥;接種后每2天測量1次小鼠皮下腫瘤最長徑(a)
13和最短徑(b)，計算腫瘤體積[V二 (aXb2) /2]，繪制腫瘤生長曲線。接種后第26天脫頸 椎處死小鼠，完整剝離腫瘤稱重，計算抑瘤率，抑瘤率=(1-干預(yù)組平均瘤質(zhì)量/對照組平 均瘤質(zhì)量)X100。/。。 2、實驗結(jié)果
(1) THT對宮頸癌HeLa細胞的抑制與凋亡作用
THT對人宮頸癌HeLa細胞的增殖具有極顯著的抑制作用(表9)。 表9 THT對宮頸癌HeLa細胞活性的抑制作用
細胞活力的抑制率
THT ( ug/ml)
0
10
20
40
60
(%)
0 9.80 15.7 40.6 79.1 89.5
以AnnexinV-PI雙標(biāo)染色流式細胞儀分析THT對宮頸癌HeLa細胞凋亡表明，不同濃 度的THT作用宮頸癌HeLa細胞24、 48、 72h后，細胞凋亡發(fā)生率明顯增高，隨THT濃度 加大和作用時間延長，凋亡率明顯增高，與對照組相比具有極顯著差異性。THT誘導(dǎo)人宮 頸癌HeLa細胞具有明顯的藥物濃度依賴性，在同一時間段，隨藥物濃度的增加細胞凋亡 率增加，兩者呈正相關(guān)(P〈0.01)。同一濃度不同時間段(24， 48, 72 h)細胞的凋亡率逐漸 增加，80 P g/ml濃度THT作用72 h后的凋亡率最高，己經(jīng)超過70%。 (2) THT對宮頸癌HeLa細胞移植瘤的抑制作用
接種宮頸癌HeLa瘤細胞后，成瘤率為100%。各組皮下移植瘤的體積逐漸增大，腫瘤 成局部結(jié)節(jié)狀生長，接種后的第l一6天，移植瘤生長速度基本相同，但隨后對照組移植瘤 生長明顯快于其他給藥組。26 d后，THT處理組腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量均低于對照組(P〈0. 01)，而與治療對照組比較無顯著性差異(P〉0. 05)，表明THT對宮頸癌具有顯著抗腫瘤作 用(表IO)。
表IO THT對宮頸癌增殖的抑制作用
動物數(shù) 瘤體重(g) 抑制率(％) 8 1.351±0.373 /
8 0.406±0.117* 69.9*
8 0.417±0.121* 69.1*
8 0.365±0.101* 72.9*
*P<0.01,相對于陰性對照組。 實施例ll: THT對人乳腺癌裸鼠移植瘤細胞增殖和凋亡作用
1、實驗方法
材料健康雌性純種裸鼠BALB/c(nu/nu)， 4-6周齡，重13-20 g，購自中山大學(xué)實 驗動物中心。5-氟尿嘧啶(5-Fu); Ki67、 Bcl-2抗體及相關(guān)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù) 有限公司。原位凋亡檢測試劑In Situ Cell Death Detection (Pod kit),購自Roche公
處理組 陰性對照 THT 5-Fu
THT-5-Fu組
體征變化 皮毛脫落少 皮毛脫落少 皮毛脫落較多 皮毛脫落少
14司。人乳腺癌細胞株MDA-MB-231; THT。
人乳腺癌細胞裸鼠移植瘤的建立人乳腺癌細胞株MDA-MB-231在含10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代擴增，收集對數(shù)生長期細胞制備懸液，活細胞濃度為IX 107ml。SPF環(huán)境下進行實驗操作，在每只裸鼠右胸乳腺脂墊內(nèi)接種細胞懸液0. 2 ml/只(含 細胞數(shù)2X106個)，4周左右形成明顯可見的移植瘤，32只荷瘤鼠隨機分組用藥。
動物分組及用藥
① 對照組8只，丙二醇O. 1 ml/只，ip，共15 d; 0.9% NS， 0.1 ml/只，ip，共5 d。
② THT組8只，THT60 mg/(kg d)，溶于0. 1 ml丙二醇中，ip，共15 d; 0. 9% NS 0. lml/ 只，ip，共5 d。
③ 5-Fu組:8只，5-Fu30mg/(kg *d)，溶于0. 9% NS 0. 1 ml ， ip，共5 d;丙二醇0. lml/ 只，ip，共15 d。
THT+5-Fu組8只，THT60 mg/(kg d)，溶于0. 1 ml丙二醇中，ip，共15 d; 5-Fu 30 mg/(kg d)溶于0. 9% NS 0.1 ml中，ip，共5 d。
抑瘤率觀察每隔2d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大長徑(a)、橫徑(b)，計算腫瘤體積， 平均瘤體積-(aXb2)/2，并繪制移植瘤生長曲線；實驗結(jié)束后，完整剝?nèi)∧[瘤，稱量瘤重。 按以下公式計算藥物的抑瘤率抑瘤率=(1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)X100%。觀 察體征變化。
Ki67、 Bel-2表達的檢測Ki67抗原采用SP法免疫組化染色，陽性細胞胞核染成棕 黃色。按，下述計算Ki67指數(shù)(Ki67-LI):低倍下(X 100倍)確定有代表性的Ki67染色 陽性5個視野，高倍下(X400倍)每個視野數(shù)200個腫瘤細胞，其中陽性細胞所占百分比 即為Ki67-LI。 Bel-2采用SP法免疫組化染色，陽性細胞胞漿染成棕黃色。按下述進行結(jié) 果判定:觀測100個腫瘤細胞中陽性細胞的百分比，其陽性率<10%為(-)，陽性率10%~25% 為(+)，陽性率25%~50%為(++)，陽性率>50%為(+++)。陰性對照均用PBS代替第一抗體。 2、實驗結(jié)果
MDA-MB-231乳腺癌細胞接種于裸鼠乳腺脂墊，4周左右形成明顯可見移植瘤，呈分葉 狀或結(jié)節(jié)狀生長。用藥期間，裸鼠無死亡。THT組、5-Fu組、THT+5-Fu組抑瘤率分別為 41.5%、 44.6%、 50.3%，以聯(lián)合用藥組腫瘤生長受抑制最明顯(表11)。
表ll THT對人乳腺瘤的抑制作用
處理組動物數(shù) 瘤體均重(g) ，l自( f
陰性對照 8 0.5221 ±0.131
THT 8 0.3105±0.0703* 40.5
5-Fu 8 0.2890±0.1711* 44.6
THT+5-Fu 8 0.2410±0.1003* 53.8
THT對移植瘤細胞增殖的影響
在光鏡下觀察腫瘤組織，對照組移植瘤細胞仍保持培養(yǎng)狀態(tài)下癌細胞原有的異型性，形狀不規(guī)則，核大深染，核異型，可見異常核分裂相。THT用藥組腫瘤細胞呈現(xiàn)不同程度 退行性變，部分腫瘤組織出現(xiàn)明顯壞死。Ki67免疫組化顯示Ki67抗原表達于乳腺癌細 胞核內(nèi)，陽性細胞呈棕褐色染色。對照組Ki67-LI高于THT組、5-Fu組、THT+5-Fu組， 有顯著性差異(P〈0. 01)(表12)，表明THT用藥組腫瘤細胞增殖受到明顯抑制，結(jié)合光鏡分 析，THT對腫瘤細胞也有一定直接細胞毒性作用。
表12藥物對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響 處理組 動物數(shù) Ki67-LI(%) AI (%)
陰性對照 8 65. 15±3.69.5±2. 1
THT 8 42.93±3.11* 27.5±2. 1*
5—Fu 8 45.07±2.88* 25.4±1.3*
THT +5—Fu 8 40. 10±2.95* 37.8土2.6*A
*P<0.01，相對于陰性對照組；AP〈0.05, 5-Fu和THT處理組間。 THT對移植瘤細胞凋亡的影響
Tunel法檢測，在熒光顯微鏡下見凋亡細胞呈黃綠色熒光細胞，細胞體積縮小鈹縮，治 療組較對照組凋亡細胞明顯增多。光鏡下見凋亡細胞核染成棕黃色。結(jié)果表明THT組、 5-Fu組、THT+5-Fu組凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0. 01) ， THT+5-Fu組明顯高于THT組、 5-Fu組(P〈0.05) 。 THT可誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生凋亡，而聯(lián)合用藥，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡作 用增強。
乳腺癌組織中Bcl-2免疫組化檢測結(jié)果
Bel-2蛋白表達于乳腺癌細胞漿，THT組、5-Fu組、THT+5-Fu組明顯低于對照組 (P〈0.05)'表明THT可抑制bcl-2基因的蛋白表達(表13)。
表13各組乳腺癌組織Bc卜2蛋白表達 Bel-2表達陰性對照 THT 5-Fu THT +5-Fu
一 1
+ 3 76 7
+ + 4 1 2
+ + + 1
實施例12: THT對親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞腫瘤轉(zhuǎn)移基因骨涎蛋白表達的抑制作用 1、實驗材料與方法
MDA-MB-231-BO細胞
DMEM培養(yǎng)液干粉，Gibco公司，胎牛血清。
設(shè)置對照組和THT處理組;對照組為含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)MDA-MB-231-BO細胞， THT處理組是在對照組的基礎(chǔ)上加入20mg/L的THT。其余操作相同。 免疫組化法檢測乳腺癌腫瘤細胞骨涎蛋白(BSP虔白的表達。制備MDA-MB-231-B0細胞爬片，采用常規(guī)免疫組化SP法檢測BSP的表達。待細胞在 載玻片上的融合度達到75 90%，用0. 01 mol/L的PBS沖洗玻片3次，10%甲醛固定30min。 0. 01 mol/L的PBS洗滌，3%的H202甲醇溶液室溫下孵育10 min， 0. 01 mol/L的PBS洗 滌，在蠟筆所畫的范圍內(nèi)滴一滴試劑B(正常非免疫動物血清)，室溫孵育10min，加經(jīng)1 : 200稀釋的50iil—抗(鼠抗hBSP)，室溫放置60 90min，對照組僅加抗體稀釋液，0.01 mol/L的PBS洗滌，滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(羊抗鼠IgG)，室溫孵育10 min， 0. 01 mol/L 的PBS洗滌，滴加1滴試劑D (鏈霉菌抗生素-過氧化物酶溶液)，室溫孵育10 min， 0. 01mol/L 的PBS洗滌，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗，乙醇梯度脫水，透明劑 處理2X10min，樹膠封片。顯微鏡下觀察，細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為BSP表達陽性。 2、實驗結(jié)果與討論
通過免疫組化法檢測BSP蛋白的表達，親骨轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB-231-B0 胞質(zhì)內(nèi)有棕色顆粒，表明MDA-MB-231-B0細胞表達BSP。而THT處理的細胞胞質(zhì)中均無棕 色顆粒，提示細胞BSP表達呈陰性。
骨涎蛋白(bonesialoprotein， BSP)是細胞外基質(zhì)中的一種酸性糖蛋白，主要分布在 礦質(zhì)化的組織中，由成骨細胞、破骨細胞以及軟骨細胞表達和分泌。已有研究報道乳腺癌 細胞中增加BSP的表達促進乳腺癌細胞骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。BSP陽性癌細胞脫離血循環(huán)進入骨 髓腔，黏附定位于骨礦質(zhì)化基質(zhì)的表面，BSP的RGD序列與aVP3結(jié)合，導(dǎo)致乳腺癌細 胞和骨小梁的黏附，活化破骨細胞產(chǎn)生溶骨性骨吸收，促進乳腺癌細胞的骨轉(zhuǎn)移進程。實 驗結(jié)果提示THT可抑制乳腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移。 實施例13: THT對人腸癌細胞及裸鼠移植瘤增殖抑制作用 1 、實驗方法
人結(jié)腸腺癌細胞系lovo細胞；THT。
細胞培養(yǎng)1ovo細胞以含10。/。滅活的新生牛血清、雙抗的1640培養(yǎng)基，在5%C02、 37°C、相對濕度95%條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞單層生長、當(dāng)瓶底細胞的覆蓋度達90%時，以 0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。以指數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。
在0—120yg/mlTHT濃度遞增時，多孔板培養(yǎng)lovo細胞，3個復(fù)孔，MTT法檢測細 胞活力，觀察THT對腫瘤細胞增殖抑制作用。
人結(jié)腸腺癌細胞裸鼠移植瘤的建立人結(jié)腸腺癌細胞株lovo在含10%新生牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代擴增，收集對數(shù)生長期細胞制備懸液。SPF環(huán)境下進行實驗 操作，腹背側(cè)部皮下注射含5X106癌細胞的懸液0.5ml，成瘤后用組織塊套管針法皮下移 植為實體瘤。將人結(jié)腸癌皮下移植的裸鼠隨機分為4組，每組8只，雌雄各半。(l)模型 組(陰性對照)，生理鹽水0.5ml/只灌胃；(2)THT組，以80mg/kg灌胃；(3)5-Fu組(陽 性對照)，以5-Fu30mg/kg腹腔注射；(4)THT-5-Fu組，以40mg/kg灌胃、并以5-Fu30mg/kg 腹腔注射；在移植后第6天開始給藥，5-Fu組給藥l次/d,共用6天后停藥，THT組給藥 l次/d，共6周，對照組給予生理鹽水。停藥后24h處死，剝離腫瘤塊稱重，觀察抗腫瘤 作用。2、實驗結(jié)果 (1) THT對腸癌細胞的抑制和凋亡作用
lovo細胞在THT終濃度為20、 40、 60、 80ug/ml時，細胞活力明顯下降且各濃度下 細胞活力與陰性對照組比較差異極顯著(p〈0. 01)(表14)。
AnnexinV-PI雙標(biāo)染色流式細胞儀分析THT對lovo細胞凋亡的影響不同濃度的THT 作用1ovo細胞72h后，細胞凋亡發(fā)生率明顯增高，隨THT濃度加大和作用時間延長，凋 亡率明顯增高，與對照組相比具有顯著差異性。
表14 THT對腸癌lovo細胞凋亡的影響(-x土s)
THT(iig/ml) 細胞抑制率(％) 細胞凋亡率(％)
10 1.7±0.3 1.0±0. 1
20 4.2±0.4 1.9±0.3
40 18.0±1.1 8. 1±0.4
80 46.5±0.5 29.9±0.7
89.5±1.1 50.3±0.8
THT誘導(dǎo)人腸癌lovo細胞具有明顯的藥物濃度依賴性,在同一時間段，隨藥物濃度的 增加細胞凋亡率增加，兩者呈正相關(guān)(P〈0. 01)。同一濃度不同時間段細胞的凋亡率逐漸增 加。120" g/m濃度THT作用72 h后的凋亡率達到了 48. 7%。 (2) THT對腸癌細胞裸鼠移植瘤增殖抑制作用
在光鏡下觀察腫瘤組織，對照組移植瘤細胞仍保持培養(yǎng)狀態(tài)下癌細胞原有的異型性， 形狀不規(guī)則，可見異常核分裂相。THT給藥組腫瘤細胞呈現(xiàn)不同程度退行性變，部分腫瘤 組織出現(xiàn)明顯壞死，表明THT對腸癌腫瘤細胞增殖顯著的抑制作用(表15)，聯(lián)合用藥提 高療效。
表15 THT對腸癌腫瘤增殖的抑制作用
處理組 動物數(shù) 瘤體重(g) 抑制率(％)
陰性對照 8 0.951 ±0.473 /
THT 8 0.293±0. 151* 69.1*
5-Fu 8 0.277 ±0.142* 70.8*
THT-5-Fu組 8 0.210±0. 122* 77.8
*P〈0.01，相對于陰性對照組。 實施例14: THT的抑菌作用觀察 1、材料 供試細菌
枯草芽孢桿菌(5aciWi;s s"Mj7j'5) 金黃色葡萄球菌(5"帥力y7ococc〃s ai/re"s) 沙門氏菌(5"aJy77cweJJs OoaW)
18月市炎雙球菌(尸/ e"/Bococc"50 大腸桿菌(￡scAer_r'c/L 'a ccJ/) 綠膿桿菌 (/^e〃ob/ o朋51 aer收i/305a)
普通培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，自來水(或蒸餾水)1000ml，調(diào) Ph7.2-7.4 (固體培養(yǎng)基另加2%的瓊脂)。用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、 沙門氏菌的培養(yǎng)。
加富培養(yǎng)基在普通培養(yǎng)基的無菌液體培養(yǎng)基中加5%的無菌小牛血清。用于培養(yǎng)肺 炎雙球菌。
2、 對幾種細菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定
取20ml三角瓶分別編組編號，除第1瓶外，每一瓶加入3ml培養(yǎng)液；第1瓶內(nèi)加入 含有THT培養(yǎng)液6ml，吸取3ml加到第2瓶內(nèi)，充分混勻后，吸出3ml到第3管，依次遞 增稀釋到第6瓶，第6管充分混勻后吸出3ml混合液棄去。每一瓶內(nèi)分別加入菌懸液50 Ul (菌液濃度為106-10'個/ml)，搖勻后置37。C搖床培養(yǎng)24h，取出觀察結(jié)果。陽性對照 和陰性對照設(shè)置一瓶培養(yǎng)。從細菌生長少(培養(yǎng)不渾濁)各瓶，繼續(xù)培養(yǎng)一天后，取培養(yǎng) 菌液涂布瓊脂平板培養(yǎng)基，經(jīng)37'C培養(yǎng)后觀察有無生長加以判斷。以能抑制細菌生長的 THT最高稀釋度為最低抑菌濃度(MIC),以仍沒有菌生長的THT最大稀釋度為最低殺菌濃 度(MBC)
3、 測定結(jié)果
THT對幾種細菌均有抗菌作用(表16),最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定結(jié)果表 明THT對這些細菌均有殺菌能力。
表16 THT對幾種細菌均有抗菌作用
細菌MIC (mg/ml)MBC(mg/ml)
枯草芽孢桿菌1.01. 0
金黃色葡萄球菌0. 500. 50
沙門氏菌1.02.0
大腸桿菌0. 501.0
綠膿桿菌0. 500. 50
肺炎雙球菌0.501.0
實施例15: THT對小鼠CC14慢性損傷肝炎的治療作用 1、材料和方法
動物18-22g雌性BALB/C小鼠，隨機分組。禁食6小時后，按0. 5ml/kg體重腹腔 注射CCl4 (10%石蠟油溶液)，每周二次，共八次。
實驗分為三組，THT組按120mg/kg體重每日灌胃，正常對照組及損傷對照組給與相 應(yīng)的生理鹽水。最后一次給藥第三天殺鼠，取血測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和血清白蛋白 (g/L)。同時取肝大葉相同部位的一小塊肝組織，用10%福爾馬林固定后，做病理切片
19檢查。
2、實驗結(jié)果
CC14染毒組，肝小葉周圍炎性細胞浸潤明顯，可見纖維組織增生，小葉中心大部肝 細胞壞死明顯，部分肝細胞脂肪變，空泡樣變明顯THT治療組的肝組織學(xué)改變與CC14
染毒組有明顯不同，多數(shù)視野未見肝纖維組織增生和明顯肝細胞壞死，炎性細胞浸潤及脂
肪樣變性較輕。血清酶學(xué)及血清白蛋白檢査結(jié)果(表17)，表明THT對CCV漫性損傷小 鼠有顯著的保護作用。
表17 THT對CCV漫性損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶和血清白蛋白的影響(x±s，n=10)
處理 ALT (U/100ml) 血清白蛋白(g/L)
正常對照組 29. 7土2. 03 48. 53土6. 33
CCl4組 105.95土8.36 33.22土4.31
CC14 +THT 37. 54土5. 16** 42. 85土5. 78林
**P〈0.01與CCU組比較。
CCl4進入體內(nèi)后，經(jīng)肝臟細胞色素P450激活，聲稱三氯甲基自由基(CC1")，通 過氫的吸附而攻擊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的磷脂分子，引起膜的脂質(zhì)過氧化，CClr繼而與膜脂質(zhì)和 蛋白質(zhì)大分子進行共價結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的破壞，CC13 還可抑制細胞膜和 微粒體膜上鈣離子泵的活性，使鈣離子內(nèi)流增加，從而引起細胞中毒死亡。THT可以改善 慢性肝損害肝組織空泡樣變性、肝脂肪化和纖維化的形態(tài)學(xué)改變，明顯降低血清中肝轉(zhuǎn)氨 酶和提升血清中白蛋白的含量，保護肝功能。 實施例16: THT片劑的制備
片劑配方THT30-80%，藥用淀粉2 —10%，乳糖10%—60%，阿斯巴甜0.2-1%、 硬脂酸鎂0.5-1%
將100目過篩的THT1000g和乳糖1000g干粉混合，過80目篩2-3次；加適量的蒸餾 水，將藥用淀粉60g加熱糊化后、噴灑入混合干粉中，并不斷攪拌均勻，制粒，過16目 篩后烘干；按照干粒重量加入IOO目過篩的阿斯巴甜0.5%和硬脂酸鎂0.5%，混勻，壓 片。片硬度為0. 9-1. 2kg，片重為0.5-1.0g/片。 實施例17: THT膠囊的制備
膠囊劑配方THT30-80%，藥用淀粉5 — 30%，乳糖0%—60%，硬脂酸鎂0.5-1% 將THT1000g、藥用淀粉100g、乳糖200g的干粉混合，過80目篩2-3次；加適量的 蒸餾水，將適量藥用淀粉加熱糊化后、噴灑入混合干粉中，攪拌均勻，制粒，過16-24 目篩后烘干；按照干粒重量加入硬脂酸鎂0.5%，混勻。填充膠囊，粒重0.25-0.75g/粒。 實施例18: THT貼劑的制備
將生橡膠100g切成條狀，用壓膠機壓成網(wǎng)狀膠片，去靜電、放冷，浸入汽油中約24 小時，使其充分溶脹，再移入配料鍋內(nèi)攪拌約3小時，依次加入松香80g、氧化鋅80g、 羊毛脂15g、凡士林15g、液體石蠟10g，混勻，加入THT100g，攪勻，經(jīng)80目銅絲篩網(wǎng) 濾過，進行涂膏，切段，蓋襯，切塊，制成1000貼，即得THT貼劑。
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權(quán)利要求
1、顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述化療為細胞毒類藥物化療。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述細胞毒類化療藥物為作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物、作用于核酸轉(zhuǎn)運 的藥物、拓撲異構(gòu)酶I抑制藥或作用于微管蛋白的藥物。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述作用于核酸合成的藥物為氟尿嘧啶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述作用于微管蛋白的藥物為長春新堿或紫杉醇。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物為環(huán)磷酰胺、絲裂霉素或順鉑。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述防治腫瘤放化療不良反應(yīng)為骨髓抑制、血細胞降低、細胞突變、脫 發(fā)或繼發(fā)性腫瘤。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤放化療不良反應(yīng)為乳腺癌、宮頸癌或腸癌放化療不良反應(yīng)，顯 齒蛇葡萄總黃酮與化療藥物聯(lián)合用藥，提高腫瘤治療療效。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述顯齒蛇葡萄總黃酮與化療藥物聯(lián)合用藥是指用藥學(xué)上可接受的輔料 制備的貼劑、軟膏劑、凝膠劑、軟膠囊劑或栓劑。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治放化療藥物不良反應(yīng)藥物的 應(yīng)用，其特征在于所述藥物為用藥學(xué)上可接受的輔料制備的口服固體制劑、口服液體制劑、 注射液、凍干粉針劑或大輸液劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了顯齒蛇葡萄總黃酮在制備防治腫瘤放化療不良反應(yīng)的藥物的應(yīng)用。具體用于制備防治腫瘤放療與化療中的不良反應(yīng)、防治骨髓抑制、脫發(fā)、抗突變與防治繼發(fā)性腫瘤的發(fā)生和防治腫瘤轉(zhuǎn)移，作為防治乳腺癌、宮頸癌和腸癌等藥物。該應(yīng)用是基于本發(fā)明創(chuàng)造性發(fā)現(xiàn)顯齒蛇葡萄總黃酮清除自由基、抑制自由基反應(yīng)鏈、THT抗突變和抑制腫瘤基因表達和引發(fā)腫瘤細胞凋亡而防治腫瘤發(fā)生、防治繼發(fā)性腫瘤及轉(zhuǎn)移以及THT抑制病毒轉(zhuǎn)染而防治感染，實現(xiàn)預(yù)防、控制或消除化學(xué)藥物和輻射對組織細胞和器官的傷害或毒害。
文檔編號A61K36/185GK101485791SQ20091003715
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日
發(fā)明者張曉元, 勇 郭 申請人:華南理工大學(xué)