專利名稱：一種表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種角膜修復(fù)材料的制備方法，具體涉及一種表面功能化殼聚糖角膜修復(fù) 材料的制備方法。
背景技術(shù)：
角膜病是當(dāng)今世界上最主要的可逆性、致盲性眼病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)角膜 病是繼白內(nèi)障之后全球第二大致盲眼病，當(dāng)今世界上眼睛失明的病人中有近1/3是由角膜
疾病引起。我國是角膜病的高發(fā)國家，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國因角膜病致盲人數(shù)約有400多
萬，占各類致盲性眼病第二位。但大部分角膜盲可通過手術(shù)治療，其中角膜移植是角膜盲 復(fù)明的重要的治療手段之一。但是角膜移植手術(shù)面臨的主要問題是供體材料來源嚴(yán)重匱乏。 同種異體角膜供體的來源缺乏，限制該技術(shù)的臨床應(yīng)用，人工角膜技術(shù)的發(fā)展為該技術(shù)帶 來了新的希望，而角膜材料的性能對角膜移植手術(shù)的成功與否具有非常重要的影響。
傳統(tǒng)的人工角膜材料生物相容性差，細(xì)胞難以真正黏附、增殖，營養(yǎng)和代謝物質(zhì)不能 及時(shí)交換，以及支架與光柱、支架與眼組織的結(jié)合部位界面問題復(fù)雜，炎癥的發(fā)生率高。 目前用組織工程技術(shù)構(gòu)建角膜已成為眼科學(xué)界研究的熱點(diǎn)。先將角膜細(xì)胞在三維角膜支架 上體外培養(yǎng)，然后植入眼內(nèi)，細(xì)胞分化成為新的角膜組織的同時(shí)，支架也剛好降解完全。 故其尋求的角膜材料不僅要有適宜的力學(xué)強(qiáng)度和良好的生物相容性，更要有較好的光學(xué)性 能和降解性，且降解產(chǎn)物對人體無毒，無刺激性，降解速率要與人角膜組織生長速率相匹 配，還要有適宜的吸水率、親水性等性能。尋找適宜力學(xué)強(qiáng)度和親水性、良好的光學(xué)性能 和生物相容性的角膜修復(fù)材料是待解決的重點(diǎn)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的 制備方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)和材料的不足。
一種表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將殼聚糖溶于乙酸水溶液，殼聚糖與乙酸溶液的重量體積比為20mg/mL;
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液注入模具室溫下自然風(fēng)干；
(3) 在步驟(2)的模具中加入堿溶液使其浸泡膜30分鐘后揭膜，將膜放入去離子水 中浸泡2 4小時(shí)；
(4) 將步驟(3)所得的膜室溫下自然風(fēng)干；
(5) 將步驟(4)所得的膜分別浸泡于生物大分子溶液或生物活性短肽溶液中，加入 交聯(lián)劑交聯(lián)處理；交聯(lián)反應(yīng)溫度為4 35°C，反應(yīng)12 48h;
(6) 將步驟(5)所得的產(chǎn)品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
3步驟(1)所述的乙酸水溶液濃度為l% 3%Wt。
步驟(3)所述的堿溶液為濃度為2X 5Xwt的氫氧化鈉溶液或氨水。
步驟(5)所述的生物大分子溶液為明膠溶液或者透明質(zhì)酸溶液，所述的生物活性短肽 為精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(RGDs)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸或精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸-纈氨酸。
步驟(5)所述的明膠溶液的濃度為0. 5% 5%wt,透明質(zhì)酸溶液濃度為0.1% 0. 5%wt, 生物活性短肽溶液的濃度為0. 01% 0. l%wt。
步驟(5)所述的交聯(lián)劑為1-乙基_3- (3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基 琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液，混合溶液濃度為0. 5%wt。
步驟(5)所述的交聯(lián)劑中EDC的用量與生物大分子或生物活性短肽質(zhì)量比為1 : 6。 具體質(zhì)量比為明膠EDC=6 : 1，透明質(zhì)酸EDC=6 : 1， RGDs短肽EDC二6 : 1。
步驟(6)用去離子水沖洗3 5次。
本發(fā)明方法制備的表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的透光率高于95%，親水性較殼聚 糖的有所改善，具有良好的細(xì)胞相容性和生物相容性。
以上所得的制品殼聚糖膜記為CS,經(jīng)明膠溶液、透明質(zhì)酸溶液或RGDs短肽處理的 殼聚糖膜分別標(biāo)記為CS-GEL， CS-HYA， CS-RGDs。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)
(1) 本發(fā)明的角膜修復(fù)材料是通過表面功能化方法在殼聚糖表面固定生物大分子和生 物活性短肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸(RGDs)短肽，在保證殼聚糖較好的力學(xué)性能 和優(yōu)異的光學(xué)性能的同時(shí)，改善其生物活性和生物相容性。
(2) 本發(fā)明的角膜修復(fù)材料的透光率高于95% (人眼角膜為95% 98%)，人角膜上 皮細(xì)胞能在上面的生長增殖情況良好。
(3) 本發(fā)明采用的原材料取材廣泛，價(jià)格低廉，成型工藝簡單，成本低，有利于大規(guī) 模生產(chǎn)。


圖1為實(shí)施例1， 4制備的表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的表面X射線光電子能譜圖2為實(shí)施例1制備的表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的接觸角隨時(shí)間變化曲線； 圖3為實(shí)施例4制備的表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的接觸角隨時(shí)間變化曲線； 圖4為實(shí)施例1， 4表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的透光率；
圖5為人角膜緣上皮細(xì)胞在純殼聚糖膜表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖6為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例1表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖7為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例2表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖8為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例3表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖9為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例4表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖10為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例5表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖11為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例6表面生長72小時(shí)的光鏡照片；圖12為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例7表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖13為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例8表面生長72小時(shí)的光鏡照片； 圖14為人角膜緣上皮細(xì)胞在實(shí)施例9表面生長72小時(shí)的光鏡照片。
具體實(shí)施方式
-
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但需指出的是以下實(shí)施例不能理解為對本發(fā)
明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容對本發(fā)明作出的一些非本質(zhì)
的改進(jìn)和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例l
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入2^wt的氫氧化鈉溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分鐘后揭膜，去離子水沖洗浸泡2小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在l%wt的明膠溶液中，加入0.5Xwt的交聯(lián)劑交 聯(lián)處理，使明膠與EDC的質(zhì)量比=6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為35°C， 反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。 本實(shí)施例制備的表面功能化殼聚糖膜的XPS分析表面元素及其元素含量見表1。
表l
MaterialsC (%)N (%)0 (%)0/CN/C
CS70. 576. 5322. 900. 320. 09
CS-GEL72.7513.0614. 190.200.18
CS-HYA70. 544.9124. 550. 350.07
CS-RGDs64. 529. 6725.810. 400. 15
圖1是本實(shí)施例制備的表面功能化殼聚糖膜的XPS譜圖；從圖1和表1可以看出實(shí)施 例l制備的表面功能化殼聚糖膜的表面的氮元素含量增加，氧元素含量降低。圖2是本實(shí)
施例的表面功能化殼聚糖膜的接觸角。圖4是透光率曲線，圖6是人角膜緣上皮細(xì)胞在本 實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片。
采用英國Kratos公司的X射線光電子能譜儀測試角膜修復(fù)材料表面元素含量。
采用德國Dataphysics公司的0CA15型表面接觸角測定儀測試未含水角膜修復(fù)材料在 滴水100s時(shí)的接觸角大小。
采用UNICO上海儀器有限公司的UV-3802型紫外可見分光光度計(jì)，測試了吸水平衡后 的表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料在不同波長的可見光條件下的透光率情況。
采用德國Leica公司的LEICA DM IRB相差顯微鏡觀察細(xì)胞在膜上的生長情況。 實(shí)施例2
5表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml 3%wt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入5Xwt的氨水溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30分鐘
后揭膜，去離子水沖洗浸泡3小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在5。/。wt的明膠溶液中，加入0.5^wt的交聯(lián)劑交 聯(lián)處理，使明膠與EDC的質(zhì)量比=6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為25°C， 反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
圖7是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片。 實(shí)施例3
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟-
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ral 2%wt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入5Xwt的氫氧化鈉溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分鐘后揭膜，去離子水沖洗浸泡4小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在0. 5%wt的明膠溶液中，加入0. 5%wt的交聯(lián)劑 交聯(lián)處理，使明膠與EDC的質(zhì)量比^6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為25。C， 反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
圖8是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片。 實(shí)施例4
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入3Xwt的氫氧化鈉溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分鐘后揭膜，去離子水沖洗浸泡2小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在0.5%的透明質(zhì)酸溶液中，加入0.5^wt的交聯(lián) 劑交聯(lián)處理，使透明質(zhì)酸與EDC的質(zhì)量比-6 : 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為 4。C，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。 本實(shí)施例制備的表面功能化殼聚糖膜的XPS分析表面元素及其元素含量見表1。圖1
是本實(shí)施例制備的表面功能化殼聚糖膜的XPS譜圖；從圖1和表1可以看出實(shí)施例2制備 的表面功能化殼聚糖膜的表面的氮元素含量降低，氧元素含量增加。圖3是本實(shí)施例的表 面功能化殼聚糖膜的接觸角。圖4是透光率曲線，圖9是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材 料表面生長72小時(shí)的光鏡照片，如圖9所示人角膜緣上皮細(xì)胞的粘附和增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了該表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料具有良好的生物活性和生物相容性。 實(shí)施例5
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入2^wt的氨水溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30分鐘
后揭膜，去離子水沖洗浸泡4小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在O. 1%的透明質(zhì)酸溶液中，加入0.5。/^vt的交聯(lián) 劑交聯(lián)處理，使透明質(zhì)酸與EDC的質(zhì)量比6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為 25°C，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
圖10是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片。 實(shí)施例6 -
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml 2Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入5Xwt的氫氧化鈉溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分鐘后揭膜，去離子水沖洗浸泡2小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在0.3%的透明質(zhì)酸溶液中，加入0.5。/。wt的交聯(lián) 劑交聯(lián)處理，使透明質(zhì)酸與EDC的質(zhì)量比^6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為 4'C，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
圖11是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片。 實(shí)施例7 .
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml l%wt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入5^wt的氫氧化鈉溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分鐘后揭膜，去離子水沖洗浸泡2小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在0. 1%的RGDs短肽溶液中，加入0.5%wt的交 聯(lián)劑交聯(lián)處理，使RGDs與EDC質(zhì)量比^6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為4 °C，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。 本實(shí)施例制備的表面功能化殼聚糖膜的XPS分析表面元素及其元素含量見表1。從表1
可以看出實(shí)施例3制備的表面功能化殼聚糖膜的表面的氮元素含量和氧元素含量都增加。 圖12是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片，如圖12所示人角
7膜緣上皮細(xì)胞的粘附和增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了該表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料具有良好的
生物活性和生物相容性。
實(shí)施例8
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml 2Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入5^wt的氫氧化鈉溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分鐘后揭膜，去離子水沖洗浸泡2小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在0.05y。的RGDs短肽溶液中，加入0.5^wt的交 聯(lián)劑交聯(lián)處理，使RGDs與EDC的質(zhì)量比二6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為 25°C，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)；
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
圖13是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片。 實(shí)施例9
表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，包括如下步驟
(1) 將0. 4g殼聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液除去氣泡，注入模具中室溫下風(fēng)干成膜；
(3) 在步驟(2)的模具中加入5^wt的氨水溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30分鐘 后揭膜，去離子水沖洗浸泡4小時(shí)；
(4) 將步驟(3)得到的膜完全浸泡在O.OP/。的RGDs短肽溶液中，加入0.5Xwt的交 聯(lián)劑交聯(lián)處理，使RGDs:EDC二6: 1。攪拌，使交聯(lián)劑均勻分散，反應(yīng)溫度為4。C，反應(yīng) 時(shí)間為48小時(shí)； '
(5) 將步驟(4)的制品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
圖14是人角膜緣上皮細(xì)胞在本實(shí)施例材料表面生長72小時(shí)的光鏡照片。
權(quán)利要求
1、一種表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)將殼聚糖溶于乙酸水溶液，殼聚糖與乙酸溶液的重量體積比為20mg/mL；(2)將步驟(1)的殼聚糖乙酸水溶液注入模具室溫下自然風(fēng)干；(3)在步驟(2)的模具中加入堿溶液使其浸泡膜30分鐘后揭膜，將膜放入去離子水中浸泡2～4小時(shí)；(4)將步驟(3)所得的膜室溫下自然風(fēng)干；(5)將步驟(4)所得的膜分別浸泡于生物大分子溶液或生物活性短肽溶液中，加入交聯(lián)劑交聯(lián)處理；交聯(lián)反應(yīng)溫度為4～35℃，反應(yīng)12～48h；(6)將步驟(5)所得的產(chǎn)品，用去離子水沖洗，室溫下自然風(fēng)干。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的乙酸水溶液濃度為 l% 3%wt。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的堿溶液為氫氧化鈉 溶液或氨水，濃度為2X 5Xwt。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)所述的生物大分子溶液為 明膠溶液或者透明質(zhì)酸溶液，所述的生物活性短肽包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氮酸、 甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-纈氨酸。所述的明膠溶液的濃度為0.5%~5%^，透明質(zhì)酸溶液濃度為0.1% 0.5°/柳1:，生物活性 短肽溶液的濃度為0. 01% 0. l%wt。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(6)所述去離子水沖洗的次數(shù) 為3 5次。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)所述的交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液，混合溶液濃度為0. 5%wt。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑中l(wèi)-乙基-3- (3-二甲 基氨丙基)碳二亞胺的用量與生物大分子或生物活性短肽質(zhì)量比為1 : 6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料及其制備方法。該方法包括如下步驟殼聚糖溶于酸溶液，將殼聚糖溶液注入模具中風(fēng)干，用堿溶液處理后干燥得到殼聚糖膜。殼聚糖膜表面采用化學(xué)交聯(lián)法固定生物大分子及短肽。這種表面功能化殼聚糖膜的接觸角明顯下降，親水性改善；制備的表面功能化殼聚糖角膜修復(fù)材料的透光率高于95％，具有良好的細(xì)胞相容性和生物相容性，可用于醫(yī)療領(lǐng)域中作為角膜損傷的修復(fù)，其制備工藝簡單，設(shè)備簡易，原料價(jià)廉易得，具有良好的應(yīng)用前景和科學(xué)價(jià)值。
文檔編號A61L27/00GK101480505SQ200910036949
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月23日
發(fā)明者力 任, 王迎軍, 麗 郭 申請人:華南理工大學(xué)