專利名稱：：野生仙人掌多糖提取物的制備及高效降血清膽固醇的作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種野生仙人掌多糖提取物的制備及高效降血清膽固醇的作用，特別涉及一種能顯著降低高脂血癥血清總膽固醇含量的野生仙人掌多糖提取物及其降血清膽固醇的作用機(jī)制。
背景技術(shù)：
：根據(jù)2002年中國(guó)居民健康和營(yíng)養(yǎng)調(diào)査的結(jié)果，中國(guó)高血脂的人數(shù)己達(dá)1.6億，其中高膽固醇的危害性最大。目前對(duì)于高膽固醇血癥的治療分為兩個(gè)階段生活方式的改變及藥物治療。生活方式的改變包括飲食治療、增加體力活動(dòng)、戒煙、消除過(guò)度精祌緊張、超重者減輕體重。經(jīng)過(guò)飲食治療等生活方式改善后，患者仍存在血脂異?，F(xiàn)象，則應(yīng)根據(jù)冠心病及與冠心病等同危險(xiǎn)的疾病的有無(wú)進(jìn)行藥物治療。目前臨床應(yīng)用的降膽固醇藥物分為六大類(1)3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶抑制劑，即他汀類藥物。常用藥物有辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀等。這類藥物是目前臨床應(yīng)用最廣泛、最重要的降膽固醇藥物。此類藥物降脂效果較好，能有效的降低體內(nèi)的總膽固醇和低密度脂蛋白。但在治療的同時(shí)，伴有一定的副作用，會(huì)出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)、皮疹，嚴(yán)重時(shí)可能出現(xiàn)肝功能異常、肌痛等，停藥后會(huì)有好轉(zhuǎn)。(2)苯氧芳酸類，也稱貝特類。常用藥物有氯貝特、苯扎貝特等，不良反應(yīng)為消化道癥狀，可能會(huì)出現(xiàn)肝功能異常及肌肉損傷。他能增加脂蛋白酯酶的活性，加快代謝速度，有效降低血總甘油三脂及膽固醇水平，并可升高高密度脂蛋白水平。(3)煙酸及其衍生物，常用藥物有煙酸、煙酸肌醇酯、阿西莫司(氧甲吡嗪)，可使血漿中游離脂肪酸濃度下降，并能有效治療脂肪肝。此類藥物是目前治療高脂血癥最有效的一種，但副作用最為明顯，易出現(xiàn)面部潮紅、皮膚瘙癢、胃部不適等不良反應(yīng)。(4)膽酸螯合劑，常用藥物有考來(lái)烯胺(消膽胺)、考來(lái)替泊(降膽寧)。它只能防止膽酸或膽固醇從腸道吸收，從而促進(jìn)其排出，以降低膽固醇，降血脂效果較差，還容易出現(xiàn)無(wú)味覺(jué)、消化道癥狀等不良反應(yīng)。(5)魚(yú)油制劑，Omega-3脂肪酸，能輕度降低總甘油三脂(TG)，效果較差。(6)中藥治療，絞股藍(lán)、人參莖葉皂苷、山楂提取物、姜黃素、葛根、回心草、枸杞、海藻、大黃、黃芪多糖、老山云芝多糖、槐耳多糖等都具有較好的降低血脂和改善脂代謝紊亂的作用，并且無(wú)明顯的不良反應(yīng)。臨床研究表明，以經(jīng)方硝礬石散為主組成的硝礬降脂顆粒(硝石、礬石、酒水蛭、川穹、益母草、山楂、澤瀉、茯苓、首烏等藥組成)具有明顯降低總膽固醇、總甘油三脂、低密度脂蛋白及升高高密度脂蛋白的作用，與辛伐他汀比較，在提高血清高密度脂蛋白方面，優(yōu)勢(shì)明顯。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有的化學(xué)藥物治療副作用大、療效較差等不足，本發(fā)明提供一種從天然植物野生仙人掌中提取的多糖，發(fā)現(xiàn)該多糖具有很好的降低血清總膽固醇含量和改善脂代謝紊亂的作用，無(wú)明顯的不良反應(yīng)。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種野生仙人掌多糖提取物的制備方法，包括如下步驟(1)取新鮮仙人掌科植物野生仙人掌(OpimtiadilleniiHaw.),除刺去皮后用清水洗凈，切碎、勻漿，用80%的乙醇室溫浸泡5次，浸泡時(shí)間為12h，除去脂溶性物質(zhì)，殘?jiān)?(TC烘干、粉碎，過(guò)200目篩得仙人掌粉末；(2)按料液比1:30取仙人掌粉末加一定量的蒸餾水，加入0.5~1.0%果膠酶，溫度為35~45°C，pH3.0~4.0，浸提時(shí)間為1.0~2.0h，合并水提取液，離心得水提液，減壓濃縮；(3)加入35倍體積95%乙醇(4'C預(yù)冷)，靜置12h，產(chǎn)生大量白色沉淀，離心收集沉淀，沉淀再用蒸餾水溶解，備用；(4)將蒸餾水溶解液離心去沉淀，濃縮到約原液體積1/2，-20^~室溫反復(fù)5次凍融、離心，除去蛋白；(5)蒸餾水透析(截留分子量為3500Da)12h，收集透析袋內(nèi)溶液，離心，棄去沉淀；(6)將離心出來(lái)的溶液濃縮，經(jīng)凍干即得仙人掌多糖干粉。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法制備的野生仙人掌多糖提取物的成份多糖和少量蛋白質(zhì)，不含有淀粉、生物堿、甾體類物質(zhì)(見(jiàn)附表1)。其中還原糖含量為3.018.0%;多糖的含量為55.080.0%;蛋白質(zhì)含量為1.018.0%;核酸含量為5.018.0%。仙人掌多糖提取物降膽固醇作用體現(xiàn)在(1)明顯改善高脂血癥大鼠體重、攝食、飲水情況，見(jiàn)附圖2-4;(2)明顯改善血清中生化指標(biāo)明顯降低總膽固醇含量，與脂必妥組無(wú)顯著性差異，低、中、高劑量組分別降低了32.37°/。、57.97°/。、78.73%;明顯升高高密度脂蛋白含量，降低低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量和動(dòng)脈硬化指數(shù)，低、中、高劑量組的高密度脂蛋白含量分別升高了3.70%、11.11%、35.18%,低密度脂蛋白含量分別降低了2.91%、18.52%、32.80°/。，有明顯的劑量依賴性，見(jiàn)附表2、4;(3)對(duì)脂肪肝具有一定的療效顯著降低肝體比值；低、中、高三個(gè)劑量組大鼠肝臟中總膽固醇含量分別下降了8.51%、49.01%、64.90%;總甘油三脂含量分別下降了7.6%、33.84%、62.13%，見(jiàn)附表5-6，附圖5-6。本發(fā)明具有的有益效果是本發(fā)明的取材方便，提取工藝簡(jiǎn)單，且在治療高脂血癥血脂異常方面具有高效、低毒、療效明確的特點(diǎn)，同時(shí)能加強(qiáng)豐富的野生仙人掌資源的開(kāi)發(fā)和利用。本發(fā)明的仙人掌多糖降膽固醇的作用，其機(jī)制是(1)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶酶是體內(nèi)脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一，它主要參與高密度脂蛋白的成熟過(guò)程和總膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，所以此酶活性的下降可導(dǎo)致高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化。因此，仙人掌多糖通過(guò)提高卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性(戶<0.01)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)。其中低、中、高劑量組對(duì)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性分別增高了34.93%，39.08%，88.41°/。，并且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組(脂必妥治療組)(見(jiàn)附表3)。(2)肝3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶是膽固醇合成的主要限速酶，此酶活性的升高，肝臟內(nèi)膽固醇合成量也隨之增高。給予仙人掌多糖后肝3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶活性明顯降低(尸<0.05)，從而減少了肝臟中膽固醇的合成量，調(diào)節(jié)了脂代謝并對(duì)脂肪肝起到了很好的保護(hù)作用(見(jiàn)附表7)。仙人掌多糖提取物，其作用是(1)明顯改善高脂血癥大鼠體重、攝食、飲水情況(P<0.05)(見(jiàn)附圖2-4)。(2)明顯改善血清中生化指標(biāo)明顯降低總膽固醇含量，與脂必妥組無(wú)顯著性差異。低、中、高劑量組分別降低了32.37%、57.97°/。、78.73%(P<0.01);明顯升高高密度脂蛋白含量(P<0.01)，降低低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量和AI(P<0.01)。低、中、高劑量組的高密度脂蛋白含量分別升高了3.70%、11.11%、35.18%，同時(shí)低密度脂蛋白含量分別降低了2.91%、18.52%、32.80%，有明顯的劑量依賴性(見(jiàn)附表2、4)。(3)對(duì)脂肪肝具有一定的療效顯著降低肝體比值(PO.05);低、中、高三個(gè)劑量組大鼠肝臟中總膽固醇含量分別下降了8.51°/。，49.01%,64.90%(PO.01);總甘油三脂含量分別下降了7.6%,33.84°/。，62.13%(P<0.01)(見(jiàn)附表5-6，附圖5-6)。本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在后面進(jìn)行詳盡地描述，通過(guò)后面詳盡地描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的及優(yōu)勢(shì)會(huì)更加明顯地表達(dá)出來(lái)。圖1為仙人掌水溶性粗多糖提取流程圖2為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠每周體重的影響；A:造模前；B:造模后；C:給藥第一周；D:給藥第二周；E:給藥第三周；F:給藥第四周(注與正常組比較*尸<0.05，與模型組比較VO.05);圖3為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠每日飲水量的影響；A:給藥第一周；B:給藥第二周；C:給藥第三周；D:給藥第四周(注與模型組比較*尸<0.05，各組前后兩周的比較&PO.05);圖4為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠每日攝食量的影響；A:給藥第一周；B:給藥第二周；C:給藥第三周；D:給藥第四周(注與模型組比較*尸<0.05，各組前后兩周的比較&尸<0.05);圖5為實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟大體情況；A、B正常對(duì)照組；C、D模型對(duì)照組；E仙人掌多糖中劑量組；F仙人掌多糖高劑量組；圖6為實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織形態(tài)檢查；A正常組大鼠肝組織形態(tài)檢査(HE染色xl00);B模型組大鼠肝組織形態(tài)檢查(HE染色xl00);C模型組大鼠肝組織形態(tài)檢査(HE染色x200);D模型組大鼠肝組織形態(tài)檢査(HE染色x200);E仙人掌多糖中劑量組大鼠肝組織形態(tài)檢查(HE染色X100);F仙人掌多糖高劑量組大鼠肝組織形態(tài)檢査(HE染色X100)。附表1為仙人掌多糖成分鑒定表；附表2為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠血清總膽固醇、總甘油三脂含量的影響(n=10，X±S);附表3為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠血清中血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的影響(n=10，x±s);附表4為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠血脂蛋白含量的影響(n=10，x±s);附表5為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠肝體比值的影響(n=10，x±s);附表6為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠肝脂質(zhì)的影響(n=10，x±s);附表7為仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠肝3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性的影響0=10，x±s)。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳述，可以理解的是，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例A.仙人掌水溶性多糖的提取取新鮮仙人掌，除刺去皮后用清水洗凈，切碎、勻漿，用80%的乙醇室溫浸泡5次，浸泡時(shí)間為12h,除去脂溶性物質(zhì)，殘?jiān)?0°C烘干、粉碎，過(guò)200目篩得仙人掌粉末。取一定量仙人掌粉末(料液比1:30)加入IOOOmL蒸餾水，勻漿，加入0.7%果膠酶，溫度40'C，pH3.5，浸提1.5h后離心，合并上清，減壓濃縮。加入4倍體積95%乙醇(4'C預(yù)冷)，靜置12h，產(chǎn)生大量白色沉淀，離心收集沉淀，再用蒸餾水溶解。濃縮到約原液體積1/2，-2(TC室溫反復(fù)5次凍融、離心，除蛋白。蒸餾水透析(截留分子量為3500Da)12h，收集透析袋內(nèi)溶液，離心，棄沉淀，上清液經(jīng)冷凍干燥即得仙人掌多糖。B.高脂血癥模型的建立高脂血癥大鼠模型的建立雄性SD大鼠，分籠，標(biāo)記，稱重，喂飼高脂乳劑10d后，禁食8h尾部采血測(cè)血脂(總膽固醇和總甘油三脂)，總膽固醇〉6mmol丄"，總甘油三脂〉3mmoH;1)即確定為高脂血癥動(dòng)物模型。C.給藥與分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組，高脂模型對(duì)照組，藥物對(duì)照組(脂必妥組)和仙人掌多糖低、中、高劑量組(劑量分別為100、200、400mg'kg".cT1)，每組10只。期間自由飲水和攝食，實(shí)驗(yàn)期為四周。每天記錄大鼠的飲水量和進(jìn)食量，每周記錄大鼠體重，進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)。D.仙人掌多糖低、中、高劑量灌胃高脂血癥大鼠各指標(biāo)檢測(cè)四周后，通過(guò)與正常大鼠及經(jīng)脂必妥治療的高脂血癥大鼠比較飲水量、進(jìn)食量、體重；血清的總膽固醇含量、甘油三脂含量、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性；血脂蛋白含量；肝臟的肝體比重、總膽固醇含量、甘油三脂含量、3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性進(jìn)行比較，并對(duì)肝臟進(jìn)行了肉眼觀察及組織病理學(xué)檢測(cè)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下一、材料與方法(一)仙人掌水溶性多糖的提取(附圖1)1.取新鮮仙人掌科植物野生仙人掌，除刺去皮后用清水洗凈，切碎、勻漿，用80%的乙醇室溫浸泡5次，浸泡時(shí)間為12h，除去脂溶性物質(zhì)，殘?jiān)?0"烘干、粉碎，過(guò)200目篩得仙人掌粉末。2.取33.33g的仙人掌粉末，按料加lOOOmL的蒸餾水(料液比1:30)，勻漿，加入0.7°/0果膠酶，溫度40。C，pH3.5，浸提1.5h后離心，合并上清，減壓濃縮至300~350mL。3.加入4倍體積95%乙醇(4'C預(yù)冷)，靜置12h,產(chǎn)生大量白色沉淀，離心收集沉淀，再用蒸餾水溶解。4.離心去沉淀，濃縮到約原液體積1/2，-20卩~室溫反復(fù)5次凍融、離心，除蛋白。5.蒸餾水透析(截留分子量為3500Da)12h，收集透析袋內(nèi)溶液，離心，棄沉淀。6.上清液經(jīng)冷凍干燥，得仙人掌多糖干粉3.49g。(二)動(dòng)物分組及給藥方法高脂血癥大鼠模型的建立雄性SD大鼠，分籠，標(biāo)記，稱重，喂飼高脂乳劑10d后，禁食8h，尾部采血測(cè)血脂(總膽固醇和總甘油三脂)，總膽固醇>6mmol'I/1，總甘油三脂>Smmol*!/1)即確定為高脂血癥動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)大鼠的分組情況<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>給藥與分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組，高脂模型對(duì)照組，藥物對(duì)照組(脂必妥組)和仙人掌多糖低、中、高劑量組(劑量分別為100、200、400mg'kg".d—1)，每組10只(附表l)。期間自由飲水和攝食，實(shí)驗(yàn)期為四周。每天記錄大鼠的飲水量和進(jìn)食量，每周記錄大鼠體重，進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)。(三)取樣及樣品制備第一周、第二周末，所有動(dòng)物禁食8h，不禁水，尾部采血測(cè)定總膽固醇和總甘油三脂。第26d開(kāi)始停止高脂乳劑的喂飼。第四周末(第29d)，中午兩點(diǎn)左右所有動(dòng)物禁食8h，不禁水。晚上10點(diǎn)左右，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)，麻醉后從腹主動(dòng)脈取血，一部分為抗凝血(乙二胺四乙酸抗凝)，4。C保存；一部分為非抗凝血，室溫放置數(shù)小時(shí)后，3000rpm離心5min，然后分離上層血清為測(cè)試樣品。同時(shí)，立即剖腹取肝臟及主動(dòng)脈，用4'C預(yù)冷的生理鹽水沖盡表面浮血，濾紙拭干，剪取3~5cm主動(dòng)脈直接放入10%的福爾馬林中浸泡，肝臟稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)(肝重/體重x100%)。取大鼠肝臟小葉，切取組織塊5x5x2mm3，置10%福爾馬林中固定24h;另稱取0.5g肝組織，剪碎，放于玻璃勻漿器中，加預(yù)冷的9倍體積的0.86%生理鹽水勻漿，2500~3000rpm離心10min，取上清，得到10%的肝勻漿液置4'C保存?zhèn)溆茫辉俜Q取兩份100mg肝組織，—70。C保存?zhèn)溆谩?四)肝臟蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測(cè)定。將牛血清蛋白配制成1mg'mL—M容液，即貯備液。吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1,4、1.6mLjC備液，分別稀釋至2mL，吸取各稀釋液O.lmL(含蛋白質(zhì)2(K80pg)，然后加入蛋白質(zhì)染色劑5mL，充分振蕩，在5~20min內(nèi)，以雙蒸水為空白對(duì)照于595nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算回歸方程。肝臟蛋白含量測(cè)定時(shí)吸取1%肝勻漿液(10%肝勻漿液稀釋得到)0.1mL。按上述步驟操作，測(cè)定ODw5，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。(五)血清中生化指標(biāo)的測(cè)定1.血清中血脂的測(cè)定血清總膽固醇的含量用CHOD-PAP法測(cè)定，甘油三酯的含量用GPO-PAP法測(cè)定，高密度脂蛋白膽固醇的含量用PTA-Mg2+沉淀法測(cè)定，低密度脂蛋白膽固醇的含量用PVS沉淀法。具體操作參見(jiàn)南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū)。同時(shí)根據(jù)Friendwald公式計(jì)算極低密度脂蛋白含量和動(dòng)脈硬化指數(shù)。Friendwald公式①高密度脂蛋白含量(mmol-L.1)=0.2x總甘油三脂②動(dòng)脈硬化指數(shù)-總膽固醇/高密度脂蛋白2.血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定采用改良的Spen:y法(自身底物法)，取兩份新鮮血清O.lmL，其中一份置56°C水浴，另一份置37。C水浴，各lh，立即分別測(cè)定游離膽固醇的含量(參見(jiàn)南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū))。(六)肝組織中各指標(biāo)的測(cè)定1.肝脂質(zhì)的測(cè)定取100mg肝組織置于勻漿器中，加入2mL氯仿-甲醇(1:1體積)勻漿，離心(3500rpm,20min)取上清液，測(cè)定總膽固醇和總甘油三脂的含量(參見(jiàn)南京建成試劑盒說(shuō)明書(shū))。2.肝臟3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性的測(cè)定(1)肝臟微粒體的制備(采用鈣離子沉淀法)取2g肝臟在冰上剪成細(xì)小塊，將剪好的組織懸浮于冰勻漿緩沖液中(4mL/g肝臟)，勻漿20min左右，9000xg離心20min(4°C，下同)；吸取上清液，l卯00xg離心20min;吸上清液，力卩88mmol/L的氯化鈣溶液(1:10，體積比)，冰置5min，偶爾振搖；27000xg離心20min;取沉淀物，加緩沖液5mL，混勻，27000xg離心30min;取沉淀物，加10mmol/L的二硫蘇糖醇溶液，制成濃度為80mg/mL的懸浮微粒溶液。此溶液再勻漿約lmin后，置于-20'C儲(chǔ)存。(2)肝微粒體3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的增溶37'C下解凍樣品，加入等體積含50%甘油和1Ommol/L二硫蘇糖醇的溶液，37。C勻漿IO次后，37°C水浴lh，再勻漿10次；25'C以下'500xg離心lh，吸上清液，一部分用于蛋白含量的測(cè)定，另一部分用于光譜測(cè)定還原酶活力。(3)可溶性還原酶的測(cè)定取兩份混合溶液(600pL磷酸緩沖液，100^L2mmol/L還原型輔酶n溶液，IO(VL蒸餾水)，一份加IO(VL制備好的酶溶液，一份加lmmol/L(R，S)-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A溶液，充分混勻，同時(shí)于37。C水浴3min，再立即在350nm處測(cè)定吸光度值，求出兩者的差值A(chǔ)A。(4)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。(5)計(jì)算方法3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶一個(gè)酶活力單位相當(dāng)于每分鐘每毫克蛋白氧化還原型輔酶II的毫克數(shù)。3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶比活力(mol.min"'mgProtein")=AAxif)-3+(6.22x10.3)x(l十0.1)+蛋白質(zhì)含量(g.L")注AA是每分鐘吸光度的變化值，6.22xl(^是還原型輔酶II在350nm處的摩爾吸光系數(shù)，O.l是酶液體積，l是總反應(yīng)體積。3.肝臟組織病理學(xué)觀察取用10%的福爾馬林固定的肝臟按常規(guī)石蠟包埋，切片，HE(蘇木精伊紅)染色，鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。二、仙人掌水溶性多糖的成分分析(一)仙人掌多糖的成分鑒定仙人掌粗多糖由多糖和少量蛋白質(zhì)組成，不含有淀粉、生物堿、甾體類物質(zhì)(附表O。(二)仙人掌多糖的組分分析仙人掌粗多糖還原糖含量為3.38%;多糖的含量為56.82%;蛋白質(zhì)含量為1.93%;核酸含量為7.35%。四、仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠的治療作用(一)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠體重的影響(附圖2)灌食高脂乳劑一個(gè)星期后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，建模成功；給藥第四周，脂必妥組和中、高劑量組的大鼠的體重有明顯的上升，與模型組有明顯的差異性(戶<0.05)。(二)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠飲水量(附圖3)及攝食量(附圖4)的影響10實(shí)驗(yàn)期間，從給藥第二周開(kāi)始，脂必妥組與模型組比較，飲水量明顯增加；從給藥第三周開(kāi)始，中、高劑量組和脂必妥組，與模型組比較有顯著性差異(戶<0.05)。在第二周后，仙人掌多糖治療各組前后兩周比較有顯著性差異(i3〈0.05)。對(duì)攝食量的影響與飲水量結(jié)果相似。(三)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠肝臟形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的影響1.對(duì)肝臟形態(tài)的影響(附圖5)正常組大鼠肝臟無(wú)異常變化，顏色紅潤(rùn)，質(zhì)軟；模型組大鼠肝臟腫大，呈灰白色脂肪變性，切面油膩，屬于典型的脂肪肝；而仙人掌多糖高劑量組肝臟呈淡紅色，脂肪肝程度較高脂組輕，只有少許脂肪沉積的油狀感。2.對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響(附圖6)正常組肝結(jié)構(gòu)正常，肝索以中央靜脈為中心成放射狀向四周排列，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形，細(xì)胞邊界清晰，核圓而清楚，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)豐富。模型組肝索紊亂，大量肝細(xì)胞腫脹、水樣變性；胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大小不等的圓形脂滴，即肝細(xì)胞脂肪變性，核被擠、向邊緣；伴小葉內(nèi)、匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞點(diǎn)狀或片狀壞死。上述改變均以肝腺泡3區(qū)(小葉中央靜脈周圍)變化最為明顯，提示脂肪肝及脂肪性肝炎造模成功，病理模型穩(wěn)定。仙人掌多糖各治療組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)仙人掌多糖中劑量稍有好轉(zhuǎn)，水樣變性減少，可見(jiàn)少量脂滴；仙人掌多糖高劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞水樣變性消失，胞質(zhì)內(nèi)圓形脂滴明顯減少，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。(四)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠血清總膽固醇、總甘油三脂含量的影響(附表2)血清中總膽固醇、總甘油三脂含量增多，表明脂質(zhì)代謝失調(diào)。造模后，大鼠血清中的總膽固醇和甘油三酯含量都有明顯的升高(/><0.01)，但各組間血脂水平差異無(wú)顯著性，顯示造模成功。第一周末，脂必妥組大鼠血清總膽固醇含量有明顯的下降，與模型組比較有明顯的差異(PO.01);仙人掌多糖高劑量組大鼠血清總膽固醇含量稍有下降，但與模型組比較無(wú)差異性。第二周末，高劑量組大鼠血清中的總膽固醇含量有降低，降低了34.9%，與模型組相比有顯著性差異(PO.Ol)，但對(duì)大鼠血清中的總甘油三脂含量未有明顯影響。第四周末，仙人掌多糖各劑量組對(duì)大鼠血清中總膽固醇含量有明顯降低，尤其是高劑量組對(duì)大鼠血清中的總膽固醇含量有明顯的降低，并且與脂必妥組無(wú)顯著性差異，降低率達(dá)到78.73%(戶<0.01);低、中、高劑量組對(duì)大鼠血清中的總甘油三脂含量都有降低，分別降低了10.6%，25.1%，26.3%(戶<0.01)。(五)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠血清卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性的影響(附表3)血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶是體內(nèi)脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶之一，它主要參與高密度脂蛋白的成熟過(guò)程和總膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，所以此酶活性的下降可導(dǎo)致高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化。與正常組相比，高脂模型組血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性顯著降低(尸O.Ol)。與高脂模型組相比，仙人掌多糖各劑量組可顯著提高血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性(尸<0.01)，低、中、高劑量組對(duì)血清卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性分別增高了34.93%，39.08°/。，88.41%。仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的影響優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。(六)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠血漿脂蛋白含量的影響(附表4)第四周末，模型組與正常組相比，高密度脂蛋白含量顯著降低(P<0.01)，低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量和動(dòng)脈硬化指數(shù)顯著升高(戶<0.01);OPS各劑量組與模型組相比，仙人掌多糖高劑量組高密度脂蛋白含量明顯高于模型對(duì)照組，低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量和動(dòng)脈硬化指數(shù)明顯低于模型對(duì)照組(P<0.01)。低、中、高三個(gè)劑量組大鼠的高密度脂蛋白含量分別升高了3.70%、11.11%、35.18%，同時(shí)低密度脂蛋白含量分別降低了2.91%、18.52%、32.80%。因此，高密度脂蛋白含量隨著樣品劑量的加大而增大，低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量和動(dòng)脈櫻花指數(shù)隨著樣品劑量的加大而減小，都有明顯的劑量依賴性。(七)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠肝體比值的影響(附表5)高脂血癥大鼠的體重明顯下降，在喂詞仙人掌多糖后稍有好轉(zhuǎn)；肝重?zé)o顯著變化，只是藥物組比模型組的肝臟略小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但高劑量治療組的肝體比值明顯低于模型組，有顯著性差異CP<0.05)。(八)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠肝臟脂質(zhì)含量的影響(附表6)脂肪乳劑能促進(jìn)肝臟膽固醇增加，肝臟甘油三酯蓄積，與正常組比較呈極顯著性差異(尸<0.01)。灌食仙人掌多糖后，高脂血癥大鼠中肝臟膽固醇和甘油三酯含量明顯降低，低、中、高三個(gè)劑量組大鼠肝臟中總膽固醇含量分別下降了8.51%，49.01%，64.90%(/><0.01);總甘油三脂含量分別下降了7.6%,33.84%，62.13%(尸<0.01)。此結(jié)果說(shuō)明仙人掌多糖對(duì)脂肪肝具有一定的療效。(九)仙人掌多糖對(duì)高血脂模型大鼠肝臟3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性的影響(附表7)肝臟3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶是膽固醇合成的主要限速酶，此酶活性的升高，肝臟內(nèi)膽固醇合成量也隨之增高。模型組肝3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活力明顯高于正常組(P<0.05)，給予仙人掌多糖后治療組較模型組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但無(wú)量效關(guān)系。附表附件<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>'尸O.Ol，與正常組比較；e尸O.Ol，與模型組比較；*<0.01，與脂必妥組比較。附表4仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠血脂蛋白含量的影響(n=10，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>'尸O.Ol，與正常組比較；？<0.01，與模型組比較;1尸<0.01，與脂必妥組比較。附表5仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠肝體比值的影響(n=10，x±s)組別劑量/mg.kg-'.cT1體重/g肝重/g肝體比/%正常組377.70±15.8311.43±1.470細(xì)±0扁*模型組228.50±10.238.95±0.410.039±0.002脂必妥組187.5253.00±21.327.68±0.770.032±0.002*仙人掌多糖組100233.75±14.228.57±U90.037±0.003200238.83±26.528.59±0.790.036±0.003400244.58±14.917.99±0.670.033±0.002'*尸<0.05，與模型組比較。附表6仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠肝脂質(zhì)的影響(ri=10，x±s)組別劑量/mg-kg-'.d-1總膽固醇含量/nmol'g-1總甘油三脂含量/rnnol'g-1正常組3.14±0.26c2.83±0.26c模型組11.51±2.26ad10.43±1.77ad脂必妥組187.53.16±0.29c3.54±0.15e仙人掌多糖組10010.53±1.03ad9.64±3.81ad2005.87±0.34acd6.90±0.28acd4004.04±0.31c3.95±0.17ca尸〈0.01，與正常組比較；e尸O.Ol，與模型組比較；d戶0.01，與脂必妥組比較。附表7仙人掌多糖對(duì)高脂血癥大鼠肝3-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性的影響(n-lO，x±s)組別劑量/mg'kg"-cT13-羥基，3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶/nmol.min".mgProtein-1正常組1.55±0.19ef模型組2.20±0.27f脂必妥組1.81±0.09e<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>:尸<0.05，與模型組比較；"><0.05，與脂必妥組比較。權(quán)利要求1.一種野生仙人掌多糖提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)取新鮮仙人掌科植物野生仙人掌(OpuntiadilleniiHaw.)，除刺去皮后用清水洗凈，切碎、勻漿，用80％的乙醇室溫浸泡5次，浸泡時(shí)間為12h，除去脂溶性物質(zhì)，殘?jiān)?0℃烘干、粉碎，過(guò)200目篩得仙人掌粉末；(2)按料液比1∶30取仙人掌粉末加一定量的蒸餾水，加入0.5～1.0％果膠酶，溫度為35～45℃，pH3.0～4.0，浸提時(shí)間為1.0～2.0h，合并水提取液，離心得水提液，減壓濃縮；(3)加入3～5倍體積95％乙醇(4℃預(yù)冷)，靜置12h，產(chǎn)生大量白色沉淀，離心收集沉淀，沉淀再用蒸餾水溶解，備用；(4)將蒸餾水溶解液離心去沉淀，濃縮到約原液體積1/2，-20℃～室溫反復(fù)5次凍融、離心，除去蛋白；(5)蒸餾水透析(截留分子量為3500Da)12h，收集透析袋內(nèi)溶液，離心，棄去沉淀；(6)將離心出來(lái)的溶液濃縮，經(jīng)凍干即得仙人掌多糖干粉。2.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的野生仙人掌多糖提取物，其特征在于它含有如下重量比成份還原糖含量為3.018.0%;多糖的含量為55.080.0%;蛋白質(zhì)含量為1.018.0%;核酸含量為5.018.0°/0。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述獲得的仙人掌多糖提取物，其降膽固醇作用體現(xiàn)在所述的仙人掌多糖提取物明顯改善高脂血癥大鼠體重、攝食、飲水情況見(jiàn)附圖2-4;明顯改善血清中生化指標(biāo)；明顯降低總膽固醇含量，與脂必妥組無(wú)顯著性差異，低、中、高劑量組分別降低了32.37%、57.97%、78.73°/。；明顯升高高密度脂蛋白含量，降低低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白含量和動(dòng)脈硬化指數(shù)，低、中、高劑量組的高密度脂蛋白含量分別升高了3.70%、11.11%、35.18%,低密度脂蛋白含量分別降低了2.91%、18.52%、32.80%，有明顯的劑量依賴性見(jiàn)附表2、4;對(duì)脂肪肝具有一定的療效顯著降低肝體比值；低、中、高三個(gè)劑量組大鼠肝臟中總膽固醇含量分別下降了8.51%、49.01%、64.90%;總甘油三脂含量分別下降了7.6%、33.84%、62.13%見(jiàn)附表5-6。全文摘要本發(fā)明涉及一種野生仙人掌多糖提取物的制備及高效降血清膽固醇的作用，該提取物是從天然植物野生仙人掌中提取的一種多糖，可通過(guò)提高體內(nèi)脂代謝關(guān)鍵酶卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性、降低肝臟膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸輔酶A還原酶活性，實(shí)現(xiàn)降低高膽固醇血癥中總膽固醇含量，明顯改善脂代謝紊亂的作用，并且無(wú)明顯的不良反應(yīng)，可用于降低膽固醇的藥品的制備。文檔編號(hào)A61K36/33GK101474235SQ20091003673公開(kāi)日2009年7月8日申請(qǐng)日期2009年1月19日優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日發(fā)明者蘭琦杰,張松蓮,曾富華,楊小舟,陶美華,衛(wèi)黃申請(qǐng)人:湛江師范學(xué)院