本發(fā)明涉及多重基因檢測的試劑盒及其檢測方法，尤其是用于華法林個體化用藥相關基因SNP檢測的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：華法林是目前臨床上廣泛使用的一種雙香豆素衍生物類口服抗凝藥，用于預防和治療血栓栓塞性疾病。但是由于華法林的有效治療范圍較窄且不同個體之間給藥劑量存在較大的差異，致使臨床治療時華法林的劑量很難掌握。據(jù)估計，服用華法林的患者中，每年有15.2％的人發(fā)生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％。不同個體間華法林穩(wěn)定劑量的差異可達20倍以上。藥物基因組學研究表明，華法林的靶酶VKORC1和代謝酶CYP2C9的基因遺傳多態(tài)性是影響華法林用藥劑量差異性的重要因素。而當前確定華法林需求劑量時無法考慮遺傳因素的影響，常常造成患者嚴重的出血并發(fā)癥。研究表明，華法林由CYP2C9代謝，而其突變體使華法林代謝速率大大降低，用藥個體在使用初期就有較高的出血危險性。人CYP2C9基因具有遺傳多態(tài)性，亞型分為*1、*2和*3，其中與亞洲人群最為密切的是CYP2C9基因的c.1075位核苷酸存在A/C多態(tài)性。多態(tài)性位點為C(CYP2C9*3型)時，酶活性比野生型降低了80％，而盡管CYP2C9*2(430C>T)型等位基因在中國人中所占比例較低，但是該位點一旦發(fā)生突變，也會顯著影響酶的活性。維生素K氧化還原酶是抗凝藥物華法林的作用靶點。維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物1的編碼基因VKORC1的遺傳變異可通過影響VKORC1表達，從而影響華法林的敏感性。位于該基因啟動子區(qū)(-1639G>A)的單核苷酸突變可影響VKORC1的表達，是導致華法林用藥劑量個體差異的主要原因之一。目前常用的檢測基因多態(tài)性的方法有DNA直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-PFLP)、高分辨率溶解曲線(HRM)、基因芯片、液相芯片法、熒光定量PCR法等。測序技術是公認的檢測基因突變的金標準，但其設備成本高、檢測周期長、檢測通量低、檢測靈敏度低、對實驗人員的技術操作要求高、結果判定步驟繁瑣等原因，較難形成商業(yè)化的診斷產品；限制性片段長度多態(tài)性分析法檢測靈敏度同樣不高、操作步驟繁瑣，檢測的結果仍需要進行一代測序法的再次驗證，尤其當樣本量多時極易造成PCR產物的交叉污染且容易出現(xiàn)酶切不充分或酶切過度而出現(xiàn)假陰性或假陽性結果，因此也無法應用到臨床上。芯片檢測因其檢測結果的準確性和重復性較差，實驗周期長等缺點，也不適于開發(fā)臨床檢測試劑盒。熒光定量PCR的檢測方法擁有成本低、靈敏度高、特異性強，結果的重復性好等優(yōu)點，是檢測SNP的非常好的一種檢測手段，但是常規(guī)的Taqman探針法探針訂購成本太高，多個位點同時檢測時很難保證所有引物探針在同一擴增條件下均達到非常好的擴增效果。因此，急需要找到一種簡便易行的基因分型方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種快速、簡便、經濟、實用的用于華法林個體化用藥相關基因SNP檢測的試劑盒及其檢測方法。為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種用于華法林個體化用藥相關基因SNP檢測的試劑盒，包括2XqPCR混合反應液和檢測基因CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的引物mix和檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)SNP位點的引物mix和檢測基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點的引物mix；所述的檢測基因CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的引物mix含有檢測該SNP位點的兩條特異性正向引物及一條反向引物；所述的檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)SNP位點的引物mix含有檢測該SNP位點的兩條特異性正向引物及一條反向引物；所述的檢測基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點引物mix含有檢測該SNP位點的兩條特異性正向引物和一條特異性反向引物。所述檢測基因CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5所示；所述檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8所示；所述檢測基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點的兩條特異性正向引物和一條特異性反向引物序列如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11所示。所述的2XqPCR混合反應液中含PCRBuffer、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶、兩條分別用FAM和HEX標記的通用熒光探針，所述FAM標記的通用熒光探針序列如SEQIDNO.1所示，所述HEX標記的通用熒光探針序列如SEQIDNO.2所示。上述的用于華法林個體化用藥相關基因SNP檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：提取待檢測樣本的基因組DNA，然后分成3個反應管(a、b、c)進行檢測，首先在每個反應管中分別加入2XqPCR混合反應液，然后在反應管a加入檢測基因CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的引物mix；在反應管b加入檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)SNP位點的引物mix；在反應管c加入檢測基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點的引物mix，最后在3個反應管(a、b、c)中加入待檢測樣本的基因組DNA，進行核酸樣本的熒光定量PCR擴增，在37℃進行熒光信號的掃描，使用LightCycler480Softwarerelease軟件中的EndpiontGenotyping模塊根據(jù)兩種熒光信號的強度及比值對基因型進行自動判別。所述PCR擴增程序如下：預變性的條件為：溫度為94℃，時間為15秒；PCR擴增由第一階段和第二階段構成；第一階段由10次擴增循環(huán)構成，其條件為：變性：溫度為94℃，時間為20秒；退火+延伸：起始溫度為61℃，每一輪擴增循環(huán)溫度遞減0.5℃，直至擴增循環(huán)結束，時間為60秒；第二階段由29輪循環(huán)構成，其條件為：變性：溫度為94℃，時間為20秒；退火+延伸：溫度為55℃，時間為60秒；信號掃描條件為：溫度為37℃，時間為60秒。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的試劑盒能快速、簡便、經濟、實用的對基因分型，并且通過與一代測序技術檢測結果比對，結果符合度高達99％以上，有望在臨床快速基因分型中得到廣泛應用。解決現(xiàn)有其他檢測技術價格昂貴、效率低下及通量不高的問題。附圖說明圖1為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測基因CYP2C9*2(430C>T)位點的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個樣品的檢測結果圖。圖2為圖1中所示的1-1、1-2、1-3、1-4四個待測樣本的一代測序(Sanger測序)圖。圖3為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)位點的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個樣品的檢測結果圖。圖4為圖3中所示的2-1、2-2、2-3、2-4四個待測樣本的一代測序(Sanger測序)圖。圖5為采用本發(fā)明試劑盒中的檢測基因VKORC1(-1639G/A)位點的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個樣品的檢測結果圖。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明：本發(fā)明用于華法林個體化用藥相關基因SNP檢測的試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒包括檢測基因CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物，和檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)SNP位點的兩條特異性正向引物及一條反向引物，和檢測基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點的兩條特異性正向引物和一條特異性反向引物。所述檢測基因CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAGAGGAGCATTGAGGACCSEQIDNO.3T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGAAGAGGAGCATTGAGGACTSEQIDNO.4反向引物：AGGCAGCGGGCTTCCTCTTGAASEQIDNO.5所述檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：A等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGCACGAGGTCCAGAGATACASEQIDNO.6C等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCACGAGGTCCAGAGATACCSEQIDNO.7反向引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAASEQIDNO.8所述檢測基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列(反義鏈)如下所示：G等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGTGAGCCACCGCACCCSEQIDNO.9A等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGTGAGCCACCGCACCTSEQIDNO.10反向引物：GGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAASEQIDNO.11其中，所述正向引物均由兩部分序列結合而成：野生型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT(SEQIDNO.1)，3’端為識別相應位點的特異序列；突變型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT(SEQIDNO.2)，3’端為識別相應位點的特異序列。本發(fā)明試劑盒的檢測方法，擴增程序如下所示：預變性的條件為：溫度為94℃，時間為15秒；PCR擴增由第一階段和第二階段構成；第一階段由10次擴增循環(huán)構成，其條件為：變性：溫度為94℃，時間為20秒；退火+延伸：起始溫度為61℃，每一輪擴增循環(huán)溫度遞減0.5℃，直至擴增循環(huán)結束，時間為60秒；第二階段由29輪循環(huán)構成，其條件為：變性：溫度為94℃，時間為20秒；退火+延伸：溫度為55℃，時間為60秒；信號掃描條件為：溫度為37℃，時間為60秒。本發(fā)明的引物(primer)是PCR(聚合酶鏈式反應)技術中的重要組成部分，它是一小段單鏈DNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯鍵形式進行合成，因此引物的3’-OH必須是游離的。野生型正向引物的5’通用序列與2XPCR混合反應液中用FAM熒光染料標記的通用序列一致；突變型正向引物的5’通用序列與2XPCR混合反應液中用HEX熒光染料標記的通用序列一致；攜帶熒光染料標記的通用序列用于為熒光定量PCR擴增完成后提供熒光信號。本發(fā)明的工作原理是：針對每個位點分別設計了兩條特異性正向引物和一條反向引物。兩條特異性正向引物3’端最后一個核苷酸分別與突變位點所檢測的堿基互補配對，在PCR(聚合酶鏈式反應)擴增時聯(lián)合反向引物對待測DNA模板進行特異性擴增。PCR前10個循環(huán)的擴增采用了TouchdownPCR，即降落PCR，是優(yōu)化和改良后的一種PCR方法，指每一個(或n個)循環(huán)降低0.5℃(或n℃)退火溫度，直到達到一個較低的退火溫度(Touchdown退火溫度)，以此來保證不同Tm值的引物均可以與相應的待測DNA模板結合并進行特異性擴增。隨后進行的29個循環(huán)的PCR擴增過程中，2XPCR混合反應液中的分別用FAM和HEX標記的兩條通用探針會以前10輪PCR擴增時產生的PCR產物為模板，配合反向引物產生出攜帶有不同熒光染料標記的PCR產物。最后在37℃進行熒光信號的掃描，由軟件根據(jù)兩種熒光信號的強度及比值對基因型進行自動判別。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下的優(yōu)點和效果：1、本發(fā)明采用特殊設計的引物，熒光信號由PCR混合液中的兩種攜帶不同熒光染料標記的通用序列提供，無需單獨設計特異性探針，極大的減少了研發(fā)周期及檢測成本。2、本發(fā)明采用特殊的PCR程序，大大減少了由于Tm值太低而導致的引物與模板在錯誤位點的結合，從而提高了PCR效率和靈敏度，為臨床華法林用藥劑量調整提供可靠的依據(jù)。3、本發(fā)明采用的SNP位點基因分型軟件，可以直觀的自動判別每個待測位點的基因型，無需通過Ct值的繁瑣計算，極大的降低了結果判讀時的人為失誤，并縮短了結果判讀的時間，提高了檢測效率。4、本發(fā)明的試劑盒，可以根據(jù)待測樣本數(shù)量的多少，靈活的選用8連管、96孔板或者384孔板進行檢測，一次的檢測通量分別為1人份、28人份和124人份。5、本發(fā)明的試劑盒，可以實現(xiàn)高準確度、高效率的對CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1(-1639G/A)基因的SNP位點檢測，從而達到對華法林用藥劑量的量化控制，甚至對血栓性疾病的預防、抗凝藥物的選擇、新抗凝藥的研發(fā)、血栓性的疾病預后也起到一定的作用。實施例1一種用于指導華法林個體化用藥相關基因SNP檢測的試劑盒包含：2XPCR混合反應液、引物mix。檢測基因CYP2C9*2(430C>T)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：C等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAGAGGAGCATTGAGGACC；T等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGGAAGAGGAGCATTGAGGACT；反向引物：AGGCAGCGGGCTTCCTCTTGAA；檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：A等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGCACGAGGTCCAGAGATACA；C等位基因正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCACGAGGTCCAGAGATACC；反向引物：AGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA；檢測基因VKORC1(-1639G/A)SNP位點的的兩條特異性正向引物及一條反向引物序列如下所示：G等位基因正向引物：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCGTGAGCCACCGCACCC；A等位基因型正向引物：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGTGAGCCACCGCACCT；反向引物：GGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCTGAA；所述正向引物均由兩部分序列結合而成：野生型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，3’端為識別相應位點的特異序列；突變型正向引物的5’端為通用序列GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，3’端為識別相應位點的特異序列。實施例2一種用于指導華法林個體化用藥相關基因SNP檢測的試劑盒采用的PCR擴增方法包括以下步驟：第一步：待測樣本基因組DNA提取(1)從患者抽取血液樣本。(2)從血液中獲取DNA，采用天根生化(北京)有限公司生產的TGuide血液基因組DNA提取試劑盒(OSR-M102)在其配套的TGuideM16核酸自動提取儀上進行提取。提取過程如下：a.往樣品管中加入200μl/400μl的哺乳動物全血樣本，并加入10μl/20μl蛋白酶K混勻。b.放置樣品管于T型架的孔4位置。運行編號102程序(全血基因組DNA提取程序)，選擇相應的樣本量體積和最終洗脫體積。第二步：對DNA進行擴增采用10ng/10ul反應體系，具體操作為：1、將上述一系列引物分別與血液基因組DNA、2XPCR混合反應液、去離子水按照一定比例混合構成單獨的反應體系，具體見下表：試劑名稱體積(ul)基因組DNA(10ng)2ul引物mix1ul2XPCR混合反應液5ul去離子水2ul2、對上述反應體系進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)條件見下表：第三步：觀測結果表1為采用試劑盒中的檢測基因CYP2C9*2位點的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個樣品的基因型結果。表1如圖1所示，在CYP2C9*2(430C>T)位點的熒光定量PCR擴增體系中，檢測C等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應混合液中FAM熒光標記的引物序列一致，檢測T等位基因特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應混合液中HEX熒光標記的引物序列一致。圖1中X軸代表了FAM熒光的強度，Y軸代表了HEX熒光的強度，1-1、1-2、1-3、1-4四個樣本檢測結果均靠近X軸，說明僅有FAM熒光被檢出，因此基因型均為CC純合。如圖2所示，1-1、1-2、1-3、1-4四個樣本在CYP2C9*2(430C>T)位點處僅檢測到C等位基因，說明四個樣本在CYP2C9*2(430C>T)位點的基因型全部為CC純合。一代測序結果與試劑盒檢測結果一致。表2為采用試劑盒中的檢測基因CYP2C9*3(c.1075A>C)位點的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個樣品的基因型結果。表2如圖3所示，在CYP2C9*3(c.1075A>C)位點的熒光定量PCR擴增體系中，檢測A等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應混合液中FAM熒光標記的引物序列一致，檢測C等位基因特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應混合液中HEX熒光標記的引物序列一致。附圖3中X軸代表了FAM熒光的強度，Y軸代表了HEX熒光的強度,2-1和2-2兩個樣本檢測結果靠近對角線的位置，說明FAM和HEX兩種熒光均被檢出，因此基因型為AC雜合；2-3和2-4兩個樣本檢測結果靠近X軸，說明只有FAM熒光被檢出，因此基因型為AA純合。如圖4所示，2-1和2-2兩個樣本在CYP2C9*3(c.1075A>C)位點處同時檢測到A和C兩種等位基因，所以2-1和2-2兩個樣本在CYP2C9*3(c.1075A>C)位點的基因型為AC雜合；2-3和2-4兩個樣本在CYP2C9*3(c.1075A>C)位點處只檢測到A等位基因，所以2-3和2-4兩個樣本在CYP2C9*3(c.1075A>C)位點的基因型為AA純合。一代測序結果與試劑盒檢測結果一致。表3為采用試劑盒中的檢測基因VKORC1(-1639G/A)位點的兩條特異性正向引物和一條反向引物對四個樣品的基因型結果。表3如圖5所示，VKORC1(-1639G/A)位點檢測結果解釋：在VKORC1(-1639G/A)位點的熒光定量PCR擴增體系中，檢測C等位基因的特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應混合液中FAM熒光標記的引物序列一致，檢測T等位基因特異性正向引物5’端序列與2*qPCR反應混合液中HEX熒光標記的引物序列一致。附圖5中X軸代表了FAM熒光的強度，Y軸代表了HEX熒光的強度,3-1和3-2兩個樣本的檢測結果靠近Y軸，說明只有HEX熒光被檢出，因此基因型為TT純合；圖中3-3和3-4兩個樣本的檢測結果靠近對角線，說明FAM熒光和HEX熒光均被檢出，因此基因型為CT雜合。測序結果顯示3-1、3-2兩例樣本在VKORC1(-1639G/A)位點的等位基因只有T，即3-1、3-2兩例樣本在VKORC1(-1639G/A)位點的基因型全部為TT；3-3、3-4兩例樣本在VKORC1(-1639G/A)位點的等位基因為T和C兩種,即3-3、3-4兩例樣本在VKORC1(-1639G/A)位點的基因型為CT。一代測序結果與試劑盒檢測結果一致。綜上所述，本發(fā)明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發(fā)明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內。當前第1頁1 2 3