本發(fā)明屬于藥物
技術領域：
，具體涉及一種NEP抑制劑(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物及其藥物組合物。
背景技術：
：高血壓是最常見的心血管疾病之一，也是導致充血性心力衰竭、腦卒中、冠心病、腎功能衰竭、主動脈瘤的發(fā)病率和致死率升高的主要危險因素。據(jù)國際高血壓學會最近發(fā)表的新聞公報，全球高血壓或血壓偏高人群已有9.72億人，約占世界成年人口的26.4％。隨著不斷加劇的人口老齡化趨勢，高血壓病人的比例逐步上升。至2025年，估計患病人數(shù)將達到15.6億。隨著新一代抗高血壓藥物的相繼問世和廣泛應用，各類心血管疾病的死亡率有了較大幅度的下降。但是，全球每年仍有1700萬人死于因高血壓導致的心腦血管疾病，其中一半以上的病人死于急性心肌梗塞或腦血管栓塞癥。2009年，中國治療高血壓藥物的銷售額已達到113.57億元人民幣，同比增長17.81％。目前我國高血壓患者約有兩億人，每年還要新增高血壓患者1000萬。2006美國心臟學會估計美國心力衰竭人數(shù)接近580萬；WorldFSSociety估計心力衰竭在西方的流行率為2.5％。我國成年人心衰的患病率為0.9％，患病人口約有400萬。盡管經過多年的努力，但是我國高血壓/心衰治療率和控制率仍遠遠低于發(fā)達國家，因此我國此類藥物市場發(fā)展前景廣闊。NEP(neutralendopeptidase，又稱Neprilysin)是M13鋅依賴的金屬蛋白酶家族的一種II型跨膜糖蛋白，也稱腦啡肽酶，其上帶有的鋅原子處于酶的活性部位。NEP分子量約為97kDa，由750個氨基酸組成，包含一個信號肽和兩個親水結構域，胞內片段有26個氨基酸，胞外片段有700個氨基酸。NEP可作用于多肽的氨基端，使多肽鏈水解。自從1974年首次被定義以來，NEP作為一種神經肽的降解酶，已被發(fā)現(xiàn)廣泛分布于內皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、腎臟上皮細胞、纖維母細胞，其還存在于肺、腸、腎上腺、腦等，并具有眾多組織特異性功能。鈉利尿肽主要被NEP降解，而且NEP還能催化腎上腺髓質和緩激肽。NEP選擇性抑制劑抑制NEP的活性，可以提高鈉利尿肽及緩激肽的濃度，使血管擴張，心排出量增加，醛固酮水平下降并抑制RAAS(腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng))，降低心臟前、后負荷，延緩心肌重構，改善心力衰竭患者的心功能。近十年NEP的雙重抑制劑的研究非常多，包括NEP/ACE雙抑制劑、NEP/ARB(血管緊張肽受體)的雙抑制劑、NEP/ECE(內皮素轉化酶)的雙抑制劑及NEP/APN(氨肽酶N)雙抑制劑。NEP/ACE雙抑制劑的抗高血壓效應優(yōu)于單一抑制劑，在于增加了P物質、緩激肽、腎上腺髓質素等舒張血管肽含量，減少了內皮素I、血管緊張素II等收縮血管肽含量，并優(yōu)化結合了利尿和降壓的雙重效應，從而維持器官供血。Omapatrilat是BMS公司開發(fā)的強效ACE/NEP雙抑制，但因為血管神經性水腫等副作用，2002年7月FDA拒絕批準Omapatrilat用于治療高血壓，甚至作為難治患者的最后治療手段。Solvay公司研發(fā)有三個NEP/ECE(內皮素轉化酶)的雙抑制劑，目前處于臨床二期階段的daglutril(SLV-306，口服)和SLV-334(靜脈給藥)分別用于治療肺動脈高壓和腦損傷，處于臨床一期階段的SLV-338(靜脈給藥)用于治療心血管疾病、代謝失調和神經性疾病。Pharmaleads公司研發(fā)的NEP/APN(氨肽酶N)雙抑制劑PL-37(Debio-0827，口服)主要用于治療疼痛，尤其是神經性疼痛。LCZ-696是由Novartis公司開發(fā)的口服降壓藥、保心藥，是作用于NEP/ARB(血管緊張肽受體)的雙抑制劑，目前處于臨床三期階段，最新的臨床結果表明：在射血分數(shù)正常的心臟衰竭患者中，12周時LCZ-696引起的NT-proBNP降幅大于纈沙坦，且LCZ-696耐受性良好(NCT00887588)。至于這些效應能否轉化為預后的改善，還需要進行前瞻性測試。Thomson-pharma預測其將于2014年上市，2017年的銷售額將達到2.04億美元。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于解決目前存在的技術問題，提供一種(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物，這些化合物在體內都可以經代謝產生化合物LBQ657，具有NEP抑制活性，可以作為NEP抑制劑，可以用來治療相關疾病，例如高血壓、心衰、肺動脈高壓以及腎臟疾病。本發(fā)明提供一種如式(Ⅰ)所示的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，其中，為R1、R2取代的手性碳原子；R1、R2各自獨立的選自氫、氘、鹵素、羥基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷氧基，且R1、R2各不相同；R3選自氫、C1-8烷基、C3-8環(huán)烷基，任選進一步被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷氧基、-S(O)rR4、-C(O)R4、-C(O)OR4、-O-C(O)R4、-O-C(O)OR4、-NR5R6、-C0-4-NR5R6、-C(O)NR5R6、-C0-4C(O)NR5R6或-N(R4)-C(O)R4取代基所取代，R4、R5、R6各自獨立的選自氫、Cl-4烷基、C3-8環(huán)烷基，r為0、1、2。作為進一步優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，R1、R2各自獨立的選自氫、氘、鹵素、羥基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C3-8環(huán)烷基，且R1、R2各不相同，R3、R4、R5、R6、r如式(Ⅰ)化合物所定義。作為進一步優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，R1、R2各自獨立的選自氫、氘、氟、甲基、乙基、異丙基、三氟甲基、羥甲基、環(huán)丙基、環(huán)已基、環(huán)丙氧基，且R1、R2各不相同，R3、R4、R5、R6、r如式(Ⅰ)化合物所定義。作為進一步優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，R3選自氫、C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基，任選進一步被一個或多個選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷氧基取代基所取代，R1、R2如式(Ⅰ)化合物所定義。作為進一步優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，R3選自氫、C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基，任選進一步被一個或多個選自鹵素、鹵取代C1-8烷基、鹵取代C1-8烷氧基、羥基、氰基、硝基、C1-8烷基取代基所取代，R1、R2如式(Ⅰ)化合物所定義。作為進一步優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，R3選自氫、C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基，任選進一步被一個或多個選自氟、三氟甲基、二氟甲基、羥基、氰基、硝基、二氟丙氧基、甲基、乙基、異丙基所取代，R1、R2如式(Ⅰ)化合物所定義。作為進一步優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，R1，R2各自獨立的選自氫、氟、甲基、乙基、異丙基、三氟甲基且R1、R2各不相同，R3選自氫、C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基，任選進一步被一個或多個選自氟、三氟甲基、二氟甲基、二氟丙氧基、甲基、乙基、異丙基所取代。作為更進一步優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物，選自式(ⅠA)化合物或式(ⅠB)化合物：其中，R3選自C1-4烷基、C3-6環(huán)烷基。作為最優(yōu)選的方案，所述的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物選自以下化合物：本發(fā)明的另一目的還在于提供一種制備式(I)所示的(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物的方法，包括對式(II)化合物進行手性拆分，R1、R2、R3如式(Ⅰ)化合物所定義；其中，手性拆分的HPLC流動相為：乙烷/異丙醇/醋酸，優(yōu)選乙烷/異丙醇/醋酸的比例為70/30/0.1～80/20/0.1。手性拆分的HPLC檢測波長為250nm～260nm，優(yōu)選254nm。手性拆分的HPLC流速為0.5ml/min～5.0ml/min，優(yōu)選1.0ml/min。手性拆分的HPLC進樣量為1ul-10ul，優(yōu)選2ul-8ul。本發(fā)明的再一目的還在于提供一種用于預防和/或治療與NEP異常有關的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物中含有治療有效量的所述(2R,4S)-5-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基)-4-(3-羧基丙酰氨基)-2-甲基戊酸酯衍生物、其立體異構體、水合物或溶劑合物。優(yōu)選的，所述與NEP異常有關的疾病是指高血壓、肺動脈高壓、心衰以及腎臟疾病。本發(fā)明所述的系列化合物均具有明顯的NEP抑制活性，經動物實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物具有良好的藥代動力學活性，化合物溶解性能好，生物利用度高等特點，能夠用于治療或預防高血壓、肺動脈高壓、心衰以及腎臟疾病等與NEP異常有關的疾病的藥物開發(fā)，有望開發(fā)出新一代NEP抑制劑。附圖說明圖1：實施例1化合物手性HPLC圖譜(保留時間為4.163min的化合物登記為化合物(1-6R)，保留時間為6.391的化合物登記為化合物(1-6S))。圖2：實施例2化合物手性HPLC圖譜(保留時間為4.557min的化合物登記為化合物(2-6R)，保留時間為5.968min的化合物登記為化合物(2-6S))。具體實施方式詳細說明：除非有相反陳述，下列用在說明書和權利要求書中的術語具有下述含義。“C1-8烷基”指包括1至8個碳原子的直鏈烷基和含支鏈烷基，烷基指飽和的脂族烴基團。例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基或其各種支鏈異構體等。烷基可以是取代的或未取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，優(yōu)選為一個或多個以下基團，獨立地選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷氧基、-S(O)rR4、-C(O)R4、-C(O)OR4、-O-C(O)R4、-O-C(O)OR4、-NR5R6、-C0-4-NR5R6、-C(O)NR5R6、-C0-4C(O)NR5R6或-N(R4)-C(O)R4取代基所取代?！碍h(huán)烷基”指飽和或部分不飽和單環(huán)或多環(huán)環(huán)狀烴取代基，“C3-8環(huán)烷基”指包括3至8個碳原子的環(huán)烷基，例如：單環(huán)環(huán)烷基的非限制性實施例包含環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)庚三烯基、環(huán)辛基等。多環(huán)環(huán)烷基包括螺環(huán)、稠環(huán)和橋環(huán)的環(huán)烷基。“螺環(huán)烷基”指單環(huán)之間共用一個碳原子(稱螺原子)的多環(huán)基團，這些可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環(huán)具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。根據(jù)環(huán)與環(huán)之間共用螺原子的數(shù)目將螺環(huán)烷基分為單螺環(huán)烷基、雙螺環(huán)烷基基或多螺環(huán)烷基，螺環(huán)烷基的非限制性實施例包含：“稠環(huán)烷基”指系統(tǒng)中的每個環(huán)與體系中的其他環(huán)共享毗鄰的一對碳原子的全碳多環(huán)基團，其中一個或多個環(huán)可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環(huán)具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。根據(jù)組成環(huán)的數(shù)目可以分為雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)或多環(huán)稠環(huán)烷基，稠環(huán)烷基的非限制性實施例包含：“橋環(huán)烷基”指任意兩個環(huán)共用兩個不直接連接的碳原子的全碳多環(huán)基團，這些可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環(huán)具有完全共軛的π電子系統(tǒng)。根據(jù)組成環(huán)的數(shù)目可以分為雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)或多環(huán)橋環(huán)烷基，橋環(huán)烷基的非限制性實施例包含：所述環(huán)烷基環(huán)可以稠合于芳基、雜芳基或雜環(huán)烷基環(huán)上，其中與母體結構連接在一起的環(huán)為環(huán)烷基，非限制性實施例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環(huán)庚烷基等。環(huán)烷基可以是任選取代的或未取代的，當被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個以下基團，獨立地選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷氧基、-S(O)rR4、-C(O)R4、-C(O)OR4、-O-C(O)R4、-O-C(O)OR4、-NR5R6、-C0-4-NR5R6、-C(O)NR5R6、-C0-4C(O)NR5R6或-N(R4)-C(O)R4取代基所取代?！巴檠趸敝?O-(烷基)，其中烷基的定義如上所述。C1-8烷氧基指含1-8個碳的烷基氧基，非限制性實施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。烷氧基可以是任選取代的或未取代的，當被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個以下基團，獨立地選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷氧基、-S(O)rR4、-C(O)R4、-C(O)OR4、-O-C(O)R4、-O-C(O)OR4、-NR5R6、-C0-4-NR5R6、-C(O)NR5R6、-C0-4C(O)NR5R6或-N(R4)-C(O)R4取代基所取代?！碍h(huán)烷氧基”指和-O-(未取代的環(huán)烷基)，其中環(huán)烷基的定義如上所述。C3-8環(huán)烷氧基指含3-8個碳的環(huán)烷基氧基，非限制性實施例包含環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基、環(huán)戊氧基、環(huán)己氧基等。環(huán)烷氧基可以是任選取代的或未取代的，當被取代時，取代基優(yōu)選為一個或多個以下基團，獨立地選自鹵素、羥基、氰基、硝基、C1-8烷基、鹵取代C1-8烷基、羥基取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、鹵取代C1-8烷氧基、C3-8環(huán)烷基、C3-8環(huán)烷氧基、-S(O)rR4、-C(O)R4、-C(O)OR4、-O-C(O)R4、-O-C(O)OR4、-NR5R6、-C0-4-NR5R6、-C(O)NR5R6、-C0-4C(O)NR5R6或-N(R4)-C(O)R4取代基所取代?！胞u素”指氟、氯、溴或碘。“-S(O)rR4”指R4取代的硫、亞硫酰基、硫酰基?！?C(O)R4”指R4取代的羰基?！?C(O)OR4”指R4取代的羰基氧基?！?O-C(O)R4”指R4取代的氧基羰基?！?O-C(O)OR4”指R4取代的氧基酯基?！?NR5R6”指R5、R6取代的氨基。“-C0-4-NR5R6”指R5、R6取代的C0-4烷基氨基?！?C(O)NR5R6”指R5、R6取代的酰氨基?！?C0-4C(O)NR5R6”指R5、R6取代的C0-4烷基酰氨基。“-N(R4)-C(O)R4”指R4取代氨基?；??！叭芜x”或“任選地”意味著隨后所描述地事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生，該說明包括該事件或環(huán)境發(fā)生或不發(fā)生地場合。例如，“任選被烷基取代的雜環(huán)基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環(huán)基團被烷基取代的情形和雜環(huán)基團不被烷基取代的情形?！叭〈摹敝富鶊F中的一個或多個氫原子，優(yōu)選為最多5個，更優(yōu)選為1～3個氫原子彼此獨立地被相應數(shù)目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(通過實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩(wěn)定的?！八幬锝M合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利于活性成分的吸收進而發(fā)揮生物活性。下面實施例將進一步舉例說明本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1第一步：1-氯乙基異丙基碳酸酯的制備化合物1-氯乙基氯甲酸酯(3ml,27.8mmol)用DCM(25ml)稀釋，冷卻至0℃，將用DCM(25ml)稀釋的異丙醇(2.1ml,27.8mmol)用恒壓滴液漏斗緩慢加入，反應15min左右，將用DCM(5ml)稀釋的吡啶(2.4ml,30.6mmol)同樣用恒壓滴液漏斗緩慢加入，該過程中保持低溫不變，加完后，室溫下反應過夜，然后加水稀釋，用DCM萃取，有機相干燥，濃縮后得3.74g淡黃色液體，產率為81％。1HNMR:(400MHz,CDCl3),6.36(q,1H),4.88(m,1H),1.759(dm,3H),1.26(t,6H)。第二步：1-碘乙基異丙基碳酸酯的制備化合物1-氯-乙基酯異丙基碳酸酯(3.74g,22.4mmol)溶解在乙腈(20ml)中，加入碘化鈉(16.8g,112.2mmol)，升溫至50℃反應6小時左右，將溶劑旋干，固體用乙醚溶解，過濾掉多余的碘化鈉，濾液旋干，得5.2g棕褐色液體，產率為90％。1HNMR:(400MHz,CDCl3),6.69(m,1H),4.87(m,1H),2.16(m,3H),1.25(m,6H)。第三步：(2R,4S)-4-(3-芐氧基羰基-丙酰氨基)-5-聯(lián)苯基-4-基-2-甲基戊酸-1-異丙氧基碳氧基乙基酯的制備化合物(2R,4S)-4-(3-芐氧基羰基-丙酰氨基)-5-聯(lián)苯基-4-基-2-甲基戊酸(284mg,0.6mmol)和Cs2CO3(391mg,1.2mmol)在乙腈中反應2.5小時后，將化合物1-碘-乙基異丙基碳酸酯(464mg,1.8mmol)加入，反應3小時后，補加化合物1-碘-乙基異丙基碳酸酯(464mg,1.8mmol)和Cs2CO3(391mg,1.2mmol),反應過夜，將體系旋干，反相柱層析純化，得228mg產物。LC-MS:4.182min,[M+H]+:604,[M+Na]+:626。第四步：(2R,4S)-5-聯(lián)苯基-4-基-4-(3-羧基-丙酰氨基)-2-甲基戊酸-1-異丙氧基碳氧基乙基酯的制備化合物(2R,4S)-4-(3-芐氧基羰基-丙酰氨基)-5-聯(lián)苯基-4-基-2-甲基戊酸-1-異丙氧基碳氧基乙基酯(228mg)和Pd/C(0.2g)溶解在MeOH中，H2氛圍下室溫反應4小時左右，將Pd/C用硅藻土過濾掉，濾液旋干，反相柱層析純化得到125mg淡黃色油狀物(2R,4S)-5-聯(lián)苯基-4-基-4-(3-羧基-丙酰氨基)-2-甲基戊酸-1-異丙氧基碳氧基乙基酯。1HNMR:(400MHz,CDCl3),7.49(m,2H),7.41(m,2H),7.35(m,2H),7.25(m,1H),7.13(m,2H),6.66(m,1H),4.82(m,1H),4.42(m,1H),3.20(m,1H),2.96(m,1H),2.4(m,6H),2.01(m,1H),1.69(m,1H),1.44(m,3H),1.23(m,6H),1.12(m,3H).LC-MS:4.045min,(M+Na)+:518。第五步：(6S,9R,11S)-11-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基甲基)-2,6,9-三甲基-4,8,13-三羰基-3,5,7-三氧雜-12-氮雜十六烷-16-酸(1-6S)和(6R,9R,11S)-11-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基甲基)-2,6,9-三甲基-4,8,13-三羰基-3,5,7-三氧雜-12-氮雜十六烷-16-酸(1-6R)的制備化合物(1-6S)和化合物(1-6R)是由化合物(6)經手性柱拆分得到。化合物手性拆分采用HPLC法，使用手性制備儀器和合適的手性柱(大賽璐公司)對手性異構體進行分離，收集其相應組分。旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到光學異構體的純品。手性HPLC圖譜見附圖1，柱效能報告見下表：峰號保留時間面積面積％T塔板數(shù)拖尾因子分離度14.163657639044.55926091.188--25.3251102560.74739960.9583.50636.391797053154.00524751.1352.50448.7491016560.68960541.2914.896手性拆分條件如下：化合物核磁數(shù)據(jù)如下：1、化合物(1-6S)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.55-7.48(m,2H),7.46(d,J＝8.1Hz,2H),7.36(t,J＝7.5Hz,2H),7.26(t,J＝7.3Hz,1H),7.16(d,J＝8.1Hz,2H),6.52–6.42(m,2H),4.81(hept,J＝6.2Hz,1H),4.33(brs,1H),2.77(dd,J＝13.6,6.6Hz,1H),2.72–2.47(m,4H),2.44–2.38(m,2H),1.87(ddd,J＝14.3,7.6,3.7Hz,1H),1.81–1.69(m,1H),1.46(d,J＝5.3Hz,3H),1.26(d,J＝6.2Hz,3H),1.24(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝7.0Hz,3H)；LC-MS:tR4.31min,[M+H]+:514.1,[M+Na]+:536.2。2、化合物(1-6R)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.55-7.49(m,2H),7.46(d,J＝8.0Hz,2H),7.36(t,J＝7.6Hz,2H),7.26(t,J＝7.3Hz,1H),7.17(d,J＝8.0Hz,2H),6.68(q,J＝5.4Hz,1H),5.69(d,J＝7.0Hz,1H),4.86–4.74(m,1H),4.20(brs,1H),2.79(d,J＝6.0Hz,3H),2.68–2.24(m,9H),1.87(ddd,J＝13.5,9.6,4.0Hz,1H),1.55(ddd,J＝13.7,10.5,3.5Hz,1H),1.45(d,J＝5.4Hz,3H),1.23(d,J＝2.1Hz,3H),1.22(d,J＝2.1Hz,4H),1.11(d,J＝7.1Hz,3H)；LC-MS:tR4.28min,[M+H]+:514.1,[M+Na]+:536.2。實施例2第一步：(9R,11S)-11-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基甲基)-6-異丙基-2,9-二甲基-4,8,13-三羰基-3,5,7-三氧雜-12-氮雜十六烷-16-酸的制備化合物(2R,4S)-4-(3-芐氧基羰基-丙酰氨基)-5-聯(lián)苯基-4-基-2-甲基戊酸(1410mg，2.98mmol)溶于10mLN,N-二甲基甲酰胺，加入Cs2CO3(580mg，1.79mmol)，室溫攪拌1小時，加入KI(1240mg，7.44mmol)，1-氯-2-甲基丙基異丙基碳酸酯(1450mg，7.44mmol)，加熱65度反應24小時。反相柱層析分離得745mg粗產品(含合環(huán)副產物)。再將其溶于10mL甲醇，加入80mg鈀/碳，常溫常壓氫化5小時。過濾，濃縮，反相柱層析分離，得白色泡狀固體(9R,11S)-11-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基甲基)-6-異丙基-2,9-二甲基-4,8,13-三羰基-3,5,7-三氧雜-12-氮雜十六烷-16-酸(534mg，兩步33％)。LC-MS：tR:3.11min,[M+H]+:542.2,[M+Na]+:564.3。第二步：(6S,9R,11S)-11-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基甲基)-6-異丙基-2,9-二甲基-4,8,13-三羰基-3,5,7-三氧雜-12-氮雜十六烷-16-酸(2-6S)和(6R,9R,11S)-11-([1,1'-聯(lián)苯基]-4-基甲基)-6-異丙基-2,9-二甲基-4,8,13-三羰基-3,5,7-三氧雜-12-氮雜十六烷-16-酸(2-6R)的制備化合物(2-6S)和化合物(2-6R)是由化合物(9)經手性柱拆分得到?；衔锸中圆鸱植捎肏PLC法，使用手性制備儀器和合適的手性柱(大賽璐公司)對手性異構體進行分離，收集其相應組分。旋轉蒸發(fā)除去溶劑，得到光學異構體的純品。手性HPLC圖譜見附圖2，柱效能報告見下表：峰號保留時間面積面積％拖尾因子(10％)分離度高度％14.557min4.557574143251.4891.543--25.968min5.968540925348.5111.2672.781手性拆分條件如下：化合物核磁數(shù)據(jù)如下：1、化合物(2-6S)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.57(d,J＝7.4Hz,2H),7.52(d,J＝7.7Hz,2H),7.43(t,J＝7.5Hz,2H),7.33(t,J＝7.3Hz,1H),7.23(d,J＝7.8Hz,2H),6.48–6.38(m,2H),4.87(dt,J＝12.4,6.1Hz,1H),4.36(brs,1H),2.87(dd,J＝13.2,5.9Hz,1H),2.80–2.38(m,6H),2.15–2.04(m,1H),3.02–1.90(m,1H),1.87–1.72(m,1H),1.31(t,J＝6.8Hz,6H),1.16(d,J＝6.8Hz,3H),0.98(d,J＝6.8Hz,6H)。2、化合物(2-6R)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.57(d,J＝7.3Hz,2H),7.52(d,J＝7.9Hz,2H),7.43(t,J＝7.6Hz,2H),7.34(d,J＝7.3Hz,1H),7.23(d,J＝8.0Hz,2H),6.50(d,J＝4.8Hz,1H),5.78(d,J＝7.6Hz,1H),4.94–4.80(m,1H),4.26(brs,1H),2.96–2.79(m,2H),2.63(s,3H),2.46(s,2H),2.12–2.00(m,1H),1.99–1.89(m,1H),1.64(t,J＝10.5Hz,1H),1.32–1.26(m,6H),1.18(d,J＝7.0Hz,3H),1.02–0.95(m,6H)。生物學實驗例1(大鼠藥代動力學研究試驗)1.研究目的以大鼠為受試動物，研究NEP系列前藥化合物(6)，化合物(1-6R)，化合物(2-6R)，化合物(2-6S)在大鼠體內的藥代動力學行為，評價其藥動學特征。2.試驗方案2.1試驗動物每例使用SD大鼠3只，雄性，由西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(滬)2008-0016。2.2藥物配制樣品全取(按30mg計)，加1ml乙醇使溶解，后依次加入1ml(溫水適當加熱使融化)SolutolHS15和8mlpH4.63醋酸鹽緩沖液，制成3mg/ml溶液，剩余藥液留樣用于定量分析。2.3給藥SD大鼠3只，雄性；禁食一夜后分別灌胃給藥，劑量為30mg/kg，給藥體積10ml/kg。2.4樣品采集于給藥前和給藥后0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,24.0h采血0.1ml，置于肝素化試管中，4℃3500rpm離心10min分離血漿，于-20℃保存；給藥后2h進食。因待測物在血漿中不穩(wěn)定，血樣采集后迅速置于冰水浴中，血樣采集及處理、分析的全過程保持低溫狀態(tài)。3.分析方法3.1儀器設備API4000三重四級桿質譜儀，美國AppliedBiosystems公司；ShimadzuLC-20AD高效液相色譜系統(tǒng)，日本Shimadzu公司。3.2色譜條件色譜柱：InertsilC8-3(50×4.6mm,5μm)；流動相：甲醇：0.2％甲酸水溶液(梯度洗脫)；流速(ml/min)：1.0ml/min。3.3質譜條件3.4血漿樣品預處理同時檢測前藥及代謝產物LBQ657：取給藥后各時刻的大鼠血漿25ul，加入內標SHR133162(200ng/ml，甲醇配制)50ul，甲醇175ul，渦旋混合3min，離心10min(13500rpm)，取上清液10ul進行LC/MS/MS分析。3.5標準曲線制備同時檢測前藥及代謝產物LBQ657：取大鼠空白血漿25ul，加入混合標準系列溶液25ul，使血藥濃度為1.00,2.00,5.00,25.0,100,500,2000,5000,20000和40000ng/ml，加入內標SHR133162(200ng/ml，甲醇配制)50ul，甲醇150ul，按“血漿樣品預處理”項下操作。以血藥濃度為橫坐標，樣品與內標色譜峰面積比為縱坐標，以加權最小二乘法(w＝1/x2)進行線性回歸，獲得典型標準曲線方程如下表：4.NEP化合物大鼠藥代動力學研究1.大鼠灌胃給予30mg/kg前藥化合物(6)后，各時刻化合物(6)血藥濃度均低于定量下限，推測該前藥在大鼠體內快速被酶水解；代謝產物LBQ657的血藥濃度達峰時間tmax為0.83h，峰濃度Cmax為36393ng/ml，血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為54682ng/ml·h，消除半衰期t1/2為2.29h。2.大鼠灌胃給予30mg/kg前藥化合物(1-6R)后，化合物(1-6R)在大鼠體內各時刻血藥濃度均低于定量下限，推測該前藥被酶快速水解；代謝產物LBQ657的血藥濃度達峰時間tmax為0.43h，峰濃度Cmax為15056ng/ml，血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為33505ng/ml·h，消除半衰期t1/2為1.91h。3.大鼠灌胃給予30mg/kg前藥化合物(2-6R)后，化合物(2-6R)在大鼠體內各時刻血藥濃度均低于定量下限，推測該前藥被酶快速水解；代謝產物LBQ657的血藥濃度達峰時間tmax為1.0h，峰濃度Cmax為6120ng/ml，血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為10713ng/ml·h，消除半衰期t1/2為0.98h。4.大鼠灌胃給予30mg/kg前藥化合物(2-6S)后，化合物(2-6S)在大鼠體內各時刻血藥濃度均低于定量下限，推測該前藥被酶快速水解；代謝產物LBQ657的血藥濃度達峰時間tmax為0.5h，峰濃度Cmax為6140ng/ml，血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為10989ng/ml·h，消除半衰期t1/2為1.2h。結論：本發(fā)明實施例化合物均可以在大鼠體內快速地代謝成活性藥物成分LBQ657。生物學實驗例2(犬藥代動力學研究試驗)1.研究目的以比格犬為受試動物，研究NEP系列前藥化合物(6)，化合物(1-6R)，化合物(1-6S)，(2-6R)，(2-6S)在比格犬體內的藥代動力學行為，評價其藥動學特征。2.試驗方案2.1試驗動物每例使用3只Beagle犬，由蘇州西山中科實驗動物有限公司提供。2.2藥物配制稱取樣品，用乙醇，SolutolHS15和pH4.63醋酸鹽緩沖液(1：1：8)，制成1mg/ml溶液，剩余藥液留樣用于定量分析。2.3給藥禁食一夜后分別灌胃給藥，劑量為3mg/kg。2.4樣品采集于給藥前和給藥后0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,24.0h采血0.1ml，置于肝素化試管中，4℃3500rpm離心10min分離血漿，于-20℃保存；給藥后3h進食。因待測物在血漿中不穩(wěn)定，血樣采集后迅速置于冰水浴中，血樣采集及處理、分析的全過程保持低溫狀態(tài)。3.分析方法3.1儀器設備API4000三重四級桿質譜儀，美國AppliedBiosystems公司；ShimadzuLC-20AD高效液相色譜系統(tǒng)，日本Shimadzu公司。3.2色譜條件色譜柱：InertsilC8-3(50×4.6mm,5μm)；流動相：甲醇：0.2％甲酸水溶液(梯度洗脫)；流速(ml/min)：1.0ml/min。3.3質譜條件3.4血漿樣品預處理同時檢測前藥及代謝產物LBQ657：取給藥后各時刻的大鼠血漿25ul，加入內標SHR133162(200ng/ml，甲醇配制)50ul，甲醇175ul，渦旋混合3min，離心10min(13500rpm)，取上清液10ul進行LC/MS/MS分析。3.5標準曲線制備同時檢測前藥及代謝產物LBQ657：取大鼠空白血漿25ul，加入混合標準系列溶液25ul，使血藥濃度為1.00,2.00,5.00,25.0,100,500,2000,5000,20000和40000ng/ml，加入內標SHR133162(200ng/ml，甲醇配制)50ul，甲醇150ul，按“血漿樣品預處理”項下操作。以血藥濃度為橫坐標，樣品與內標色譜峰面積比為縱坐標，以加權最小二乘法(w＝1/x2)進行線性回歸，獲得典型標準曲線方程如下表：4.NEP化合物比格犬藥代動力學研究1.犬灌胃給予3.0mg/kg化合物(6)后，平均血藥濃度達峰時間tmax為0.50h，平均峰濃度Cmax為462ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為514ng/ml·h；其代謝物LBQ657的平均血藥濃度達峰時間tmax為0.75h，平均峰濃度Cmax為294ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為428ng/ml·h，平均消除半衰期t1/2為2.21h。2.犬灌胃給予3.0mg/kg化合物(1-6R)后，平均血藥濃度達峰時間tmax為0.50h，平均峰濃度Cmax為648ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為598ng/ml·h；其代謝物LBQ657的平均血藥濃度達峰時間tmax為0.50h，平均峰濃度Cmax為627ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為762ng/ml·h，平均消除半衰期t1/2為1.75h。3.犬灌胃給予3.0mg/kg化合物(1-6S)后，化合物例3在犬體內各時刻血藥濃度均低于定量下限，推測該前藥被酶快速水解；其代謝物LBQ657的平均血藥濃度達峰時間tmax為0.50h，平均峰濃度Cmax為542ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為671ng/ml·h，平均消除半衰期t1/2為1.64h。4.犬灌胃給予3.0mg/kg化合物(2-6R)后，平均血藥濃度達峰時間tmax為0.08h，平均峰濃度Cmax為611ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為134ng/ml·h；其代謝物LBQ657的平均血藥濃度達峰時間tmax為0.25h，平均峰濃度Cmax為223ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為150ng/ml·h，平均消除半衰期t1/2為2.91h。5.犬灌胃給予3.0mg/kg化合物(2-6S)后，平均血藥濃度達峰時間tmax為0.31h，平均峰濃度Cmax為829ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為831ng/ml·h；其代謝物LBQ657的平均血藥濃度達峰時間tmax為0.50h，平均峰濃度Cmax為136ng/ml，平均血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t為168ng/ml·h，平均消除半衰期t1/2為2.35h。結論：本發(fā)明實施例化合物均可以在犬體內代謝成活性藥物成分LBQ657。生物學實驗例3(NEP酶抑制測試)下面的體外試驗可用來測定本發(fā)明化合物對于大鼠血漿中NEP酶的抑制活性，其活性可用IC50值來表示。化合物的半數(shù)抑制濃度IC50(將一定濃度的酶活性抑制至50％時所需的化合物濃度)是通過將一定量的酶與特定的底物及不同濃度的待測化合物混合反應后測定計算出的。本實驗所用的NEP酶體系是取自正常SD大鼠的新鮮血液，置于含肝素鈉抗凝劑的管中，5000rpm，4℃離心10min后，收集血漿；配制不同濃度的NEP抑制劑，其中，NEP抑制劑的最高終濃度為100μM,并以3倍梯度依次稀釋10次；每孔加60μl新鮮的大鼠血漿于384孔板；隨后，每孔再加入10μl梯度稀釋的NEP抑制劑；37℃，孵育30min后，每孔加入10μl10μM的底物(SenoLyte520NeprilysinActivityAssayKit，AnaSpec,72223)；在37℃孵育18h(±1h)；在激發(fā)光490nm和發(fā)射光520nm的波長下，測定熒光信號；并采用Prism5.0軟件求得IC50。本發(fā)明化合物的NEP酶抑制活性通過以上的試驗進行測定，測得的IC50值見下表?；衔颕C50(uM)化合物(1-6S)0.035化合物(1-6R)0.038化合物(2-6S)0.040化合物(2-6R)0.042結論：本發(fā)明化合物在SD大鼠血漿中對NEP酶均有明顯地抑制作用。當前第1頁1 2 3