一種VC?CAR分子及在清除HIV?1感染細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào)：12342461閱讀：2111來源：國知局

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一種VC?CAR分子及在清除HIV?1感染細(xì)胞中的應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種VC-CAR分子及在清除HIV-1感染細(xì)胞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人類免疫缺陷病毒1型(Human Immunodificiency Viruse 1,HIV-1)感染后，聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(combined antiretroviral therapy,cART)可以有效地抑制病毒復(fù)制。然而，由于病毒整合在被感染細(xì)胞中并形成一個(gè)穩(wěn)定的潛伏感染儲(chǔ)存庫，被感染者一旦停止cART治療，病毒血癥即在短時(shí)間內(nèi)再爆發(fā)，這構(gòu)成了治愈HIV-1感染的主要障礙。

當(dāng)前的研究熱點(diǎn)是通過特異性的潛伏感染逆轉(zhuǎn)藥物(latency-reversing agents,LRAs)激活潛伏感染的病毒，進(jìn)而藥物治療或誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)殺滅被感染細(xì)胞。這種干預(yù)策略被稱為“shock and kill”。然而，HIV-1可以迅速的發(fā)生突變以逃避免疫識(shí)別。研究顯示在經(jīng)過cART治療的感染者當(dāng)中，即使成功激活了其潛伏感染，體內(nèi)的CD8+T淋巴細(xì)胞由于缺乏對(duì)HIV-1有效的免疫應(yīng)答，所以不能完全清除被感染的細(xì)胞。因此，在“shock and kill”策略中，為了更好的清除潛伏感染儲(chǔ)存庫，需要在被感染者體內(nèi)重建強(qiáng)有力的免疫監(jiān)控機(jī)能。

近年來，由于具有高親和力、TCR(T cell receptor)非依賴和MHC(major histocompatibility complex)非限制等特點(diǎn)，嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的免疫細(xì)胞療法成為了殺傷腫瘤細(xì)胞的全新途徑。CAR是由抗體靶向區(qū)域與T細(xì)胞激活胞內(nèi)信號(hào)區(qū)融合而成，從而賦予細(xì)胞特異性抗原識(shí)別能力。通過在患者自體免疫細(xì)胞中表達(dá)識(shí)別腫瘤天然抗原的CAR分子并對(duì)進(jìn)行過繼免疫回輸，可以特異性的靶向殺傷患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞療法已在白血病和淋巴瘤的臨床治療中證明了有效性，并且獲得了令人鼓舞的成功。該策略也可應(yīng)用于抗病毒治療，包括HIV-1、HBV(hepatitis B virus)和HCV(hepatitis C virus)等病毒感染的治療。但是，傳統(tǒng)構(gòu)建的CAR分子還不能完全滿足各種疾病的免疫治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種新的CAR分子，稱作VC-CAR分子，VC-CAR分子是將HIV-1廣譜中和抗體VRC01來源的scFv序列和傳統(tǒng)的CAR分子的胞內(nèi)段序列連接在一起，分別作為胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種經(jīng)VC-CAR分子改造的CD8⁺T細(xì)胞。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種經(jīng)VC-CAR分子改造的CD8⁺T細(xì)胞在清除HIV-1感染細(xì)胞的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

SEQ ID NO：1所示的HIV-1廣譜中和抗體VRC01來源的scFv序列在作為CAR分子的胞外抗原結(jié)合域中的應(yīng)用。

一種VC-CAR分子，由SEQ ID NO：1所示的HIV-1廣譜中和抗體VRC01來源的scFv序列和CAR分子的胞內(nèi)段序列連接而成，HIV-1廣譜中和抗體VRC01來源的scFv序列在N端，CAR分子胞內(nèi)段序列在C端。

優(yōu)選地，一種VC-CAR分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。SEQ ID NO：2所示的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)如圖1中的VR C01-28BBZ-1所示；SEQ ID NO：3所示的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)如圖1中的VR C01-28BBZ-2所示；SEQ ID NO：4所示的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)如圖1中的VR C01-28BBZ-3所示。

更優(yōu)選地，一種VC-CAR分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

一種改造的CD8⁺T細(xì)胞，具體為使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的VC-CAR分子轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8⁺T細(xì)胞制備得到。VC-CAR改造的CD8⁺細(xì)胞介導(dǎo)表達(dá)gp120細(xì)胞系的裂解效果更加明顯。

本發(fā)明還要求保護(hù)以VC-CAR分子改造的CD8⁺T細(xì)胞在清除HIV-1感染細(xì)胞的應(yīng)用。

一種改造的CD8⁺T細(xì)胞，由以下方法制備得到：(1)收集外周血單個(gè)核細(xì)胞并分離富集其中的CD8⁺T細(xì)胞，利用anti-CD3、anti-CD28和IL-2激活CD8⁺T細(xì)胞；(2)細(xì)胞激活48小時(shí)后，以1ml/1×10⁶細(xì)胞的比例加入VC-CAR分子重組的病毒濃縮液進(jìn)行感染，同時(shí)加入聚凝胺溶液，離心后繼續(xù)培養(yǎng)；8～12小時(shí)后，進(jìn)行第二輪病毒感染。

優(yōu)選地，所述anti-CD3的濃度為1μg/mL，anti-CD28的濃度為1μg/mL，IL-2的濃度為10ng/mL。

優(yōu)選地，所述聚凝胺溶液的濃度為8μg/mL。

一種擴(kuò)增VC-CAR分子改造的CD8⁺T細(xì)胞的方法，包括如下步驟：(1)CD8⁺T細(xì)胞被VC-CAR分子重組的病毒感染改造后的12小時(shí)，離心換液，洗去培養(yǎng)基中的病毒，以新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加入IL-2和IL-7保持細(xì)胞狀態(tài)；(2)病毒感染改造后的第3天和第5天，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況，對(duì)細(xì)胞添加完全RMPI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度維持在2×10⁶/ml，并補(bǔ)充IL-2和IL-7，繼續(xù)培養(yǎng)并及時(shí)傳代，進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述IL-2的濃度為10ng/mL，IL-7的濃度為10ng/mL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明中全新改造的VC-CAR-T細(xì)胞與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的細(xì)胞系或HIV-1感染的CD4⁺T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，VC-CAR-T細(xì)胞可以被特異性激活并大量分泌細(xì)胞毒性相關(guān)的細(xì)胞因子(包括IFN-γ、和Granzyme B)，進(jìn)而強(qiáng)有力地介導(dǎo)靶細(xì)胞的裂解。

本發(fā)明中全新改造的VC-CAR-T細(xì)胞相比已報(bào)道的CD4-CAR-T細(xì)胞，VC-CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)表達(dá)gp120細(xì)胞系的裂解效果更加明顯。

本發(fā)明使用的IL-2+IL-7細(xì)胞因子組合，相比單獨(dú)施加IL-2的傳統(tǒng)擴(kuò)增方法，可以進(jìn)一步提高HIV-1感染患者CD8⁺T細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。

附圖說明

圖1為構(gòu)建的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為pCPPT-IRES-mStrewbeery慢病毒載體結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為VC-CAR在CD8⁺T細(xì)胞中的表達(dá)情況。

圖4為VC-CAR和CD4-CAR改造的CD8⁺T細(xì)胞分別與靶細(xì)胞系混合后殺傷效果的比較。

圖5為VC-CAR-T細(xì)胞與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的靶細(xì)胞系混合培養(yǎng)后，IFN-γ和Granzyme-B的分泌情況。

圖6為VC-CAR-T細(xì)胞與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的靶細(xì)胞系混合培養(yǎng)后，通過檢測LDH的釋放，檢測VC-CAR-T細(xì)胞的殺傷活性。

圖7為VC-CAR-T細(xì)胞與野生型HIV-1_NL4-3感染的CD4⁺T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，通過流式檢測Gag⁺CD4⁺T淋巴細(xì)胞的比例。驗(yàn)證VC-CAR-T細(xì)胞的殺傷活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1

一種以VRC01為胞外抗原結(jié)合域的VC-CAR分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。SEQ ID NO：2所示的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)如圖1中的VR C01-28BBZ-1所示；SEQ ID NO：3所示的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)如圖1中的VR C01-28BBZ-2所示；SEQ ID NO：4所示的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)如圖1中的VR C01-28BBZ-3所示。

HIV-1廣譜中和抗體VRC01來源的scFv序列如SEQ ID NO：1所示。

下面以SEQ ID NO：4所示的VC-CAR分子詳細(xì)介紹一下本發(fā)明的VC-CAR分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。VC-CAR分子的序列N’端是HIV-1廣譜中和抗體VRC01來源的scFv序列，可特異性結(jié)合病毒包膜蛋白的CD4結(jié)合域；VC-CAR分子序列C’端是以三代CAR結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，包括CD28(nucleotides 460-660,GenBank NM_006139.3)，CD137(nucleotides 640-765,GenBank NM_001561.5)和CD3ζ(nucleotides 160-492,Genbank NM_198053.2)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成，通過CD28分子的跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)cFv和胞內(nèi)信號(hào)分子相連。

實(shí)施例2

一、VC-CAR分子重組pCPPT-IRES-mStrewbeery慢病毒載體：按照SEQ ID NO：4所示序列合成VC-CAR，合成的VC-CAR通過NheI和NotI雙酶切，插入pCPPT-IRES-mStrewbeery慢病毒載體中(見圖2)，酶切、連接的具體步驟參考本領(lǐng)域的常規(guī)方法；得到VC-CAR分子重組后的pCPPT-IRES-mStrewbeery慢病毒載體。

將一個(gè)生長狀態(tài)的HEK293T細(xì)胞平均鋪于用多聚賴氨酸處理的10cm培養(yǎng)皿中(細(xì)胞密度約為6.5×10⁴/cm²)，要求細(xì)胞呈單個(gè)均勻分布。培養(yǎng)約24小時(shí)后，細(xì)胞匯合度應(yīng)接近80％，此時(shí)各皿均以12ml完全培養(yǎng)基換液，同時(shí)加入3.75ul氯喹(100mM，4000×)。換液后按表1配制磷酸鈣-DNA混合液，顛倒數(shù)次混勻后靜置1分鐘，然后以3ml/皿迅速加入各皿細(xì)胞培養(yǎng)液中，邊加邊搖勻，逐滴快速加入。

表1為磷酸鈣-DNA混合液體系配方

轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，細(xì)胞匯合度應(yīng)接近100％，此時(shí)各皿均以12ml新鮮培養(yǎng)基換液，同時(shí)加入90μl丁酸鈉(1M，100×)。轉(zhuǎn)染后約48小時(shí)，收集全部34ml HEK293T細(xì)胞上清液，以0.45μm的過濾器過濾后裝入50ml離心管，按下表2比例加入PEG-NaCl-PBS混合液，顛倒混勻后于4℃放置1.5小時(shí)，期間每20～30分鐘混勻一次或顛倒混勻后于4℃放置過夜。

表2

將混合液于4℃，7000g離心10分鐘，管壁上可見白色沉淀，小心去除全部上清液，加入適量體積(300ul～3ml)的新鮮培養(yǎng)基，輕輕搖晃使沉淀溶解，即得到VC-CAR分子重組的病毒濃縮液，立即使用或分裝后于-80℃保存。

二、VC-CAR在CD8⁺T細(xì)胞中的表達(dá)情況：從外周血樣本中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后通過偶聯(lián)生物素的CD8抗體分離富集CD8⁺T淋巴細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心。用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸，然后按2×10⁶/ml的細(xì)胞濃度，均勻鋪至細(xì)胞培養(yǎng)板中。利用anti-CD3(終濃度為1μg/ml)、anti-CD28(終濃度為1μg/ml)抗體和IL2(終濃度為10ng/ml)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激，作用48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用于假病毒的感染。

取適量生長狀態(tài)良好的目標(biāo)細(xì)胞懸液，放入離心管中300g離心5分鐘。棄去上清液，以1ml/1×10⁶細(xì)胞的比例加入假病毒濃縮液，同時(shí)加入終濃度8μg/ml的Polybrene，輕輕吹打混勻。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)皿，37℃、350×g離心90分鐘，離心結(jié)束后，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。約8～12小時(shí)后，進(jìn)行第二輪感染，步驟同上，約12小時(shí)后，離心換液，用PBS洗去培養(yǎng)基中的病毒，以新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加入終濃度均為10ng/ml的IL-2和IL-7保持細(xì)胞狀態(tài)。繼續(xù)培養(yǎng)并及時(shí)傳代，進(jìn)一步擴(kuò)增細(xì)胞。感染后的第3天，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)和增殖情況，對(duì)細(xì)胞添加完全RMPI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度維持在2×10⁶/ml。并補(bǔ)充IL-2和IL-7，終濃度均為10ng/ml。感染后的第5天，按照第3天的流程繼續(xù)擴(kuò)增細(xì)胞。并利用流式檢測熒光蛋白mStrewbeery的表達(dá)，確定VC-CAR的感染效率，通常需確保感染率達(dá)到50％以上(圖3)。感染后的第5天，細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測或繼續(xù)培養(yǎng)以及凍存。此后，為了方便起見，以下實(shí)驗(yàn)均稱其為VC-CAR-T細(xì)胞。

實(shí)施例3

一、VC-CAR和CD4-CAR改造的CD8⁺T細(xì)胞分別與靶細(xì)胞系混合后殺傷效果的比較：早前有研究利用CD4分子的胞外結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，構(gòu)建CAR-T細(xì)胞(CD4-CAR-T細(xì)胞)。由于CD4分子是HIV-1包膜糖蛋白gp120的天然受體，CD4-CAR-T細(xì)胞能夠裂解表達(dá)gp120的靶細(xì)胞。為了對(duì)比VC-CAR-T細(xì)胞和CD4-CAR-T細(xì)胞效應(yīng)，我們根據(jù)前人報(bào)道，將VC-CAR的scFv序列替換為CD4分子的胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了CD4-CAR。以同樣的條件轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8⁺T淋巴細(xì)胞，然后與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的靶細(xì)胞系(Jurkat-gp160_NL4-3)混合，在U形底的96孔板中進(jìn)行細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。靶細(xì)胞數(shù)量為10⁴/孔，RMPI1640完全培養(yǎng)基體積為200μl/孔。在給定的效靶比范圍內(nèi)(8：1至2：1)，24小時(shí)后，通過檢測乳酸脫氫酶的釋放，以確定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過改造CD8⁺T淋巴細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果顯示：VC-CAR-T細(xì)胞比CD4-CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的靶細(xì)胞裂解能力。該結(jié)果可能的原因?yàn)镠IV-1廣譜中和抗體來源的scFv對(duì)HIV-1gp120親和力強(qiáng)于天然的CD4分子(見圖4)。

二、VC-CAR-T細(xì)胞與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的靶細(xì)胞系混合培養(yǎng)后特異性細(xì)胞因子的分泌情況：為了進(jìn)一步檢測VC-CAR的功能，我們將VC-CAR-T細(xì)胞與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的細(xì)胞系Jurkat-gp160_NL4-3在預(yù)包被IFN-γ抗體的96孔PVDF板中進(jìn)行混合培養(yǎng)，效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量為10⁴/孔，在給定的效靶比范圍內(nèi)(4：1和2：1)，24小時(shí)后，利用ELIspot實(shí)驗(yàn)檢測VC-CAR-T細(xì)胞IFN-γ的分泌。結(jié)果顯示：與兩株靶細(xì)胞混合培養(yǎng)的VC-CAR-T細(xì)胞IFN-γ的分泌顯著提高，而與HIV-1包膜蛋白陰性的對(duì)照細(xì)胞系Jurkat-GFP混合培養(yǎng)的VC-CAR-T細(xì)胞則不會(huì)分泌IFN-γ。另一方面，與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的靶細(xì)胞系混合培養(yǎng)的對(duì)照效應(yīng)細(xì)胞沒有明顯的IFN-γ分泌，從而進(jìn)一步證明IFN-γ的分泌是VC-CAR-T細(xì)胞特異性的(圖5)。

將VC-CAR-T細(xì)胞與Jurkat-gp160_NL4-3分別混合培養(yǎng)24小時(shí)，在給定的效靶比范圍內(nèi)(4：1-2：1)，granzyme B的ELISA實(shí)驗(yàn)也顯示，隨著靶細(xì)胞增加(Jurkat-gp160_NL4-3)，VC-CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌量會(huì)以劑量依賴的方式隨之增加，而對(duì)照靶細(xì)胞(Jurkat-GFP)則不會(huì)刺激VC-CAR-T細(xì)胞分泌IL-2和granzyme B。結(jié)果說明，在特異性抗原刺激下，VC-CAR-T細(xì)胞具有高效分泌抗病毒細(xì)胞因子的能力(圖5)。

三、VC-CAR-T細(xì)胞與表達(dá)HIV-1包膜蛋白的靶細(xì)胞系混合培養(yǎng)后殺傷活性的檢測：為了進(jìn)一步檢測VC-CAR的功能，我們將VC-CAR-T細(xì)胞與兩株表達(dá)HIV-1包膜蛋白的細(xì)胞系Jurkat-gp160_NL4-3和Jurkat-gp160_BaL分別進(jìn)行混合培養(yǎng)，在U形底的96孔板中進(jìn)行細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。靶細(xì)胞數(shù)量為10⁴/孔，RMPI1640完全培養(yǎng)基體積為200μl/孔。在給定的效靶比范圍內(nèi)(8：1-0.5：1)，24小時(shí)后，通過LDH的釋放，我們檢測VC-CAR-T細(xì)胞對(duì)HIV-1包膜蛋白表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示：在從8：1到0.5：1的效靶比區(qū)間范圍內(nèi)，VC-CAR-T細(xì)胞以劑量依賴的方式顯著殺傷兩株表達(dá)HIV-1gp120的靶細(xì)胞(Jurkat-gp160_NL4-3和Jurkat-gp160_BaL)，而對(duì)照靶細(xì)胞(Jurkat-GFP)沒有顯著的殺傷效果，說明VC-CAR-T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞作用是HIV-1gp120特異性的。無論Jurkat-gp160_NL4-3和Jurkat-gp160_BaL還是對(duì)照靶細(xì)胞Jurkat-GFP，對(duì)照效應(yīng)細(xì)胞均沒有顯示明顯殺傷作用，從而進(jìn)一步說明了VC-CAR-T細(xì)胞作用的特異性(圖6)。

四、VC-CAR-T細(xì)胞與野生型HIV-1_NL4-3感染的CD4⁺T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)后殺傷活性的檢測：為了進(jìn)一步證明在清除野生型HIV-1感染的細(xì)胞方面VC-CAR-T細(xì)胞的有效性，利用野生型HIV-1_NL4-3，對(duì)健康人血液樣本中分離的CD4⁺T淋巴細(xì)胞進(jìn)行感染。進(jìn)行感染時(shí)RMPI1640完全培養(yǎng)基的體積為1ml/孔(24孔板)，包含2×10⁶細(xì)胞，對(duì)應(yīng)200ng(p24)的野生型病毒。感染后3小時(shí)換液。感染后的第8天，該細(xì)胞與VC-CAR改造的同源CD8⁺T淋巴細(xì)胞以1：2和1：4的比例混合，在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。靶細(xì)胞數(shù)量為10⁶/孔，RMPI1640完全培養(yǎng)基體積為500μl/孔。48小時(shí)后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Gag⁺CD4⁺T淋巴細(xì)胞的比例，驗(yàn)證VC-CAR-T細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示：VC-CAR-T細(xì)胞對(duì)HIV-1感染的細(xì)胞的清除率高達(dá)78％，表現(xiàn)了顯著的殺傷效果，同時(shí)對(duì)照效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)值不足30％，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大學(xué)

<120> 一種VC-CAR分子及在清除 HIV-1感染細(xì)胞中的應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 735

<212> DNA

<213> VRC01

<400> 1

atggaaattg tgttgacaca gtctccaggc accctgtctt tgtctccagg ggaaacagcc 60

atcatctctt gtcggaccag tcagtatggt tccttagcct ggtatcaaca gaggcccggc 120

caggccccca ggctcgtcat ctattcgggc tctactcggg ccgctggcat cccagacagg 180

ttcagcggca gtcggtgggg gccagactac aatctcacca tcagcaacct ggagtcggga 240

gattttggtg tttattattg ccagcagtat gaattttttg gccaggggac caaggtccag 300

gtcgacatta agcgagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 360

cctggccagg tgcagctggt gcagtctggg ggtcagatga agaagcctgg cgagtcgatg 420

agaatttctt gtcgggcttc tggatatgaa tttattgatt gtacgctaaa ttggattcgt 480

ctggcccccg gaaaaaggcc tgagtggatg ggatggctga agcctcgggg gggggccgtc 540

aactacgcac gtccacttca gggcagagtg accatgactc gagacgttta ttccgacaca 600

gcctttttgg agctgcgctc gttgacagta gacgacacgg ccgtctactt ttgtactagg 660

ggaaaaaact gtgattacaa ttgggacttc gaacactggg gccggggcac cccggtcatc 720

gtctcatcag aattc 735

<210> 2

<211> 1656

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2