本發(fā)明涉及一種基質(zhì)細(xì)胞衍生因子，特別涉及一種與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心肌梗死是全球范圍內(nèi)死亡率極高的一種疾病，其發(fā)病主要是由于心臟動(dòng)脈血管堵塞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞因缺血缺氧而壞死，進(jìn)而引起纖維化使心臟功能受損。心肌組織再生能力較弱，一旦發(fā)生壞死或凋亡很難修復(fù)，心臟功能受到不可逆轉(zhuǎn)的損壞，嚴(yán)重影響病人的壽命和生活質(zhì)量。目前臨床上主要通過冠狀動(dòng)脈搭橋的救治方法，但是這種方法僅能緩解病人的痛苦，并不能使已經(jīng)因缺血壞死的心肌組織重新再生，因此不能從根本上解決心臟功能受損的問題。

隨著干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞治療作為一種新的治療方案，在許多疾病中發(fā)揮重要作用。干細(xì)胞是一種具有自我更新能力并且具有多向分化潛能的細(xì)胞群體，根據(jù)其分化潛能又可分為全能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞。全能干細(xì)胞主要指胚胎干細(xì)胞，其可分化為全身各種類型的組織細(xì)胞甚至是完整的個(gè)體；而多能干細(xì)胞也是成體干細(xì)胞可定向分化為特定組織的幾種功能細(xì)胞。隨著對(duì)干細(xì)胞的深入研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)各種組織內(nèi)都存在特異的組織干細(xì)胞，比如造血干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞以及心肌干細(xì)胞等，這些干細(xì)胞在維持組織再生及損傷后修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。在通常情況下，這些干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，一旦組織受損，在各種信號(hào)的刺激下，這些干細(xì)胞會(huì)立即活化并向受損組織遷移，通過分泌各種營(yíng)養(yǎng)因子及分化為組織特異性的功能細(xì)胞來(lái)促進(jìn)組織的修復(fù)。

對(duì)于一些再生能力較強(qiáng)的組織來(lái)說，其干細(xì)胞數(shù)量較多，一旦組織受損，可以盡快分化成功能細(xì)胞，替換壞死的細(xì)胞。但是像心肌、神經(jīng)等再生能力較弱的組織，其組織內(nèi)干細(xì)胞的數(shù)量較少，難以達(dá)到組織修復(fù)的目的。近年研究發(fā)現(xiàn)，通過移植外源性干細(xì)胞到受損的心肌組織，對(duì)心肌梗死的治療有一定的效果。但是移植外源干細(xì)胞存在許多問題，主要包括外源干細(xì)胞移植到心肌梗死部位存活率較低、流失掉、感染以及免疫排斥等問題，并且外源干細(xì)胞難以分化成心肌細(xì)胞及與內(nèi)源性心肌細(xì)胞形成功能連接。

因此，通過動(dòng)員內(nèi)源性干細(xì)胞向受損組織遷移及募集，可以避免移植外源干細(xì)胞帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，提高干細(xì)胞的利用效率。SDF-1α是一種趨化因子，其特異性受體CXCR4是一種G蛋白偶聯(lián)受體，表達(dá)于多種干細(xì)胞膜表面，如：造血干細(xì)胞(HSC)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、心肌干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞等成體干細(xì)胞。SDF-1α-CXCR4反應(yīng)軸可以促進(jìn)干細(xì)胞的遷移、增殖及具有抗凋亡的效應(yīng)，并且SDF-1α?xí)龠M(jìn)干細(xì)胞分泌多種生長(zhǎng)因子如VEGF、EGF、FGF等，以及促進(jìn)血管新生。

研究發(fā)現(xiàn)心肌以及神經(jīng)等組織受損以后，SDF-1α的表達(dá)會(huì)上調(diào)，動(dòng)員內(nèi)源性干細(xì)胞向受損部位遷移，促進(jìn)組織修復(fù)及血管再生。通過在受損組織內(nèi)注射天然的SDF-1α，也可以提高干細(xì)胞向受損組織遷移的數(shù)量從而促進(jìn)組織修復(fù)。但是，天然的SDF-1α在組織內(nèi)受體液的沖刷很快會(huì)彌散掉，降低損傷部位的局部有效濃度從而降低其治療效果；另外，彌散掉的SDF-1α?xí)谎杆俳到?，?duì)周圍組織產(chǎn)生一定的副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(如下簡(jiǎn)稱CBD-SDF-1α)及其制備方法與應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

一種與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子，其包含基質(zhì)細(xì)胞衍化生長(zhǎng)因子1α(SDF1α)及具有膠原特異結(jié)合能力的多肽，并具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

該氨基酸序列具體如下：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMKPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKGSAGSAAGSGGTKKTLRT。

編碼所述與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的多核苷酸。

進(jìn)一步的，所述多核苷酸還具有SEQ ID NO：1所示的序列。

一種包含所述多核苷酸的表達(dá)載體。

進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體優(yōu)選自但不限于pET28a載體。

在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是能夠在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)靶蛋白或靶RNA的載體。本發(fā)明的核苷酸序列可存在于載體中，其中該核苷酸序列可操作地連接至能夠提供用于通過適合的宿主細(xì)胞表達(dá)該核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列。在表達(dá)載體范疇中，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指感興趣的核苷酸序列以允許核苷酸表達(dá)的方式連接至(一個(gè)或多個(gè))調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ) “調(diào)節(jié)序列(或調(diào)控序列)”意在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及其它表達(dá)控制元件。與表達(dá)載體的這種可操作連接能夠通過本領(lǐng)域中已知的常規(guī)基因重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)。

用于本發(fā)明的表達(dá)載體可包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、病毒載體等，但并不局限于此。用于本發(fā)明中的表達(dá)載體可包含用于膜靶向或分泌的信號(hào)序列或前導(dǎo)序列、以及調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷化信號(hào)、增強(qiáng)子等。啟動(dòng)子可以是組成性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。而且，表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)用于選擇包含該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的可選擇標(biāo)記基因，并且可進(jìn)一步包括使得該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的核苷酸序列。

一種包含所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。

進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)化體包括大腸桿菌BL21，但不限于此。

一種生產(chǎn)與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的方法，其包括：培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化體。

具體而言，本發(fā)明可以通過在適合的條件下在適合的介質(zhì)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，用于在引入到該轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)載體中表達(dá)所述CBD-SDF-1α而實(shí)施。通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體而表達(dá)重組蛋白的方法在本領(lǐng)域中已熟知，例如可以通過在適于轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)的介質(zhì)(或培養(yǎng)基)中接種轉(zhuǎn)化體(或轉(zhuǎn)化株)、進(jìn)行傳代培養(yǎng)(subculture)、將其轉(zhuǎn)移至主要培養(yǎng)基中、在適合的條件下培養(yǎng)，例如補(bǔ)充有基因表達(dá)誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，從而誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)而得以實(shí)施。在培養(yǎng)完成后，可以從培養(yǎng)液中獲得“基本上純的”重組蛋白。前述“基本上純的”是指本發(fā)明的重組蛋白和編碼其的多核苷酸在實(shí)施和使用它們的計(jì)劃用途的程度上基本上沒有在天然或體內(nèi)系統(tǒng)中可以發(fā)現(xiàn)的其它物質(zhì)。

如上獲得的本發(fā)明的重組蛋白可以從宿主細(xì)胞內(nèi)部或外部(例如，介質(zhì))分離，并純化為基本上純的同源性多肽。用于多肽分離和純化的方法不局限于任何特定的方法。實(shí)際上，可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法。例如，色譜(或?qū)游?法、過濾器、超濾、鹽析溶劑沉淀、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳、透析和結(jié)晶可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇和組合以分離和純化多肽。關(guān)于色譜法，例如可以使用親和性色譜、離子交換色譜、疏水性色譜、凝膠過濾色譜、反相色譜、吸附色譜等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；Guide to Protein PurificationMethods Enzymology vol.182.Academic Press.Inc.，San Diego，CA，1990)。

所述與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子于制備生物功能材料、細(xì)胞捕捉試劑、細(xì)胞檢 測(cè)試劑或藥物中的應(yīng)用。

所述與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子作為心機(jī)梗死治療藥物的用途。

一種細(xì)胞捕捉試劑，其包含所述的與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子。

一種細(xì)胞檢測(cè)試劑，其包含所述的與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子。

所述的細(xì)胞，包括含有特異性受體CXCR4的各類細(xì)胞，特別是干細(xì)胞膜，例如造血干細(xì)胞(HSC)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、心肌干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞等成體干細(xì)胞。

一種生物工程組織材料，其包含所述的與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子。

所述生物工程組織材料包括生物組織修復(fù)材料，人工生物組織等等。

所述與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子在制備心機(jī)梗死治療藥物中的應(yīng)用。

所述與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子在制備刺激血管再生的藥物中的應(yīng)用。

所述與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子在制備促進(jìn)心臟組織修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。

一種藥物組合物，包含作為有效成分的所述與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子。

進(jìn)一步的，所述藥物組合物還可包含藥學(xué)可接受的載體。

本說明書中所述的“藥用載體”具有本領(lǐng)域人員熟知的含義，其可包括任何及所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細(xì)菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘結(jié)劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料、類似物質(zhì)及它們的組合。

本發(fā)明的藥物組合物可以采用多種形式給藥，例如可以通過注射給藥，優(yōu)選的，本發(fā)明的所述CBD-SDF-1α可配制在水溶液，特別是生理兼容性緩沖液或生理鹽水緩沖液中。這些注射制劑可以通過常規(guī)方法利用一種或多種分散劑、潤(rùn)濕劑和懸浮劑進(jìn)行配制。

本發(fā)明CBD-SDF-1α的總有效量能夠以單一劑量給予患者或者通過分開的治療方案進(jìn)行給藥，其中多個(gè)劑量在更長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行給藥。盡管在本發(fā)明的藥物組合物中CBD-SDF-1α的量可依賴于疾病的嚴(yán)重程度可變化。一般來(lái)說，本發(fā)明的藥物組合物中重組蛋白的適合劑量可取決于多種因素，如患者的年齡、體重、健康狀態(tài)、性別、疾病嚴(yán)重程度、飲食和排泄，以及給藥途徑和待給藥的治療數(shù)目。鑒于上述因素，本領(lǐng)域中的任何技術(shù)人員可確定作為藥物有效成分的CBD-SDF-1α的有效劑量。

本發(fā)明通過基因工程的方法構(gòu)建表達(dá)CBD(膠原結(jié)合域，Collagen-binding domain，一種來(lái)源于膠原酶的、可與膠原特異性結(jié)合的多肽)與SDF-1α融合蛋白的表達(dá)載體，并且在大腸桿菌中表達(dá)，由此所獲CBD-SDF-1α在體外可以與膠原特異性結(jié)合并且緩慢釋放，并具有 與天然的SDF-1α在趨化MSC及HSC遷移方面相近的生物學(xué)活性，且在體外與膠原結(jié)合后，可以捕獲更多的MSC及HSC。例如，在心肌梗死模型中，CBD-SDF-1α注射到心肌梗死部位后，可以特異性結(jié)合到心肌梗死部位并且緩慢釋放，提高了其局部治療濃度，避免了擴(kuò)散導(dǎo)致的副作用，節(jié)省藥物用量及費(fèi)用；CBD-SDF-1α可以促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞向心肌梗死部位遷移、促進(jìn)梗死區(qū)域血管再生及改善心肌梗死后的心臟功能。除此之外，本發(fā)明的CBD-SDF-1α還可以用于神經(jīng)、骨頭及皮膚等其它組織的修復(fù)，另外可以用于修飾不同的膠原支架材料或者構(gòu)建不同的功能化生物活性支架材料。

附圖說明

圖1A是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的構(gòu)建示意圖，其中膠原結(jié)合區(qū)(collagen binding domain，CBD)通過一個(gè)linker連接融合到SDF-1α的C-末端。

圖1B-圖1C分別是本發(fā)明一典型實(shí)施例中采用Tricine-SDS-PAGE方法和Western blot方法對(duì)純化獲得的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的體外鑒定圖。

圖1D是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α與膠原的結(jié)合曲線圖。

圖1E是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α的解離曲線圖。

圖1F是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α從膠原的緩釋曲線圖。

圖2A-圖2B分別是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α與NAT-SDF-1α趨化MSC和HSC遷移的生物活性比較圖，圖2A示出CBD-SDF-1α可以趨化MSC的遷移，其活性與NAT-SDF-1α無(wú)顯著性差異，圖2B示出CBD-SDF-1α可以趨化HSC的遷移，其活性與NAT-SDF-1α無(wú)顯著性差異。

圖3A-圖3D分別是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α修飾膠原凝膠對(duì)MSC和HSC的粘附能力的熒光照片及統(tǒng)計(jì)分析圖。

圖4A-圖4C分別是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α在心肌梗死區(qū)域結(jié)合并且緩慢釋放的測(cè)視圖，其中圖4A及圖4B(Western blot測(cè)試)顯示，在注射3h和6h時(shí)，仍有大量的CBD-SDF-1α結(jié)合在心肌梗死部位,局部濃度較高；而NAT-SDF-1α在三小時(shí)時(shí)已經(jīng)大量彌散掉，在6小時(shí)時(shí)幾乎檢測(cè)不到，圖4C示出了在3h和6h檢測(cè)各組血清中SDF-1α的濃度，可以發(fā)現(xiàn)NAT-SDF-1α組比CBD-SDF-1α組血清中SDF-1α的濃度高很多，說明NAT-SDF-1α注射到梗死區(qū)后因不能與膠原結(jié)合，迅速?gòu)浬⒌舨⑦M(jìn)入外周血。

圖5A-圖5B分別是本發(fā)明一典型實(shí)施例中CBD-SDF-1α可促進(jìn)c-kit⁺的內(nèi)源性干細(xì)胞 向心肌梗死區(qū)域遷移的熒光測(cè)試圖及統(tǒng)計(jì)圖，其中圖5A示出注射細(xì)胞因子4d后c-kit⁺干細(xì)胞的免疫熒光染色，可以發(fā)現(xiàn)CBD-SDF-1α組c-kit⁺干細(xì)胞數(shù)量比NAT-SDF-1α組多，說明CBD-SDF-1α與膠原結(jié)合并緩慢釋放可增強(qiáng)內(nèi)源性干細(xì)胞的募集效果，圖5B顯示CBD-SDF-1α募集的內(nèi)源性干細(xì)胞的數(shù)量大約是NAT-SDF-1α組的兩倍。

圖6A-圖6C是本發(fā)明一典型實(shí)施例中治療后梗死區(qū)域的面積及心肌壁的厚度的Masson染色圖及統(tǒng)計(jì)圖，可以看出CBD-SDF-1α治療組梗死區(qū)域纖維化程度明顯減少，心肌壁的厚度有所增加。

圖7A-圖7B是本發(fā)明一典型實(shí)施例中梗死區(qū)域血管的再生清關(guān)的vWF免疫組化染色圖及統(tǒng)計(jì)圖，CBD-SDF-1α組比NAT-SDF-1α組微血管的數(shù)量要多，說明CBD-SDF-1α可以促進(jìn)血管新生。

注：圖1A-圖1F中，^**P<0.01。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過將可與膠原結(jié)合的特異性多肽和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子進(jìn)行融合表達(dá)，獲得了可與膠原特異性結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(CBD-SDF-1α)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CBD-SDF-1α可與膠原特異性結(jié)合并且緩慢釋放；并且CBD-SDF-1α和天然的SDF-1α具有相同的生物學(xué)活性，可以趨化干細(xì)胞的遷移；例如，通過大鼠心肌梗死模型研究表明，CBD-SDF-1α可以與心肌梗死部位結(jié)合，并且緩慢釋放，提高了損傷部位的SDF-1α濃度；CBD-SDF-1α可以促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞向心肌梗死部位遷移、改善梗死部位的纖維化狀態(tài)、促進(jìn)梗死部位血管再生以及改善心臟功能。

如下結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1.CBD-SDF-1α在大腸桿菌中的高效表達(dá)及純化

CBD-SDF-1α表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)化

參閱圖1A，從Genbank中查找獲得人SDF-1α的成熟肽基因序列，從人成纖維細(xì)胞總mRNA中擴(kuò)增獲得SDF-1α成熟肽基因，通過PCR的方法將CBD序列及l(fā)inker序列拼接到SDF-1α序列的C-末端，在引物中引入Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)，通過雙酶切的方法將CBD-SDF-1α基因插入到pET28a載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，涂布到含有卡那霉素(Kana)抗性的LB平板上，挑選陽(yáng)性克隆，通過基因測(cè)序的方法鑒定陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒備用。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株大腸桿菌BL21中，通過Kana抗性的LB平板篩選陽(yáng) 性克隆。挑選陽(yáng)性克隆放到含Kana抗性的5ml LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床中，以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12h后，加入終濃度為10％的甘油，-80℃凍存保種。

CBD-SDF-1α的表達(dá)及純化

將表達(dá)CBD-SDF-1α的BL21表達(dá)菌種涂布到Kana抗性的LB平板上，挑選陽(yáng)性克隆到Kana抗性的5ml LB液體培養(yǎng)中，在37℃的恒溫?fù)u床中以200rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)12小時(shí)；然后將這5ml菌液轉(zhuǎn)接到含kana抗性的200mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中放大培養(yǎng)，以同樣的溫度和轉(zhuǎn)速在恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)，待培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0.6～0.8之間時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)5h后，10000g、4℃離心10min收集菌體。用20ml PBS重選菌體，然后在冰上以150w的功率，超聲20min破碎菌體，12000g、4℃離心20min收集包涵體。將包涵體重懸于20ml的包涵體洗滌液中(2M urea,20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,2％Triton-X 100，pH 8.0)，在相同的超聲條件下超聲5min,重復(fù)三次，充分洗滌包涵體。將洗凈的包涵體溶解后，通過AKTA prime plus 5.0系統(tǒng)利用鎳親和層析柱(His-Trap affinity columns，GE)采用柱上復(fù)性的方法對(duì)進(jìn)行純化。純化獲得的目的蛋白通過Tricine-SDS-PAGE及Western blot的方法進(jìn)行鑒定。洗脫的蛋白在PBS中充分透析后，通過超濾濃縮的方法進(jìn)行濃縮(超濾膜分子量5kDa)，然后BCA試劑盒測(cè)定其濃度，0.22μm濾膜過濾除菌后分裝凍存于-80℃；24小時(shí)后在凍干機(jī)中凍干過夜，凍干粉保存于-80℃。圖1B-圖1C中為凍干粉重新溶解后的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α(同樣方法制備的天然的SDF-1α)的電泳(圖1B)及WB(圖1C)鑒定圖，可見獲得了純度較高的CBD-SDF-1α和NAT-SDF-1α。

實(shí)施例2CBD-SDF-1α體外活性的鑒定

CBD-SDF-1α與膠原特異性結(jié)合及緩慢釋放

將濃度為100μg/mL的鼠尾膠原溶液加入到96孔中(100μL/孔)，置于4℃冰箱中過夜，棄去多余的膠原，將96孔板在超凈臺(tái)中晾干，用預(yù)冷的PBS洗三遍后備用。分別將不同濃度的NAT-SDF-1α和CBD-SDF-1α加入到96孔板中(100μL/孔)，37℃孵育2h,PBS洗3遍；加入mouse anti-polyhistine單克隆抗體(1:2000，abcam)，4℃孵育2h,然后用預(yù)冷的PBS洗三遍；加入HRP標(biāo)記的anti-mouse IgG(1:10000，abcam),37℃孵育1h，PBS洗三遍。然后加入100μL TMB顯色底物，反應(yīng)30min,最后加入100μL的1M H₂SO₄，酶聯(lián)儀450nm測(cè)吸光度。結(jié)果使用GraphPad Prism 5.0軟件分析，繪制結(jié)合解離曲線(圖1D，圖1E)。NAT-SDF-1α和CBD-SDF-1α解離常數(shù)分別為：1.339mM和0.254μM，說明CBD-SDF-1α與膠原具有更強(qiáng)的結(jié)合能力。

按照結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法，先將NAT-SDF-1α和CBD-SDF-1α與膠原包被的96孔板進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，然后在96孔板中加入PBS(200μL/孔)，放在37℃培養(yǎng)箱中輕柔搖晃，每隔24h取樣，然后再加入新的PBS，持續(xù)8天，用人SDF-1α試劑盒檢測(cè)樣品中SDF-1α的濃度，并且繪制釋放曲線。從圖1F中可以看到，NAT-SDF-1α?xí)芸灬尫诺簦鳦BD-SDF-1α可以緩慢釋放，到第8天滯留在膠原上的CBD-SDF-1α仍有56.1％，而NAT-SDF-1α僅剩10.1％，以上數(shù)據(jù)說明CBD-SDF-1α可以與膠原特異性結(jié)合并且緩慢釋放。

CBD-SDF-1α對(duì)MSC及HSC的趨化遷移效應(yīng)

通過Transwell(孔徑為8μm)的方法檢測(cè)CBD-SDF-1α對(duì)MSC及HSC的趨化遷移能力，將200μL細(xì)胞濃度為2×10⁴/mL的細(xì)胞懸液加入到transwell的上室中，在下室中加入含NAT-SDF-1α或CBD-SDF-1α終濃度為100ng/mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基600μL，37℃，CO₂培養(yǎng)箱中靜置5h，取出小室，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞，然后用4％多聚甲醛固定小室，結(jié)晶紫染色遷移的細(xì)胞，在正置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。從圖2A-圖2B可以看到，CBD-SDF-1α與NAT-SDF-1α在趨化MSC和HSC遷移方面具有相似的生物學(xué)活力，說明CBD-SDF-1α在增加膠原結(jié)合能力的同時(shí)，并未影響其趨化因子的生物學(xué)活性。

CBD-SDF-1α與膠原結(jié)合后對(duì)干細(xì)胞的捕捉作用

首先用膠原溶液包被24孔板，然后分別將濃度為100ug/mL的NAT-SDF-1α或CBD-SDF-1α溶液加入到24孔板中(200μL/孔)，37℃靜置2h后，用PBS充分洗滌多余的蛋白，然后將細(xì)胞濃度為2×10⁴/mL的MSC或HSC細(xì)胞懸液加入到24孔板中，置于37℃，CO₂培養(yǎng)箱中輕輕搖晃1h,取出培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)基，PBS輕輕洗滌后用4％多聚甲醛固定，然后用DAPI標(biāo)記粘附在24孔板中的細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。從圖3A-圖3D可以看出，CBD-SDF-1α與捕獲的MSC和HSC分別是NAT-SDF-1α的7.07倍(圖3C)和13.29倍(圖3D)，說明CBD-SDF-1α與膠原結(jié)合后可以捕獲更多的MSC和HSC。

實(shí)施例3CBD-SDF-1α對(duì)心肌梗死的治療作用

CBD-SDF-1α結(jié)合在心肌梗死部位并緩慢釋放

首先，通過結(jié)扎SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，在結(jié)扎后30min分別將1.0nmol的NAT-SDF-1α或CBD-SDF-1α注射到心肌梗死邊緣的5個(gè)位點(diǎn)；分別于注射后3h和6h用人SDF-1αELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中SDF-1α的濃度；同時(shí)取心肌梗死邊緣的組織，提取蛋白，通過WB的方法檢測(cè)結(jié)合在心肌梗死部位的SDF-1α，用anti-polyhistine抗體區(qū)別內(nèi)源性SDF-1α與外源性SDF-1α。從圖4A-圖4B中可以看出， CBD-SDF-1α在心肌梗死部位的濃度較高，到血清中的量較少(圖4C)，而NAT-SDF-1α在心肌梗死部位的濃度較低，血清中的量較高。這些數(shù)據(jù)表明，CBD-SDF-1α因具有膠原結(jié)合能力，可以很好的結(jié)合在心肌梗死部位，減少?gòu)浬?，提高局部治療濃度，達(dá)到了緩慢釋放的效果。

CBD-SDF-1α募集內(nèi)源性干細(xì)胞向心肌梗死部位遷移

在CBD-SDF-1α注射后4d，分離心肌梗死區(qū)域的心肌組織，用OCT包埋，進(jìn)行冰凍切片，通過免疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)源性干細(xì)胞向心肌梗死部位的遷移情況。首先，冰凍切片與mouse anti-c-kit抗體(1:200，abcam)在4℃孵育過夜，PBS洗3遍，然后與FITC標(biāo)記的Donkey anti-mouse IgG(1:500,abcam)室溫反應(yīng)2h,PBS洗3遍，最后用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，倒置熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。從圖5A-圖5B可以看出，CBD-SDF-1α比NAT-SDF-1α可以募集更多的c-kit陽(yáng)性的內(nèi)源性干細(xì)胞向心肌梗死部位遷移，大約NAT-SDF-1α組的2倍，這些干細(xì)胞在心肌再生過程中將發(fā)揮重要作用。

CBD-SDF-1α減少梗死部位纖維化程度及增加心室壁的厚度

術(shù)后90d，收取各組的心臟，根據(jù)結(jié)扎部位辨認(rèn)心肌梗死部位，進(jìn)行縱切，4％多聚甲醛固定24h后進(jìn)行石蠟切片，然后進(jìn)行Masson染色，對(duì)治療后心肌梗死部位的纖維化程度及心肌壁的厚度進(jìn)行分析。從圖6A-圖6C可以看出，CBD-SDF-1α治療組疤痕組織的比例是18.7±4.62％，心肌壁的厚度是2.73±0.39mm，而NAT-SDF-1α治療組疤痕組織的比例是31.83±6.75％，心肌壁的厚度是1.52±0.31mm,因此CBD-SDF-1α可以更好的促進(jìn)心肌的修復(fù)，減少疤痕組織的形成，增加心肌壁的厚度。

CBD-SDF-1α促進(jìn)梗死部位血管的再生

心肌組織及心肌細(xì)胞的長(zhǎng)期存活，必須要有血管為其提供營(yíng)養(yǎng)，因此又對(duì)上述石蠟切片進(jìn)行vWF染色，檢測(cè)治療后梗死心肌組織的血管再生情況。從圖7A-圖7B可以發(fā)現(xiàn)CBD-SDF-1α組的微血管密度(275.61±18.25mm²)比NAT-SDF-1α組的微血管密度(183.28±20.36/mm²)要高，說明CBD-SDF-1α可以更有效的促進(jìn)血管新生。

應(yīng)當(dāng)理解，在本說明書中，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語(yǔ)句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。

又及，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，可以根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案和技術(shù)構(gòu)思做出其它各種相應(yīng)的改變和變形，而這些改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

<110> 中國(guó)科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所

<120> 與膠原特異結(jié)合的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120

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<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His

20

Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala

40

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60

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