本發(fā)明涉及一株耐酸乳酸乳球菌及其應(yīng)用，屬于食品生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：作為工業(yè)化的微生物細(xì)胞工廠，乳酸乳球菌已廣泛應(yīng)用于食品，發(fā)酵等領(lǐng)域。在開(kāi)展上述領(lǐng)域中所需工業(yè)產(chǎn)品的發(fā)酵法生產(chǎn)過(guò)程中，產(chǎn)酸特性成為微生物必不可少的組成部分。一方面代謝產(chǎn)酸可幫助促進(jìn)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化、維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡、增強(qiáng)本體細(xì)胞的環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)性。另一方面，隨著胞內(nèi)產(chǎn)酸的積累，導(dǎo)致微生物菌體細(xì)胞內(nèi)的pH持續(xù)下降，胞內(nèi)維持細(xì)胞正常生理功能的相關(guān)酶類活性受到抑制，進(jìn)而影響細(xì)胞的代謝活性及其生產(chǎn)效率，并為生產(chǎn)成本、下游加工及后續(xù)工業(yè)排放物環(huán)境治理埋下諸多隱患。同時(shí)，作為益生菌中的一種，在人體胃腸道中也會(huì)遭受酸脅迫、膽鹽脅迫等環(huán)境脅迫。因此，提高微生物菌株的酸脅迫耐受性，成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界亟待解決的重要問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株乳酸乳球菌WH102(LactococcuslactisWH103)，其于2016年4月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016234,地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。所述乳酸乳球菌WH102是以乳酸乳球菌(LactococcuslactisNZ9000)為出發(fā)菌株，以硫酸二乙酯(DES)為誘變劑誘變得到的，在pH4.5的條件下，OD600值達(dá)到0.371，相比較誘變前提高了2.6倍；在pH4.0的乳酸中脅迫2h，存活率為6.09％；在pH4.0的乳酸中脅迫2h，存活率是同等處理?xiàng)l件下誘變前菌株的6.1倍。本發(fā)明選育得到的乳酸乳球菌WH102(CCTCCNO:M2016234)在較低pH條件下能夠更好地生長(zhǎng)，而出發(fā)菌株不能在較低pH條件下生長(zhǎng)，突變菌株WH102具有更好的生長(zhǎng)性能和酸耐受性。本發(fā)明提供的選育方法，操作簡(jiǎn)單易行，且效果較明顯。生物材料保藏一株乳酸乳球菌WH102(LactococcuslactisWH103)，其于2016年4月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016234，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。具體實(shí)施方式GM17培養(yǎng)基為：葡萄糖5.0g.L-1,胰蛋白胨5.0g.L-1，大豆蛋白胨5.0g.L-1，牛肉浸膏5.0g.L-1，酵母提取物2.5g.L-1，維生素C0.5g.L-1，硫酸鎂0.25g.L-1，甘油磷酸二鈉19.0g.L-1。pH4.5的GM17培養(yǎng)基為25％的乳酸調(diào)節(jié)的pH值為4.5的GM17培養(yǎng)基。其他pH的GM17培養(yǎng)基以同樣方法得到。實(shí)施例1乳酸乳球菌(CCTCCNO:M2016234)的選育方法以乳酸乳球菌(LactococcuslactisNZ9000)為出發(fā)菌株，將其在GM17培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整菌液濃度1*107個(gè)/CFU，取樣離心(5000rpm；10min)后去上清，用0.85％的生理鹽水洗滌重懸，重復(fù)兩次。加入含0.5％v/v硫酸二乙酯(DES)的GM17培養(yǎng)基等體積重懸，100rpm，30℃處理30min后立即用0.85％的生理鹽水洗滌重懸，重復(fù)5次，加入等體積的GM17培養(yǎng)基重懸后在30℃下靜置培養(yǎng)1.5h。在2.2ml的96深孔板中加入1ml的GM17(pH5.0)培養(yǎng)基，取上述后培養(yǎng)的培養(yǎng)液以2％的接種量轉(zhuǎn)接到96深孔板中，30℃下靜置培養(yǎng)48h，考察誘變菌株在酸性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，根據(jù)生物量的大小篩選出突變混合菌株，然后將混合菌株經(jīng)適當(dāng)稀釋涂布pH5.0的平板，挑選單菌落，將單菌落于pH為5.0條件下發(fā)酵，根據(jù)生物量大小篩選出突變菌株，出發(fā)菌株OD600達(dá)到0.076，突變菌株乳酸乳球菌WH102的OD600達(dá)到0.441，于2016年4月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2016234。實(shí)施例2乳酸乳球菌(CCTCCNO:M2016234)酸脅迫條件下的生長(zhǎng)性能將保藏于-80℃甘油管中的出發(fā)菌株乳酸乳球菌(LactococcuslactisNZ9000)及選育到的乳酸乳球菌WH102以2％的接種量接入GM17培養(yǎng)基，在30℃靜置培養(yǎng)12h。以2％的接種量分別取活化好的乳酸乳球菌NZ9000和乳酸乳球菌WH102轉(zhuǎn)接到GM17(pH4.5)培養(yǎng)基中，于30℃下靜置培養(yǎng)48h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的菌濃。在pH4.5的條件下，突變菌株OD600值達(dá)到0.527，相比較選育前提高了4.5倍。結(jié)果如表1所示。表1酸脅迫條件下菌體生長(zhǎng)性能菌株LactococcuslactisNZ9000LactococcuslactisWH102OD6000.0810.371實(shí)施例3酸耐受性實(shí)驗(yàn)將保藏于-80℃甘油管中的出發(fā)菌株乳酸乳球菌(LactococcuslactisNZ9000)及選育到的乳酸乳球菌WH102以2％的接種量接入GM17培養(yǎng)基，在30℃靜置培養(yǎng)12h。以2％的接種量分別取活化好的乳酸乳球菌NZ9000和乳酸乳球菌WH102到GM17培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)5000rpm離心10min收集菌體，菌體經(jīng)0.85％的生理鹽水洗滌離心2次后，等體積重懸于GM17(pH4.0)培養(yǎng)基中脅迫不同的時(shí)間取樣，重新用相同的生理鹽水離心洗滌細(xì)胞2次，并重懸于等體積的生理鹽水中，取100μl的菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布平板，于30℃靜置培養(yǎng)24h，分別計(jì)算存活率大小(如表2所示)。突變菌株在pH4.0的乳酸中分別脅迫1h,2h,3h，存活率分別是同等處理?xiàng)l件下下選育前菌株的0.9倍，6.1倍，2.2倍。表2酸耐受性實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3