本發(fā)明涉及一株聚磷菌——不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2以及利用該菌實(shí)現(xiàn)從中低磷含量污水中回收磷的方法。
背景技術(shù)：
磷是生命的基本構(gòu)成元素之一，人類工業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)種植也對(duì)磷有著大量的需求。但是根據(jù)全球已探明的磷礦石儲(chǔ)量以及人類的開采利用速度，磷礦將在200年左右時(shí)間被開采完畢。而我們?nèi)祟悓?duì)磷的利用使得磷有很大一部分都溶解在了各類工農(nóng)業(yè)和生活污水當(dāng)中。特別是大量的生活污水不僅給污水處理帶來了巨大的壓力，更導(dǎo)致磷元素流向各類水體造成水體富營(yíng)養(yǎng)化。污水處理過程中的除磷工藝相對(duì)較為成熟，但是對(duì)磷的有效回收還十分缺乏，因此，研究從污水中具有可操作性的有效回收磷的技術(shù)具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值以及環(huán)保意義。
強(qiáng)化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，EBPR)是利用活性污泥中的聚磷菌(Polyphosphate Accumulating Organisms，PAOs)在厭氧狀態(tài)下向水體中釋放磷，在好氧狀態(tài)下以遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其生長(zhǎng)需要的水平從水體中攝取磷的生物機(jī)理達(dá)到除磷的目的，該方法具有運(yùn)行成本低，適應(yīng)性廣的特點(diǎn)。
磷酸銨鎂結(jié)晶法(Magnesium Ammonium Phosphate，MAP)則是利用鎂、銨根和磷酸根在溶液中達(dá)到過飽和狀態(tài)時(shí)會(huì)生成磷酸銨鎂結(jié)晶的原理對(duì)污水中的磷進(jìn)行回收的方法，該方法能夠很好的實(shí)現(xiàn)對(duì)高磷廢水中磷的回收，且回收產(chǎn)物具有很高的氮磷含量。本發(fā)明對(duì)上述兩種方法開展研究，將兩種方法進(jìn)行有機(jī)耦合，對(duì)實(shí)現(xiàn)從城鎮(zhèn)污水中回收磷具有很強(qiáng)的操作性，為實(shí)際污水處理提供了理論依據(jù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是提供一株具有強(qiáng)化生物除磷功能的聚磷菌——不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302。
本發(fā)明的聚磷菌分離自天津市紀(jì)莊子污水處理廠好氧池活性污泥，菌體呈球桿狀，菌落邊緣整起，濕潤(rùn)，革蘭氏陰性，結(jié)合16S rDNA和BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，命名為不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2。該菌已于2015年5月15日保藏在中國(guó)武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC M 2015302。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供利用聚磷菌——不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M2015302的強(qiáng)化生物除磷功能結(jié)合磷酸銨鎂結(jié)晶法從中低磷含量的污水中回收磷的方法。
為實(shí)現(xiàn)這一目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案包括如下步驟：
(1)采用LB培養(yǎng)基30℃活化菌種12小時(shí)；
(2)按照1％-5％的比例將活化的聚磷菌回注到污水處理廠活性污泥中；
(3)以回注了聚磷菌的污水處理廠活性污泥接種，采用序批式活性污泥法進(jìn)行馴化，每個(gè)循環(huán)包含厭氧-好氧-沉淀-換水，且循環(huán)之間交替使用丙酸和乙酸兩種碳源，碳磷摩爾比C∶p＝13～20∶1，在20～37℃溫度下馴化4周以上；其中，每12～24小時(shí)作為一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含5.5～11.5小時(shí)厭氧攪拌、5.5～11.5小時(shí)好氧曝氣以及1小時(shí)用于沉淀、換水和閑置，其中，換水比例為40％-70％；交替使用丙酸和乙酸兩種營(yíng)養(yǎng)底物馴化；
(4)利用系統(tǒng)產(chǎn)生的剩余活性污泥進(jìn)行厭氧消化處理，獲得高含磷量的消化液；
(5)然后采用磷酸銨鎂結(jié)晶法進(jìn)行回收，每升添加0.3-0.7g石英砂作為晶種，控制在pH＝9.0～11.0，以氯化鎂和氯化銨作為鎂源和氮源，控制摩爾比Mg∶N∶P＝(1.3～1.7)∶(1.3～1.7)∶1.0，溫度25～37℃、攪拌速率150-220rpm條件下結(jié)晶10min以上。
與現(xiàn)有其它的磷回收技術(shù)相比，采用該聚磷菌和該工藝方法，可以有效地降低從含磷量較低的污水中回收磷的難度，且能夠很好地嵌入到當(dāng)前常用的生物法污水處理工藝當(dāng)中，工藝改造成本和運(yùn)行成本較低，有利于磷的循環(huán)利用，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
附圖說明
圖1為磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例中不同培養(yǎng)基及溶液配方如下：
1.LB培養(yǎng)基：1000ml水，10.0g蛋白胨，5.0g酵母浸粉，5.0g NaCl，pH7.0-7.2。
2.YG培養(yǎng)基：酵母提取物1g、葡萄糖1g、K2HPO4 0.3g、KH2PO4 0.25g、MgSO4 0.2g、去離子水1L。
3.篩選培養(yǎng)基：MOPS-BCIP培養(yǎng)基，首先配制10倍濃度MOPS溶液：加8.372g MOPS，0.717g Tricine，30mL去離子水，用10mol/L KOH調(diào)節(jié)pH至7.4，總體積到44mL，再加1mL新制0.01％FeSO4溶液后按順序依次添加以下溶液：5mL 1.9mol/L NH4Cl，1mL0.276mol/L K2SO4，0.025mL 0.02mol/L CaCl2·2H2O，0.21mL 2.5mol/L MgCl2·6H2O，10mL 5mol/L NaCl，0.02mL微量元素混合液，38.7mL去離子水，葡萄糖0.1g。各取50mL 10倍濃度母液分裝置兩個(gè)三角瓶中，一瓶加入0.0087g K2HPO4成為限磷培養(yǎng)基； 另外一瓶加入0.1732g K2HPO4成為富磷培養(yǎng)基。向兩種培養(yǎng)基中加入0.1g/mL的thiamine溶液0.01mL，加入去離子水分別定容至500mL，過濾除菌后保藏。在使用時(shí)加入50mg/L的BCIP。
4.檢測(cè)培養(yǎng)基：乙酸鈉5.0g/L、NH4Cl 0.5g/L、牛肉膏、胰蛋白胨0.5g/L、KH2PO4 0.1g/L、微量元素。
5.Albert法異染顆粒染色液：A液：59％乙醇2mL、冰醋酸1mL、甲苯胺藍(lán)0.15g、孔雀綠0.2g、蒸餾水100mL。先將甲苯胺藍(lán)和孔雀綠溶于乙醇，再加入混勻的水和冰醋酸。B液：碘化鉀3g、碘2g、水300mL。
6.水中溶解性磷(以下簡(jiǎn)稱“水磷”)含量測(cè)定主要所需溶液配方
過硫酸鉀溶液：5g過硫酸鉀溶于100mL蒸餾水；
硫酸：1∶1；
抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100mL蒸餾水中；
鉬酸鹽溶液：溶解13g鉬酸銨于100mL蒸餾水中，溶解0.35g酒石酸銻鉀于100mL蒸餾水中，在不斷攪拌下，把鉬酸銨溶液徐徐加入到300mL硫酸中，加酒石酸銻鉀溶液并且混合均勻，貯存在4℃可穩(wěn)定至少兩個(gè)月。
KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(含磷量50.0μg/mL)：將優(yōu)級(jí)純磷酸二氫鉀于110℃干燥2h，在干燥器中冷卻稱取0.2197g溶于水，移入1000mL容量瓶中，加硫酸5mL，用水稀釋至標(biāo)線。
KH2PO4標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(含磷量2.00μg/mL)：吸取10mL磷酸鹽儲(chǔ)備液于250mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，使用前臨時(shí)配置。
7.模擬含磷廢水：乙酸鈉1.12g/L或丙酸鈉0.677g/L、MgSO4 0.083g/L、NH4Cl 0.1065g/L、K2HPO4 0.064g/L、KH2PO4 0.0382g/L、CaCl2·2H2O 0.0795g/L、營(yíng)養(yǎng)液0.575mL/L、pH7.0。營(yíng)養(yǎng)液：FeCl3·6H2O 1.5g/L、H3BO3 0.15g/L、CuSO4·5H2O 0.03g/L、KI 0.18g/L、MnCl2·4H2O 0.12g/L、EDTA 10g/L、NaMoO4·2H2O 0.06g/L、ZnSO4·7H2O 0.12g/L、CoCl2·6H2O 0.15g/L。
實(shí)施例1、分離鑒定聚磷菌——不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302
實(shí)驗(yàn)材料來自天津市紀(jì)莊子污水處理廠A2/O工藝好氧池(52.8°N，117.11°E)。
具體實(shí)施步驟如下：在無菌操作下，將10mL活性污泥樣品溶于90mL水中，加玻璃珠搖床振蕩30分鐘，將獲得的混合液梯度稀釋后，涂布于已制好的YG平板上，30℃培養(yǎng)2-3天。之后挑取不同形態(tài)菌落在YG平板上劃線純化。將純化后的菌株分別轉(zhuǎn)接于限磷和富磷的MOPS-BCIP平板上，30℃培養(yǎng)2-3天。在限磷和富磷培養(yǎng)基上均產(chǎn)生藍(lán)斑的菌株初步認(rèn) 定為聚磷菌。選取初篩菌株用Albert異染顆粒染色液染色，先用A液染色5分鐘，再用B液沖去A液染色1分鐘，具有異染顆粒的菌株即認(rèn)定為聚磷菌。經(jīng)過革蘭氏染色、16S rDNA基因序列分析及BIOLOG鑒定確定該菌株為不動(dòng)桿菌，命名為不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2；經(jīng)保藏編號(hào)為：CCTCC M 2015302。
實(shí)施例2、不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302的除磷能力鑒定
采用檢測(cè)培養(yǎng)基，具體步驟如下：采用LB培養(yǎng)基，30℃、180rpm活化。以1％接種量接種至含200mL檢測(cè)培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，好氧培養(yǎng)12h后厭氧培養(yǎng)4h，再好氧培養(yǎng)8h，通過檢測(cè)上清P含量確定菌株除磷能力。
磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
磷含量測(cè)定采用國(guó)標(biāo)鉬酸銨分光光度法(GB11893-89)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取7支50mL具塞比色管，分別加入磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液：0.00、0.10、0.20、0.60、1.00、2.00、3.00，加水至5mL；向7只比色管中加入800μL過硫酸鉀溶液，放入高壓滅菌鍋中120℃消解30min；自然冷卻后加水定容至10mL刻度線，加入200μL抗壞血酸溶液，30s后加入400μL鉬酸鹽溶液；顯色15分鐘后用分光光度計(jì)檢測(cè)700nm下的吸光度，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線如說明書附圖1所示。
不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302除磷能力測(cè)定
取接種培養(yǎng)前、后的檢測(cè)培養(yǎng)基，離心取上清，分別制備50倍和100倍稀釋液。各取5mL加入比色管，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的消解、顯色方法進(jìn)行處理，檢測(cè)700nm下的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液P含量。不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.)G2 CCTCC M 2015302除磷效果為6.9mg/L。
實(shí)施例3、強(qiáng)化生物除磷實(shí)驗(yàn)
采用模擬含磷廢水，理論P(yáng)含量為17.4mg/L，C/P＝15∶1。采用2L規(guī)模的序批式活性污泥法，每24小時(shí)作為一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含11.5小時(shí)厭氧攪拌、11.5小時(shí)好氧曝氣、20分鐘沉淀、換水50％、40分鐘閑置，交替使用丙酸和乙酸兩種營(yíng)養(yǎng)底物馴化。取1.0L取自污水處理廠的活性污泥與污水混合物，8000rpm、15分鐘離心后將所得濕泥作為樣品接種。在系統(tǒng)運(yùn)行過程中檢測(cè)每個(gè)循環(huán)厭氧結(jié)束、好氧結(jié)束和換水結(jié)束三個(gè)時(shí)刻的污水中的溶解性磷含量。
磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和磷含量測(cè)定方法同實(shí)施例2。
運(yùn)行4周時(shí)間后好氧出水P濃度平均為4.0mg/L，厭氧結(jié)束時(shí)的水磷P濃度平均為49.6mg/L。相比于模擬含量配水17.4mg/L的磷含量，此系統(tǒng)的除磷量為13.4mg/L，除磷率為77％。
實(shí)施例4、磷酸銨鎂結(jié)晶法從模擬污水中回收磷的實(shí)驗(yàn)
采用模擬含磷廢水，調(diào)整水磷濃度為150mg/L。具體步驟如下：調(diào)節(jié)pH＝10，按照摩爾比Mg∶N∶P＝1.5∶1.5∶1.0加入氯化鎂溶液和氯化銨溶液作為鎂源和氮源，加入0.5g/L石英砂作為晶種，30℃、180rpm振蕩結(jié)晶30min。
磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和磷含量測(cè)定方法同實(shí)施例2，對(duì)比結(jié)晶反應(yīng)前后的磷含量變化，磷的回收效率為97.89％。
實(shí)施例5、磷酸銨鎂結(jié)晶法從活性污泥厭氧消化液回收磷實(shí)驗(yàn)
采用實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)中28天后好養(yǎng)結(jié)束時(shí)的活性污泥，離心濃縮后補(bǔ)加乙酸鈉1g/L，50℃厭氧恒溫水浴12小時(shí)，對(duì)污泥進(jìn)行中溫厭氧消化處理。獲得磷含量為127.35mg/L的厭氧消化液。調(diào)節(jié)pH＝10，按照摩爾比Mg∶N∶P＝1.5∶1.5∶1.0加入氯化鎂溶液和氯化銨溶液作為鎂源和氮源，加入0.5g/L石英砂作為品種，30℃、180rpm振蕩結(jié)晶30min，取得了75％的磷回收效率；獲得白色磷酸銨鎂結(jié)晶。