本發(fā)明屬于海洋污染降解領(lǐng)域，尤其涉及一種海洋石油污染降解用的微生物菌劑制備方法。
背景技術(shù)：
海洋石油溢油及石油污染問題一直是影響海洋環(huán)境和海洋生態(tài)的重要問題。目前對(duì)于海洋石油污染，特別是突發(fā)性溢油事故的緊急處理，主要針對(duì)溢油發(fā)生初期的海洋表層海水，采用物理攔截、回收等方式進(jìn)行應(yīng)急處置。但是，對(duì)于海底溢油或者隨水體運(yùn)動(dòng)沉降至海底沉積物中的石油污染，目前還沒有很好的物理、化學(xué)方法可以處理，沉積物中石油降解微生物的環(huán)境自凈和人為導(dǎo)入石油降解微生物是目前解決海洋沉積物石油污染的主要方式。
然而，上述方式存在的缺點(diǎn)在于：1、物理與化學(xué)修復(fù)法，極易造成二次污染；2、修復(fù)大部分只能進(jìn)行表面漂浮輕質(zhì)油的圍攔與清理；3、修復(fù)技術(shù)只能短時(shí)間作用，不能形成長效性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種海洋石油污染降解用的微生物菌劑制備方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種海洋石油污染降解用的微生物菌劑制備方法，包括以下步驟：
(1)制備種子液
a、制備培養(yǎng)基：在950ml去離子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化鈉10g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0，再用去離子水定容至1L，在15ps i高壓下蒸汽滅菌21min；
b、在步驟a的培養(yǎng)基中接種海洋修復(fù)類菌種，并放置在搖床上培養(yǎng)至吸光度大于1.0，鏡檢無雜菌制得種子液；
(2)制備菌液
a、一級(jí)發(fā)酵：在一級(jí)發(fā)酵罐中，將胰蛋白胨450g、酵母浸粉120g、氯化鈣1.4g、硫酸鎂14g、氯化鈉800g、硫酸亞鐵4g和硫酸氫二鉀100g加入到80L水中攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.5，在121℃、1.5MPa條件下滅菌，降溫至30℃，將種子液在無菌條件下接種至一級(jí)發(fā)酵罐；
b、二級(jí)發(fā)酵：在二級(jí)發(fā)酵罐中，將胰蛋白胨4800g、酵母浸粉1300g、氯化鈣15g、硫酸鎂140g、氯化鈉8000g、硫酸亞鐵40g和硫酸氫二鉀1000g加入到800L水中攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.5，在121℃、1.5MPa條件下滅菌，降溫至30℃；當(dāng)一級(jí)發(fā)酵罐中的的菌液吸光度大于1.0時(shí)，將發(fā)酵液在無菌條件下轉(zhuǎn)移至二級(jí)發(fā)酵罐中，無菌過濾通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，多點(diǎn)無菌取樣，監(jiān)測(cè)至吸光度大于1.1，雜菌率控制在10wt％以下，完成二級(jí)發(fā)酵；
c、三級(jí)發(fā)酵：在三級(jí)發(fā)酵罐中，將胰蛋白胨25kg、酵母浸粉7kg、氯化鈣80g、硫酸鎂750g、氯化鈉40kg、硫酸亞鐵210g和硫酸氫二鉀5kg加入到4000L水中攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.5，在121℃、1.5MPa條件下滅菌，降溫至30℃，將二級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至三級(jí)發(fā)酵罐，無菌過濾通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，多點(diǎn)無菌取樣，監(jiān)測(cè)至吸光度大于1.2，雜菌率控制在20wt％以下，完成三級(jí)發(fā)酵；
d、保存：將完成三級(jí)發(fā)酵的發(fā)酵菌液在4℃條件下冷藏儲(chǔ)存在菌液上料罐中；
(3)吸附：將菌液上料罐中的菌液與沸石上料罐中的沸石按照重量比2:1加入攪拌罐Ⅰ中，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌，混合吸附20min；
(4)控液：將步驟(3)吸附菌劑后的沸石輸送到脫水篩上，通過振動(dòng)將液體濾除，控液6min；
(5)包裹：將步驟(4)混合控液脫水后的產(chǎn)品與聚谷氨酸溶液罐中濃度7wt％的聚谷氨酸溶液同時(shí)加入攪拌罐Ⅱ中進(jìn)行攪拌、混合、包裹10min；
(6)保存：將步驟(5)包裹后的菌劑裝入噸袋中保存。
其中，步驟(1)中所述的海洋修復(fù)類菌種為芽孢桿菌或海單胞菌。
步驟(6)噸袋中的菌劑重量為1±0.1噸，有效活菌數(shù)≥1億/克。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明將功能微生物大量發(fā)酵培養(yǎng)后，采用微生物菌種三級(jí)發(fā)酵形式擴(kuò)培菌液，并采用活化沸石吸附并用PGA包裹，形成菌劑產(chǎn)品，沸石表面包裹保護(hù)劑(營養(yǎng)劑)，在沉降過程中盡可能的降低沸石孔徑中微生物的損失，同時(shí)還能使微生物將包裹劑作為營養(yǎng)源，不對(duì)水體造成二次污染，從而達(dá)到菌劑有效活菌數(shù)＞1億/g、且投放過程中損失菌數(shù)最小的目的。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的工藝流程圖；
圖中，1、沸石上料罐；2、菌液上料罐；3、攪拌罐Ⅰ；4、脫水篩；5、攪拌罐Ⅱ；6、聚谷氨酸溶液罐。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
一種海洋石油污染降解用的微生物菌劑制備方法，包括以下步驟：
(1)制備種子液
a、制備培養(yǎng)基：在950ml去離子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化鈉10g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0，再用去離子水定容至1L，在15ps i高壓下蒸汽滅菌21min；
b、在步驟a的培養(yǎng)基中接種海洋修復(fù)類菌種，并放置在搖床上培養(yǎng)至吸光度大于1.0，鏡檢無雜菌制得種子液；
(2)制備菌液
a、一級(jí)發(fā)酵：在一級(jí)發(fā)酵罐中，將胰蛋白胨450g、酵母浸粉120g、氯化鈣1.4g、硫酸鎂14g、氯化鈉800g、硫酸亞鐵4g和硫酸氫二鉀100g加入到80L水中攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.5，在121℃、1.5MPa條件下滅菌，降溫至30℃，將種子液在無菌條件下接種至一級(jí)發(fā)酵罐；
b、二級(jí)發(fā)酵：在二級(jí)發(fā)酵罐中，將胰蛋白胨4800g、酵母浸粉1300g、氯化鈣15g、硫酸鎂140g、氯化鈉8000g、硫酸亞鐵40g和硫酸氫二鉀1000g加入到800L水中攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.5，在121℃、1.5MPa條件下滅菌，降溫至30℃；當(dāng)一級(jí)發(fā)酵罐中的的菌液吸光度大于1.0時(shí)，將發(fā)酵液在無菌條件下轉(zhuǎn)移至二級(jí)發(fā)酵罐中，無菌過濾通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，多點(diǎn)無菌取樣，監(jiān)測(cè)至吸光度大于1.1，雜菌率控制在10wt％以下，完成二級(jí)發(fā)酵；
c、三級(jí)發(fā)酵：在三級(jí)發(fā)酵罐中，將胰蛋白胨25kg、酵母浸粉7kg、氯化鈣80g、硫酸鎂750g、氯化鈉40kg、硫酸亞鐵210g和硫酸氫二鉀5kg加入到4000L水中攪拌溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.5，在121℃、1.5MPa條件下滅菌，降溫至30℃，將二級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至三級(jí)發(fā)酵罐，無菌過濾通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，多點(diǎn)無菌取樣，監(jiān)測(cè)至吸光度大于1.2，雜菌率控制在20wt％以下，完成三級(jí)發(fā)酵；
d、保存：將完成三級(jí)發(fā)酵的發(fā)酵菌液在4℃條件下冷藏儲(chǔ)存在菌液上料罐中；
(3)吸附：將菌液上料罐中的菌液與沸石上料罐中的沸石按照重量比2:1加入攪拌罐Ⅰ中，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌，混合吸附20min；
(4)控液：將步驟(3)吸附菌劑后的沸石輸送到脫水篩上，通過振動(dòng)將液體濾除，控液6min；
(5)包裹：將步驟(4)混合控液脫水后的產(chǎn)品與聚谷氨酸溶液罐中濃度7wt％的聚谷氨酸溶液同時(shí)加入攪拌罐Ⅱ中進(jìn)行攪拌、混合、包裹10min；
(6)保存：將步驟(5)包裹后的菌劑裝入噸袋中保存。
經(jīng)檢測(cè)，每噸袋中的菌劑重量為1±0.1噸，有效活菌數(shù)≥1億/克。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。