本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種透明質(zhì)酸衍生物水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

水凝膠是一種親水性極強(qiáng)、可吸水溶脹但不溶解的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性及獨(dú)特的吸水保水性能，這些性質(zhì)使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛關(guān)注。尤其是可注射性凝膠在生物活性分子緩釋、細(xì)胞包埋、細(xì)胞支撐等方面?zhèn)涫懿毮?。作為藥物緩釋載體，可注射性凝膠能夠與組織很好地結(jié)合，可有效控制水凝膠和藥物作用范圍，能實(shí)現(xiàn)藥物局部遞送和病灶處精確地釋放藥物。在再生醫(yī)學(xué)方面，可注射性水凝膠通過(guò)注射器將凝膠溶液送入體內(nèi)特定部位，可以填滿任何形狀的受損部位，達(dá)到材料和周圍組織密切接觸的目的。這樣可以避免外科手術(shù)過(guò)程中的高度創(chuàng)傷性，減少病人的痛苦，且費(fèi)用較低。綜合上述優(yōu)點(diǎn)，可注射性水凝膠具有廣闊的發(fā)展前景，將會(huì)在未來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)成為人們的研究熱點(diǎn)。

透明質(zhì)酸是一種親水性良好、帶負(fù)電荷的一種線性粘多糖，在體內(nèi)主要存在于結(jié)締組織、上皮和神經(jīng)組織中[G Kogan,L Soltés,R Stern,et al.Hyaluronic acid:a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications.Biotechnol Lett,2007；29:17-25.]，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分之一。透明質(zhì)酸具有良好的親水性、生物相容性和保水能力等性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。由透明質(zhì)酸制備而成的透明質(zhì)酸水凝膠因具有生物相容性好、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于藥物控制釋放、防術(shù)后粘連、軟骨支架、角膜支架、黏膜填充劑、組織修復(fù)和再生等領(lǐng)域。但純透明質(zhì)酸水凝膠存在力學(xué)性能較差、易降解等缺點(diǎn)，因此尋找合適的物質(zhì)對(duì)其交聯(lián)改性以克服這些不足顯得尤為重要。L-賴氨酸是一種堿性氨基酸，是人體必需氨基酸之一，安全無(wú)毒，常被用來(lái)合成聚氨基酸材料或側(cè)鏈為氨基酸的聚合物材料。研究表明側(cè)鏈為氨基酸的聚合物材料，因氨基酸同時(shí)保持了完整的氨基和羧基，且氨基和羧基處于同一個(gè)氨基酸單元中，仍具有很好的生物活性和生物相容性[J Romanski,M Karbarz,K Pyrzynska,et al.Polymeric hydrogels modified with ornithine and lysine:sorption and release of metal cations and amino acids.Journal of Polymer Science:Part A.Polymer Chemistry,2012,50:542-550；P Chen,XJ Liang,B Liang.Swelling behavior of an ampholytic hydrogel containing free amino acid side chain.Journal of Functional Polymers,2013,26:241-247]，研究其凝膠性能將對(duì)理解蛋白質(zhì)和多肽功能有很大幫助。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種透明質(zhì)酸衍生物水凝膠及其制備方法，采用碳二亞胺法將甲基丙烯酸2-氨基乙基酯和L-賴氨酸接枝于透明質(zhì)酸分子上，然后將得到的透明質(zhì)酸衍生物與水溶性光引發(fā)劑在水中實(shí)施光化學(xué)聚合，即得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠。該透明質(zhì)酸衍生物水凝膠不僅力學(xué)性能穩(wěn)定、彈性高、孔徑均勻，并且工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、成膠時(shí)間短，產(chǎn)物具有可注射性。該透明質(zhì)酸衍生物水凝膠可用作3D腫瘤模型基質(zhì)、組織工程支架材料、藥物載體、創(chuàng)傷敷料等。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的制備方法，在透明質(zhì)酸分子主鏈上修飾L-賴氨酸和甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，得到雙功能化透明質(zhì)酸；然后將水溶性光引發(fā)劑加入到雙功能化透明質(zhì)酸溶液中，采用紫外光照射0.5min～10min，得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，雙功能化透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度為0.5％～4％，水溶性光引發(fā)劑用量為雙功能化透明質(zhì)酸質(zhì)量的0.05％～0.5％。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的雙功能化透明質(zhì)酸的制備方法如下：

1)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到溶液，將溶液煮沸2小時(shí)～4小時(shí)，熱過(guò)濾，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為1:1～4:1；溶液中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為0.5％～6％；

2)配制質(zhì)量濃度為0.5％～2％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸水溶液，加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；然后將pH調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌12小時(shí)～60小時(shí)，得到溶液；其中，N-羥基琥珀酰亞胺用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.22～0.99倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2～10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.2～0.9倍；

3)向步驟2)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入無(wú)水乙醇，所得沉淀物溶于與步驟2)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，無(wú)水乙醇加入量為步驟2)中溶液體積的2倍；

將8-羥基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接著，將溶液B加入到溶液A中，攪拌12小時(shí)～48小時(shí)后過(guò)濾去除固體，水相用溶液B洗至無(wú)色，透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，得到雙功能化透明質(zhì)酸；其中，每100mL步驟2)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的1～5倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為0.5:1～1.5:1。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH調(diào)至5.0～5.5。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的透析采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述的冷凍干燥為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸的制備過(guò)程如下：將2-嗎啉乙磺酸加入到水中，形成2-嗎啉乙磺酸緩沖液，向2-嗎啉乙磺酸緩沖液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入透明質(zhì)酸，形成透明質(zhì)酸溶液；其中，2-嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為50mmol/L，溶液A中NaCl的濃度為0.5mol/L，每100mL透明質(zhì)酸溶液中含有0.2～2g透明質(zhì)酸；

然后向透明質(zhì)酸溶液加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，接著將pH值調(diào)至5.0～5.5，反應(yīng)1小時(shí)后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室溫下繼續(xù)攪拌24小時(shí)～60小時(shí)；最后采用沉淀劑將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來(lái)，溶于水中后透析3天，經(jīng)冷凍干燥后得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸；其中，N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的1.2～2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2.4～4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.1～1倍。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述透明質(zhì)酸分子量為30kDa～3000kDa。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述沉淀劑為乙醇或丙酮。

本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)在于，所述水溶性光引發(fā)劑為2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮或1-羥基環(huán)己基苯基甲酮；紫外光輻照參數(shù)為：中心波長(zhǎng)為365nm，光強(qiáng)為1200mJ/cm²～1500mJ/cm²，輻照距離為15cm。

一種透明質(zhì)酸衍生物水凝膠，該水凝膠呈多孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑為180μm，壓縮模量為6.7kPa。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

(1)采用碳二亞胺法將甲基丙烯酸2-氨基乙基酯和L-賴氨酸接枝于透明質(zhì)酸分子上，然后將得到的透明質(zhì)酸衍生物與水溶性光引發(fā)劑在水中實(shí)施光化學(xué)聚合，即得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠。用于改性透明質(zhì)酸的L-賴氨酸安全無(wú)毒、生物相容性優(yōu)異，且原料易得，保證了雙功能化透明質(zhì)酸良好的生物相容性。

(2)采用了光化學(xué)交聯(lián)方法制備透明質(zhì)酸衍生物水凝膠，具有工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、成膠速度快等特點(diǎn)，且可原位成膠，所成水凝膠具有可注射性。

(3)本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物水凝膠力學(xué)性能穩(wěn)定、彈性優(yōu)異，適用于多種生物醫(yī)學(xué)用途，如用作藥物緩釋載體、組織工程支架、創(chuàng)傷敷料、三維腫瘤模型等。

進(jìn)一步的，在實(shí)現(xiàn)L-賴氨酸改性透明質(zhì)酸時(shí)，采用了L-賴氨酸-銅絡(luò)合物，不僅有效保護(hù)了氨基酸基團(tuán)，還具有反應(yīng)位點(diǎn)可控、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為雙功能化的透明質(zhì)酸衍生物的¹H NMR譜。

圖2為透明質(zhì)酸衍生物水凝膠流變性能測(cè)試的頻率掃描圖。

圖3為透明質(zhì)酸衍生物水凝膠的壓縮應(yīng)力應(yīng)變曲線。

圖4為透明質(zhì)酸衍生物水凝膠凍干后的掃描電鏡照片。圖4(a)的放大倍數(shù)為35倍，圖4(b)的放大倍數(shù)為500倍。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不限于此。

實(shí)施例1

1)將2-嗎啉乙磺酸加入到水中，形成2-嗎啉乙磺酸緩沖液，向2-嗎啉乙磺酸緩沖液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量為170kDa的透明質(zhì)酸，形成透明質(zhì)酸溶液；其中，2-嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為50mmol/L，溶液A中NaCl的濃度為0.5mol/L，每100mL透明質(zhì)酸溶液中含有1g透明質(zhì)酸；

然后向透明質(zhì)酸溶液依次加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，接著采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，反應(yīng)1小時(shí)后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室溫下繼續(xù)攪拌24小時(shí)；最后采用丙酮將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來(lái)，溶于水中后采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天，經(jīng)冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸；其中，N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.5倍。

2)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到溶液，將溶液煮沸2小時(shí)，熱過(guò)濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為1.5:1；溶液中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為5％。

3)配制質(zhì)量濃度為1％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；然后采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌24小時(shí)，得到溶液；其中，N-羥基琥珀酰亞胺用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.44倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的4倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.4倍；

4)向步驟3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入無(wú)水乙醇，所得沉淀物溶于與步驟3)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，無(wú)水乙醇加入量為步驟3)中溶液體積的2倍；

將8-羥基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接著，將溶液B加入到溶液A中，攪拌24小時(shí)后過(guò)濾去除固體，水相用溶液B洗至無(wú)色，采用截留分子量為3500Da的透析袋透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到雙功能化透明質(zhì)酸；其中，每100mL步驟3)中溶液中加入10g的NaCl；8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的3倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1:1。

5)將水溶性光引發(fā)劑加入到雙功能化透明質(zhì)酸溶液中，采用紫外光照射2min，得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，雙功能化透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度為3.5％，水溶性光引發(fā)劑用量為雙功能化透明質(zhì)酸質(zhì)量的0.1％；水溶性光引發(fā)劑為2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮；紫外光輻照參數(shù)為：中心波長(zhǎng)為365nm，光強(qiáng)為1300mJ/cm²，輻照距離為15cm。

參見(jiàn)圖1，圖中峰a和b為甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的特征化學(xué)位移。其中a為中不飽和碳碳雙鍵的質(zhì)子化學(xué)位移，化學(xué)位移值為6.04ppm和5.64ppm；b為甲基質(zhì)子的化學(xué)位移，其數(shù)值為1.82ppm?；瘜W(xué)位移c、d和e為L(zhǎng)-賴氨酸中的質(zhì)子化學(xué)位移，其數(shù)值分別為1.62ppm、1.79ppm和2.78ppm。這些結(jié)果證實(shí)了雙功能化透明質(zhì)酸的成功合成。

由圖2可以看出，該水凝膠的儲(chǔ)能模量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于損耗模量，說(shuō)明該凝膠具有良好的彈性，這兩種模量值不隨著頻率改變而變化，說(shuō)明該凝膠具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

由圖3可以看出，該水凝膠的壓縮曲線與回彈曲線基本重合，且壓縮模量為6.7kPa，說(shuō)明該凝膠具有較好的形變恢復(fù)能力和彈性性能。

由圖4(a)和圖4(b)可以看出，該水凝膠凍干樣呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑均勻，孔壁光滑，平均孔徑約為180μm。

實(shí)施例2

1)將2-嗎啉乙磺酸加入到水中，形成2-嗎啉乙磺酸緩沖液，向2-嗎啉乙磺酸緩沖液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量為30kDa的透明質(zhì)酸，形成透明質(zhì)酸溶液；其中，2-嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為50mmol/L，溶液A中NaCl的濃度為0.5mol/L，每100mL透明質(zhì)酸溶液中含有0.2g透明質(zhì)酸；

然后向透明質(zhì)酸溶液依次加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，接著采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，反應(yīng)1小時(shí)后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室溫下繼續(xù)攪拌50小時(shí)；最后采用乙醇將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來(lái)，溶于水中后采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天，經(jīng)冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸；其中，N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.3倍。

2)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到溶液，將溶液煮沸2小時(shí)，熱過(guò)濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為1:1；溶液中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為6％。

3)配制質(zhì)量濃度為0.5％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；然后采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌40小時(shí)，得到溶液；其中，N-羥基琥珀酰亞胺用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.22倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的5倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.7倍。

4)向步驟3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入無(wú)水乙醇，所得沉淀物溶于與步驟3)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，無(wú)水乙醇加入量為步驟3)中溶液體積的2倍；

將8-羥基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接著，將溶液B加入到溶液A中，攪拌24小時(shí)后過(guò)濾去除固體，水相用溶液B洗至無(wú)色，然后采用截留分子量為3500Da的透析袋透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到雙功能化透明質(zhì)酸；其中，每100mL步驟3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的1倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為0.5:1。

5)將水溶性光引發(fā)劑加入到雙功能化透明質(zhì)酸溶液中，采用紫外光照射0.5min，得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，雙功能化透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度為0.5％，水溶性光引發(fā)劑用量為雙功能化透明質(zhì)酸質(zhì)量的0.05％；水溶性光引發(fā)劑為2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮；紫外光輻照參數(shù)為：中心波長(zhǎng)為365nm，光強(qiáng)為1200mJ/cm²，輻照距離為15cm。

實(shí)施例3

1)將2-嗎啉乙磺酸加入到水中，形成2-嗎啉乙磺酸緩沖液，向2-嗎啉乙磺酸緩沖液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量為400kDa的透明質(zhì)酸，形成透明質(zhì)酸溶液；其中，2-嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為50mmol/L，溶液A中NaCl的濃度為0.5mol/L，每100mL透明質(zhì)酸溶液中含有2g透明質(zhì)酸；

然后向透明質(zhì)酸溶液依次加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，接著采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，反應(yīng)1小時(shí)后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室溫下繼續(xù)攪拌60小時(shí)；最后采用乙醇將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來(lái)，溶于水中后采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天，經(jīng)冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸；其中，N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的1.6倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的3倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.1倍；

2)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到溶液，將溶液煮沸4小時(shí)，熱過(guò)濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為2:1；溶液中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為4％；

3)配制質(zhì)量濃度為1.5％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；然后采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌60小時(shí)，得到溶液；其中，N-羥基琥珀酰亞胺用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.99倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.5倍；

4)向步驟3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入無(wú)水乙醇，所得沉淀物溶于與步驟3)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，無(wú)水乙醇加入量為步驟3)中溶液體積的2倍；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；接著，將溶液B加入溶液A中，磁力攪拌35小時(shí)后過(guò)濾去除固體，水相用溶液B洗至無(wú)色，采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到雙功能化透明質(zhì)酸；其中，每100mL步驟3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的2倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1:1。

5)將水溶性光引發(fā)劑加入到雙功能化透明質(zhì)酸溶液中，采用紫外光照射2min，得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，雙功能化透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度為4％，水溶性光引發(fā)劑用量為雙功能化透明質(zhì)酸質(zhì)量的0.1％；水溶性光引發(fā)劑為1-羥基環(huán)己基苯基甲酮；紫外光輻照參數(shù)為：中心波長(zhǎng)為365nm，光強(qiáng)為1500mJ/cm²，輻照距離為15cm。

實(shí)施例4

1)將2-嗎啉乙磺酸加入到水中，形成2-嗎啉乙磺酸緩沖液，向2-嗎啉乙磺酸緩沖液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量為3000kDa的透明質(zhì)酸，形成透明質(zhì)酸溶液；其中，2-嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為50mmol/L，溶液A中NaCl的濃度為0.5mol/L，每100mL透明質(zhì)酸溶液中含有0.8g透明質(zhì)酸；

然后向透明質(zhì)酸溶液依次加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，接著采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，反應(yīng)1小時(shí)后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室溫下繼續(xù)攪拌24小時(shí)；最后采用丙酮將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來(lái)，溶于水中后采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天，經(jīng)冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸；其中，N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的2.4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.7倍。

2)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到溶液，將溶液煮沸3小時(shí)，熱過(guò)濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為3:1；溶液中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為2％；

3)配制質(zhì)量濃度為2％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；然后采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌12小時(shí)，得到溶液；其中，N-羥基琥珀酰亞胺用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.7倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的8倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.2倍。

4)向步驟3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入無(wú)水乙醇，所得沉淀物溶于與步驟3)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，無(wú)水乙醇加入量為步驟3)中溶液體積的2倍；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；接著，將溶液B加入溶液A中，磁力攪拌20小時(shí)后過(guò)濾去除固體，水相用溶液B洗至無(wú)色，采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到雙功能化透明質(zhì)酸；其中，每100mL步驟3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的3倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1.5:1。

5)將水溶性光引發(fā)劑加入到雙功能化透明質(zhì)酸溶液中，采用紫外光照射10min，得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，雙功能化透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度為2％，水溶性光引發(fā)劑用量為雙功能化透明質(zhì)酸質(zhì)量的0.3％；水溶性光引發(fā)劑為1-羥基環(huán)己基苯基甲酮；紫外光輻照參數(shù)為：中心波長(zhǎng)為365nm，光強(qiáng)為1300mJ/cm²，輻照距離為15cm。

實(shí)施例5

1)將2-嗎啉乙磺酸加入到水中，形成2-嗎啉乙磺酸緩沖液，向2-嗎啉乙磺酸緩沖液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量為1500kDa的透明質(zhì)酸，形成透明質(zhì)酸溶液；其中，2-嗎啉乙磺酸緩沖液的濃度為50mmol/L，溶液A中NaCl的濃度為0.5mol/L，每100mL透明質(zhì)酸溶液中含有1.5g透明質(zhì)酸；

然后向透明質(zhì)酸溶液依次加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，接著采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH值調(diào)至5.0～5.5，反應(yīng)1小時(shí)后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室溫下繼續(xù)攪拌40小時(shí)；最后采用丙酮將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀出來(lái)，溶于水中后采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天，經(jīng)冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸；其中，N-羥基琥珀酰亞胺的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的1.5倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的3.5倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的1倍。

2)將L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅加入到水中，得到溶液，將溶液煮沸2.5小時(shí)，熱過(guò)濾，濾渣用熱水洗滌，洗滌液并入濾液，將濾液冷凍干燥，得到L-賴氨酸-銅絡(luò)合物；其中L-賴氨酸單鹽酸鹽與堿式碳酸銅的摩爾比為4:1；溶液中L-賴氨酸單鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為0.5％；

3)配制質(zhì)量濃度為1％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明質(zhì)酸水溶液，依次加入N-羥基琥珀酰亞胺、L-賴氨酸-銅絡(luò)合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；然后采用濃度均為1mol/L的NaOH溶液或鹽酸將pH調(diào)至5.0～5.5，在室溫下繼續(xù)攪拌30小時(shí)，得到溶液；其中，N-羥基琥珀酰亞胺用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.5倍，L-賴氨酸-銅絡(luò)合物的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)的0.9倍；

4)向步驟3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入無(wú)水乙醇，所得沉淀物溶于與步驟3)溶液等體積量的水中，得到溶液A；其中，無(wú)水乙醇加入量為步驟3)中溶液體積的2倍；

將8-羥基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；接著，將溶液B加入溶液A中，磁力攪拌12小時(shí)后過(guò)濾去除固體，水相用溶液B洗至無(wú)色，采用截留分子量為3500Da的透析袋進(jìn)行透析3天后進(jìn)行冷凍干燥，具體為零下20℃保持72小時(shí)、20℃保持4小時(shí)，得到雙功能化透明質(zhì)酸；其中，每100mL步驟3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羥基喹啉的摩爾量是L-賴氨酸-銅絡(luò)合物中銅離子的5倍，氯仿的體積與A溶液的體積比為1:1。

5)將水溶性光引發(fā)劑加入到雙功能化透明質(zhì)酸溶液中，采用紫外光照射6min，得到透明質(zhì)酸衍生物水凝膠；其中，雙功能化透明質(zhì)酸溶液的質(zhì)量濃度為1％，水溶性光引發(fā)劑用量為雙功能化透明質(zhì)酸質(zhì)量的0.5％；水溶性光引發(fā)劑為2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮；紫外光輻照參數(shù)為：中心波長(zhǎng)為365nm，光強(qiáng)為1400mJ/cm²，輻照距離為15cm。

本發(fā)明采用碳二亞胺法將甲基丙烯酸2-氨基乙基酯和L-賴氨酸修飾于透明質(zhì)酸分子上，再與光引發(fā)劑一起經(jīng)紫外光輻照交聯(lián)形成透明質(zhì)酸衍生物水凝膠。該水凝膠具有成膠快速、彈性性能優(yōu)異、力學(xué)性能穩(wěn)定、生物相容性良好等特點(diǎn)，并且制備工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、具有可注射性，有望在藥物緩釋載體、組織工程支架、創(chuàng)傷敷料、三維腫瘤模型等方面具有重要的應(yīng)用前景。