蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制作方法及在治療骨關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的應(yīng)用，特別涉及其在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨性關(guān)節(jié)炎最常見的骨科疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅在西方大約就有12%的中老年人群患有不同程度的骨關(guān)節(jié)炎。在美國約有2700多萬人患有骨關(guān)節(jié)炎，其中60歲以上的人群中患病率可達(dá)50%以上，美國疾病防控中心和哈佛大學(xué)公共衛(wèi)生部門的一項(xiàng)研宄表明骨關(guān)節(jié)炎是引起老年人殘疾的五個主要疾病之一。骨關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)表面軟骨的塌陷、壞死為特征，并伴隨著疼痛、關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)間隙變小、形成骨贅、關(guān)節(jié)畸形以及表面關(guān)節(jié)軟骨磨損后軟骨下骨的暴露。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率高、病程長嚴(yán)重影響我國和世界居民的健康水平。
[0003]目前臨床治療藥物主要為非甾體類抗炎藥，全身鎮(zhèn)痛藥(如對乙酰氨基酚)，糖皮質(zhì)激素等。由于該疾病致殘率為53%，晚期往往需要外科手術(shù)治療，如關(guān)機(jī)置換術(shù)、截骨術(shù)，這些手術(shù)的費(fèi)用高昂而且對患者的創(chuàng)傷都很大。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制在學(xué)術(shù)界尚無清晰的概念，這為其藥物篩選開發(fā)帶來了極大的困難。骨關(guān)節(jié)炎通常是由不正常的力學(xué)刺激引起，引起關(guān)節(jié)軟骨的病變，關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏血管，難以自發(fā)修復(fù)。
[0004]軟骨由軟骨細(xì)胞和大量的細(xì)胞外基質(zhì)組成，蛋白聚糖是組成細(xì)胞外基質(zhì)的一種主要成分。在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展中，蛋白聚糖的降解被認(rèn)為是一個重要的特征，在這之中蛋白聚糖酶被認(rèn)為是起著重要的作用。轉(zhuǎn)基因小鼠的研宄表明ADAMTS-5是主要的降解蛋白聚糖的酶。目前部分研宄已經(jīng)著眼于對ADAMTS-5有抑制作用的小分子抑制劑，然而截至目前，它們對軟骨缺損或者是OA治療效果的研宄幾乎沒有。透明質(zhì)酸(HA)是臨床上常用的一種關(guān)節(jié)潤滑劑，被用于促進(jìn)細(xì)胞分化和形態(tài)建成，治療炎癥以及創(chuàng)傷。HA以及它的衍生物已經(jīng)被廣泛研宄，有研宄表明體外交聯(lián)的透明質(zhì)酸水凝膠可以被用于促進(jìn)軟骨再生。同時，由于凝膠可以作為藥物載體，將凝膠與藥物結(jié)合可以成為一種有效的治療軟骨缺損的方式。在這項(xiàng)研宄中，我們設(shè)計(jì)了一種體外交聯(lián)的透明質(zhì)酸體系(兩種組分分別為乙醛和己二酸二酰肼)。擬探討結(jié)合體外交聯(lián)的透明質(zhì)酸水凝膠和ADAMTS-5抑制劑對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的方法及其在治療骨關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。
[0006]一種蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟:
步驟一:透明質(zhì)酸醛基修飾將60mg的透明質(zhì)酸先溶解在20ml的雙蒸水內(nèi)，然后再加入218 μ I濃度為10 mg/mL的Na14，在室溫下反應(yīng)兩個小時；然后加入0.2ml的己二醇攪拌I小時來終止反應(yīng)，得到的混合物在水中透析三天；將得到的醛基修飾的透明質(zhì)酸凍干再儲存在4°C的溫度下； 步驟二:透明質(zhì)酸己二酸二酰肼修飾
將至少30倍摩爾濃度的己二酸二酰肼加入到3 mg/mL的HA中，然后把pH調(diào)整到6.8 ；在混合物中加入I mol/L的二氯乙烷和I mol/L的三氮唑，保持pH為6.8使其反應(yīng)4小時；再通過調(diào)整pH到7.0將反應(yīng)停止，得到的混合物在水中透析三天，將得到的己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸凍干再儲存在4°C的溫度下；
步驟三:透明質(zhì)酸體外交聯(lián)
將0.6mg的ADAMTS-5抑制劑和50ul的醛基修飾的透明質(zhì)酸混合，再將混合液與50ul的己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸混合，反應(yīng)I分鐘內(nèi)成凝膠狀。
[0007]所述蛋白聚糖酶抑制劑為ADAMTS-5抑制劑，所述ADAMTS-5抑制劑化學(xué)名稱為:5- ((4-氯代芐-3-三氟甲基-N-甲基-1氫-吡唑-4-甲基)亞甲基)-2-硫代噻唑烷-4-酮，分子式為 ^16H11ClF3N3OS3O
[0008]一種蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠在制備治療骨性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
[0009]骨關(guān)節(jié)炎的治療目的是減輕或消除疼痛，矯正畸形，改善或恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，改善生活質(zhì)量，然而骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理和分子機(jī)制在學(xué)術(shù)界尚無清晰的概念，這為骨關(guān)節(jié)炎的藥物開發(fā)和診斷治療帶來了極大的困難，近年來，隨著研宄的深入，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解和降解酶的表達(dá)增高被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的中心事件，本發(fā)明從ADAMTS-5抑制劑對骨性關(guān)節(jié)炎形成過程中蛋白聚糖的合成和其降解產(chǎn)物的表達(dá)入手，首先建立大鼠膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶切除骨性關(guān)節(jié)炎模型，通過對關(guān)節(jié)腔注射蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠后大鼠膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)觀察并進(jìn)行相應(yīng)的組織學(xué)評分，觀察大鼠軟骨組織的破壞程度，以及蛋白聚糖的及其降解產(chǎn)物的表達(dá)情況，并通過空白組，模型組，體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組，ADAMTS-5抑制劑組和ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組用藥組的比較，來研宄蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠關(guān)節(jié)腔注射對大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用，探討ADAMTS-5抑制劑對骨性關(guān)節(jié)炎轉(zhuǎn)歸機(jī)制的影響，表明ADAMTS-5抑制劑可通過促進(jìn)蛋白聚糖的合成和抑制蛋白聚糖降解產(chǎn)物的表達(dá)來抑制骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程，從而為該藥物的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0010]SD大鼠20只抽取15只切除大鼠膝關(guān)節(jié)的前交叉韌帶進(jìn)行骨性關(guān)節(jié)炎造模，造模后分為空白組，模型組，體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組，ADAMTS-5抑制劑組和ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組。骨性關(guān)節(jié)炎組6只腿造模后不做任何處理，體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組6只腿造模3周后開始關(guān)節(jié)腔注射20 μ I透明質(zhì)酸水凝膠，每周I次，ADAMTS-5抑制劑組6支腿造模3周后開始關(guān)節(jié)腔注射0.12mg ADAMTS-5抑制劑，每周I次，ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組組6只腿造模3周后開始關(guān)節(jié)腔注射ADAMTS-5抑制劑結(jié)合透明質(zhì)酸水凝膠，每周I次，實(shí)驗(yàn)8周后處死所有大鼠，觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)改變并進(jìn)行相應(yīng)的組織學(xué)評分。結(jié)果表明:ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠能有效緩解外傷導(dǎo)致的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎進(jìn)程，促進(jìn)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎膝蛋白聚糖的表達(dá)和抑制蛋白聚糖降解產(chǎn)物的表達(dá)。
[0011]本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明所述蛋白聚糖酶抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠具有緩釋藥物的性能，能有效緩解大鼠骨性關(guān)節(jié)炎，促進(jìn)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎膝蛋白聚糖的表達(dá)和抑制蛋白聚糖降解產(chǎn)物的表達(dá)。此外，本發(fā)明結(jié)合生物材料和藥物，通過組織工程手段治療骨關(guān)節(jié)炎，利用關(guān)節(jié)腔給藥方式，減少了骨關(guān)節(jié)炎治療的創(chuàng)傷；緩釋給藥的給藥途徑，可以在提高局部藥物濃度的同時減少全身用藥產(chǎn)生相應(yīng)的副作用，具有臨床應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0012]圖1為透明質(zhì)酸進(jìn)行醛基修飾示意圖。
[0013]圖2為傅里葉紅外光譜檢測醛基修飾結(jié)果。
[0014]圖3為透明質(zhì)酸進(jìn)行己二酸二酰肼修飾示意圖。
[0015]圖4為核磁共振檢測己二酸二酰肼修飾結(jié)果。
[0016]圖5為所制備體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠緩釋牛血清蛋白曲線。
[0017]圖6為所制備體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠體外降解曲線。
[0018]圖7為軟骨組織切片的番紅-阿辛藍(lán)染色圖，A為假手術(shù)組，B為骨性關(guān)節(jié)炎組，C為體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組，D為ADAMTS-5抑制劑組，E為ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組。
[0019]圖8為骨性關(guān)節(jié)炎組，體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組，ADAMTS-5抑制劑組和ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組織的Mankin組織學(xué)(Mankin HistologicHistochemical Grading System)評分。
[0020]圖9為軟骨組織切片蛋白聚糖降解產(chǎn)物免疫組化染色圖，A為假手術(shù)組，B為骨性關(guān)節(jié)炎組，C為體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組，D為ADAMTS-5抑制劑組，E為ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組。
[0021]圖10為軟骨組織切片蛋白聚糖免疫組化染色圖，A為假手術(shù)組，B為骨性關(guān)節(jié)炎組，C為體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組，D為ADAMTS-5抑制劑組，E為ADAMTS-5抑制劑結(jié)合體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠組。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
本發(fā)明實(shí)施例所用實(shí)驗(yàn)材料:
實(shí)驗(yàn)動物:雌性12周齡Sprague-Dawley大鼠15只SPF級浙江大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。
[0023]實(shí)驗(yàn)藥品:
ADAMTS-5抑制劑(114810):南京科佰生物科技有限公司
透明質(zhì)酸，次碘酸鈉(Na104)和己二酸二酰肼:廣東阿拉丁公司
二氯乙烷(EDC):美國Sigma公司
蛋白聚糖抗體，蛋白聚糖降解產(chǎn)物抗體:美國Abcam公司
DAB顯色液:丹麥DAKO公司
其他試劑:國藥公司。
[0024]實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備: 傅里葉紅外光譜儀瑞士 Nicolet公司核磁共振儀瑞士 Bruker公司水浴鍋金壇市國旺實(shí)驗(yàn)儀器廠石蠟切片機(jī)德國MICROW公司顯微鏡攝影機(jī)日本OLYMPUS公司
BMJ-1II包埋機(jī)及冷凍臺中國常州中威電子儀器有限公司實(shí)施例1體外交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠制備和表征檢測
本發(fā)明采用體外交聯(lián)的方法制備透明質(zhì)酸水凝膠:(I)透明質(zhì)酸醛基修飾:60mg的透明質(zhì)酸先溶解