本發(fā)明屬于芝麻病害防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從枯萎病菌毒素中高效分離鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸的方法。

背景技術(shù)：

芝麻（Sesamum indicum L.，2n=26）屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的優(yōu)質(zhì)油料作物，也是我國重要的特色油料作物。

芝麻枯萎?。⊿esame Fusarium wilt）由尖孢鐮刀菌芝麻?；停?i>Fusarium oxysporum f. sp. sesami，F(xiàn)OS）侵染引起，主要芝麻真菌病害類型，在中國、埃及、韓國、印度等世界芝麻產(chǎn)區(qū)發(fā)生較為普遍。

為探明芝麻枯萎病菌致病機(jī)理，國內(nèi)外先后開展了枯萎病菌分離、鑒定及病原菌致病力鑒定方法等研究。2014年河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院首次建立了芝麻枯萎病菌致病力室內(nèi)鑒定技術(shù)體系，為芝麻FOS致病以及芝麻抗枯萎病機(jī)理研究提供了技術(shù)支撐（仇存璞等，芝麻枯萎病病原菌致病力室內(nèi)鑒定方法，2014，植物病理學(xué)報，44(01)：26-35）。

以往研究結(jié)果顯示，尖孢鐮刀菌在侵入植株組織后多能產(chǎn)生毒素，并對植株造成毒害作用。2006年臺蓮梅等利用尖孢鐮刀菌毒素濾液評價了不同大豆品種對根腐病的抗病性，并將該方法用于大豆抗病植株的初篩工作。近期初步研究及內(nèi)部資料表明，芝麻枯萎病菌FOS同其他尖孢鐮刀菌相似，侵染芝麻后，菌絲體逐漸堵塞維管束，切段水分及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，從而導(dǎo)致植株發(fā)病。同時，F(xiàn)OS病原菌能夠產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶等水解酶，對芝麻植株起到侵染作用。但至今為止，尚未明確芝麻枯萎病菌是否能夠產(chǎn)生毒素，亦未見有關(guān)FOS毒素對芝麻毒害癥狀的公開報道。因此，當(dāng)前急需一種分離芝麻枯萎病菌毒素中相關(guān)成分的技術(shù)方法，以便為闡明芝麻枯萎病菌致病機(jī)理、明確芝麻枯萎病防控靶標(biāo)提供技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種從枯萎病菌毒素中高效分離鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸的方法，從而為芝麻枯萎病病菌致病機(jī)理及枯萎病的防治奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明的主要技術(shù)方案如下所述。

一種從枯萎病菌毒素中分離鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸的方法，所述枯萎病菌毒素特指芝麻枯萎病菌毒素，可參考現(xiàn)有炭吸附法（臺蓮梅等，尖孢鐮刀菌毒素的初步研究，2004，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，16(4)：9~12）進(jìn)行制備，也可采用其他方法制備；具體包括如下步驟：

（1）樣品溶解，將芝麻枯萎病菌毒素樣品溶于乙腈水溶液中，0.22μm混合濾膜過濾，備用；

（2）色譜分離，采用色譜柱：XBridge Prep C18 （5μm）柱，步驟（1）中溶解的樣品在流動相A和流動相B中采用梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫分離；

流動相A為乙腈，流動相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液；

梯度洗脫程序：

① 0~12min時，A：B=5：95；12~13min，A:B比例從5：95逐漸變?yōu)?7：73；

②13~16min時，A：B=27：73；

③16~17min時，A：B比例從27：73逐漸變?yōu)?0：90；

④ 17~20min時，A：B=10：90；

⑤ 20~21min時，A：B比例從10：90逐漸變?yōu)?：95；

⑥ 21~22min時，A：B=5：95；

流速：10mL/min，檢測波長：270nm，進(jìn)樣量：500μL；

（3）成分收集，在17.520min~17.978min處收集含脫氫鐮刀菌酸溶液；在18.321min~18.860min處收集含鐮刀菌酸溶液；

（4）提純，對步驟（3）中所收集的含脫氫鐮刀菌酸溶液和含鐮刀菌酸溶液分別進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除部分溶劑，然后分別在真空凍干機(jī)中凍干，即可得到白色粉末狀的鐮刀菌酸和微黃色片狀的脫氫鐮刀菌酸。

對所制備的鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸的液質(zhì)、紅外、核磁共振氫譜等分析表明：白色粉末為5-丁基-吡啶-2-羧酸，分子量為179.22，分子式為C₁₀H₁₃NO₂，純度達(dá)到95%以上；微黃色片狀物為9,10-脫氫鐮刀菌酸，分子量為177.20，分子式為C₁₀H₁₁NO₂，純度達(dá)到95%以上。

所制備的鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸，用于芝麻幼苗生長時，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制芝麻幼苗生長作用。

所述芝麻枯萎病菌毒素，具體也可采用如下步驟制備獲得：

（1）菌株預(yù)培養(yǎng)，具體為：

將芝麻枯萎病菌（即尖孢鐮刀菌芝麻專化型）菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃、培養(yǎng)7 d左右，檢查菌株活性；

然后，沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片，接入裝有PD培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)，每瓶接2~3片， 28℃、120 rpm條件下，震蕩培養(yǎng)4d；

（2）菌株培養(yǎng)，具體為：

以2層無菌的2層擦鏡紙作為濾網(wǎng)，對步驟（1）中培養(yǎng)結(jié)束后菌液進(jìn)行過濾，濾除菌絲，濾液中由于含有大量芝麻枯萎病菌孢子，以此作為接菌母液；

將接菌母液接入理查德培養(yǎng)基，28℃、120 rpm條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)40~50d；

（3）提取芝麻枯萎病菌毒素，具體為：

首先，以2層無菌紗布作為濾網(wǎng)，將步驟（2）中培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，以濾除孢子、菌絲及細(xì)胞碎片等雜物；將濾液4000rpm離心15min，取上清液；

其次，將上述上清液慢慢滴加于裝有0.45μm水系濾膜的溶劑過濾器中，真空抽濾，收集濾液，并用2N（2mol/L）鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=3.0；

最后，向濾液中加入與濾液體積相等的乙酸乙酯作為萃取劑進(jìn)行萃?。蝗∩蠈佑袡C(jī)相，用無水硫酸鈉干燥后，濾除硫酸鈉，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除乙酸乙酯，最終得棕黃色固體產(chǎn)品，即為芝麻枯萎病菌毒素。

本發(fā)明通過液相色譜方法，對芝麻枯萎病菌毒素中的鐮刀酸和脫氫鐮刀菌酸分別進(jìn)行了成功分離?？傮w而言，本發(fā)明技術(shù)簡便，重復(fù)性好，分離效率較高。為深入研究芝麻枯萎病的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，同時也為相關(guān)抗性植株的篩選提供了借鑒和參考，因而具有較好的應(yīng)用研究價值。

附圖說明

圖1為芝麻枯萎病毒素主要成分收集結(jié)果，在17.520min~17.978min處收集脫氫鐮刀菌酸；在18.321min~18.860min處收集鐮刀菌酸，其中1為脫氫鐮刀菌酸，2為鐮刀菌酸；

圖2為分離純化的芝麻枯萎病菌鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸；左側(cè)為白色粉末狀的鐮刀菌酸，右側(cè)為微黃色片狀的脫氫鐮刀菌酸；

圖3為芝麻枯萎病菌鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸結(jié)構(gòu)式；上圖為鐮刀菌酸結(jié)構(gòu)式，下圖為9,10-脫氫鐮刀菌酸結(jié)構(gòu)式；

圖4為5μg/mL芝麻枯萎病菌鐮刀菌酸、5μg/mL脫氫鐮刀菌酸處理下豫芝11號幼苗生長情況，其中1、4圖分別為5μg/mL芝麻枯萎病菌鐮刀菌酸處理下豫芝11號幼苗和根生長受到抑制，幼苗子葉剛剛展開，根伸長緩慢；2、5圖分別為5μg/mL芝麻枯萎病菌鐮刀菌酸處理下豫芝11號幼苗和根生長受到抑制，幼苗子葉剛剛展開，根伸長緩慢；3、6為清水對照下豫芝11號幼苗和根生長情況，幼苗真葉已展開，根生長正常。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本申請做進(jìn)一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中涉及部分生物材料及實驗設(shè)備情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

豫芝11號，由河南省農(nóng)科院芝麻種質(zhì)保藏中心提供，可從公開渠道獲得；

下述實施例中所采用的尖孢鐮刀菌芝麻?；途闔SFO07021，由河南省農(nóng)科院芝麻中心提供，可由公開渠道獲得；下述實施例中芝麻枯萎病菌毒素的提取僅以此菌株為例進(jìn)行實驗，不應(yīng)理解為本發(fā)明的技術(shù)方案特定依賴于或者說特定限定于該菌株；

培養(yǎng)基：

下述實施例中所涉及培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，主要有：

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-18g，蒸餾水1000mL；

PD培養(yǎng)液：與PDA平板培養(yǎng)基相比，不含瓊脂；

理查德培養(yǎng)基：KNO₃ 10g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，F(xiàn)eCl₃ 0.02g，蔗糖50g，蒸餾水1000mL。

實施例1

本實施例首先就芝麻枯萎病菌毒素的制備簡要介紹如下。芝麻枯萎病菌毒素可參考現(xiàn)有炭吸附法（臺蓮梅等，尖孢鐮刀菌毒素的初步研究，2004，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，16(4)：9~12）進(jìn)行制備，也可按如下步驟制備獲得。

以尖孢鐮刀菌芝麻?；途闔SFO07021為例，芝麻枯萎病菌毒素的制備方法詳述如下。

（1）菌株預(yù)培養(yǎng)，具體為：

用無菌牙簽將芝麻枯萎病菌（即尖孢鐮刀菌芝麻專化型）菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃、培養(yǎng)7 d。

無菌條件，沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片，接入裝有200 mL PD培養(yǎng)液的500 mL三角瓶內(nèi)，每瓶接2~3片， 28℃、120 rpm條件下，震蕩培養(yǎng)4d。

（2）菌株培養(yǎng)，具體為：

無菌條件下，以2層無菌的2層擦鏡紙作為濾網(wǎng)，對步驟（1）中培養(yǎng)結(jié)束后菌液進(jìn)行過濾，濾除菌絲，濾液中由于含有大量芝麻枯萎病菌孢子，以此作為接菌母液；

無菌條件下，取接菌母液2mL，接入裝有200mL理查德培養(yǎng)基的500mL三角瓶內(nèi)，28℃、120 rpm條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)40~50d。

（3）提取芝麻枯萎病菌毒素，具體為：

首先，無菌條件下，以2層無菌紗布作為濾網(wǎng)，將步驟（2）中培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，以濾除孢子、菌絲及細(xì)胞碎片等雜物；將濾液分批裝入50mL離心管內(nèi)，4000rpm離心15min，收集并合并上清液；

其次，將上述上清液慢慢滴加于裝有0.45μm水系濾膜的溶劑過濾器中，真空抽濾，收集并合并濾液，用2N（2mol/L）鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=3.0；

最后，向濾液中加入與濾液體積相等的乙酸乙酯作為萃取劑進(jìn)行萃?。挥?00mL分液漏斗中萃取3次，每次萃取15~20min；合并上層有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥，濾除硫酸鈉后，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除乙酸乙酯，最終得棕黃色固體產(chǎn)品，即為芝麻枯萎病菌毒素。

實施例2

以實施例1所制備芝麻枯萎病菌毒素為例，從其分離鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸的操作步驟具體如下所述。

（1）樣品溶解，稱取實施例1所制備的干燥的芝麻枯萎病菌毒素固體樣品1g，溶解于5%的乙腈水溶液中，用0.22μm混合濾膜過濾，注入進(jìn)樣瓶中，冷藏備用。

（2）色譜分離，將步驟（1）中溶解后樣品放在Waters Prep 150 LC液相色譜儀（美國）的進(jìn)樣位置，采用色譜柱：XBridge Prep C18 （5μm）19×150mm 柱；

步驟（1）中溶解的樣品在流動相A和流動相B中采用梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫分離；

流動相A為乙腈（TEDIA，美國），流動相B為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的乙酸水溶液（乙酸為高效液相色譜純度級別，水為純凈水級別）；

梯度洗脫程序：

① 0~12min時，A：B=5：95；12~13min，A:B比例從5：95逐漸變?yōu)?7：73；

②13~16min時，A：B==27：73；

③16~17min時，A：B比例從27：73逐漸變?yōu)?0：90；

④ 17~20min時，A：B=10：90；

⑤ 20~21min時，A：B比例從10：90逐漸變?yōu)?：95；

⑥ 21~22min時，A：B=5：95；

流速：10mL/min，檢測波長：270nm，進(jìn)樣量：500μL。

（3）成分收集，如圖1所示，在17.520min~17.978min處收集含脫氫鐮刀菌酸溶液；在18.321min~18.860min處收集含鐮刀菌酸溶液。

（4）提純，對步驟（3）中所收集的含脫氫鐮刀菌酸溶液和含鐮刀菌酸溶液分別在30℃條件下進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除部分溶劑，然后分別在真空凍干機(jī)中凍干，即可得到白色粉末狀的鐮刀菌酸和微黃色片狀的脫氫鐮刀菌酸（如圖2所示）。

對所制備的鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸的液質(zhì)、紅外、核磁共振氫譜等分析表明：白色粉末為5-丁基-吡啶-2-羧酸，分子量為179.22，分子式為C₁₀H₁₃NO₂，純度達(dá)到95%以上；微黃色片狀物為9,10-脫氫鐮刀菌酸，分子量為177.20，分子式為C₁₀H₁₁NO₂，純度達(dá)到95%以上。鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸的結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

實施例3

對實施例2所分離的鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸，對其對芝麻的毒害作用進(jìn)行分析評價，具體實驗過程簡述如下。

（1）種子消毒與接種，具體為：

挑選飽滿健康的豫芝11號種子500粒，先用清水沖洗種子表面3~5遍；

然后將種子浸泡于75%酒精中30 s，無菌水沖洗3遍；

再然后用3%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗種子3~4遍；

將消毒后的種子放入裝有10 mL無菌水的三角瓶中振蕩培養(yǎng)過夜；

挑選露白的芝麻種子，接種在MS固體培養(yǎng)基上，每份培養(yǎng)基中接種50粒露白種子；25℃、L//D=14 h//10 h光照/d條件下培養(yǎng)1周；

（2）分別配置含有鐮刀菌酸、脫氫鐮刀菌酸的MS培養(yǎng)基，具體為：

配置MS培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，1.5%瓊脂粉），分別加入實施例2所分離的鐮刀菌酸、脫氫鐮刀菌酸，使鐮刀菌酸、脫氫鐮刀菌酸的終濃度均為5μg/mL；

（3）在含鐮刀菌酸、脫氫鐮刀菌酸的培養(yǎng)基中接種芝麻幼苗，具體為：

無菌條件下，切取步驟（1）所培育的芝麻幼苗根莖基部以上部分（無根苗），分別接種于步驟（2）中所制備的固體MS培養(yǎng)基上，同時設(shè)置空白MS培養(yǎng)基作為隱性對照；每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)接種10株無根苗；

（4）性狀統(tǒng)計及結(jié)果判定，具體為：

在步驟（3）中接種無根苗2周后，統(tǒng)計芝麻幼苗株高、生根數(shù)、根長等數(shù)據(jù)，并拍照記錄，最終綜合評價鐮刀菌酸、脫氫鐮刀菌酸對芝麻幼苗的生長是否具有抑制作用，及抑制程度（如圖4所示）。

采用本技術(shù)方法從芝麻枯萎病菌毒素（粗毒素）分離出的鐮刀軍算和脫氫鐮刀菌酸對芝麻幼苗進(jìn)行處理。從圖中可以看出，鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸均對芝麻幼苗生長表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制生長作用。清水對照組中芝麻幼苗處理1對真葉期，發(fā)根數(shù)量多在3-7個，長約3-4cm，長勢正常。而5μg/mL鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸處理的芝麻幼苗生長緩慢，處于子葉展開時期，根生長顯著受到抑制，該結(jié)果表明，采用本技術(shù)方法分離出的鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸對芝麻幼毒害作用。