本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記領(lǐng)域，特別是一種用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的二乙烯三胺四乙酸類順磁探針。

背景技術(shù)：

高分辨順磁核磁共振在在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)及動(dòng)態(tài)學(xué)方面的研究中發(fā)揮著重要作用。此技術(shù)通過(guò)順磁中心的未配對(duì)電子與蛋白質(zhì)分子自旋核的相互作用來(lái)提供有價(jià)值的長(zhǎng)程結(jié)構(gòu)限制信息，包括順磁弛豫增強(qiáng)(paramagnetic relaxation enhancement，PRE)、贋接觸化學(xué)位移(pseudocontact shifts，PCS)、殘余偶極耦合(residual dipolar couplings，RDC)等，利用這些順磁信息，我們可研究生物大分子的空間結(jié)構(gòu)、生物功能以及分子之間的相互作用。此外，由于此種方法能夠充分模擬蛋白質(zhì)所處的生理環(huán)境(如溫度、pH、鹽濃度、擁擠程度等)，并可在接近生理?xiàng)l件下測(cè)定蛋白質(zhì)分子的溶液結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)學(xué)信息，因此更有利于真實(shí)地了解蛋白質(zhì)的實(shí)際狀態(tài)和行為，參見(jiàn)：a)J.Biomol.NMR,2010,46:101-112；b)Annu RevBiophys,2010,39:387-405；c)Chem Rev,2009,109:4108-4139；d)Prog NMR Spectr,2002,40:249-273。

大多數(shù)蛋白質(zhì)并不含天然的順磁中心，為準(zhǔn)確獲取上述信息需借助合適的功能有機(jī)小分子探針。此類探針通常包含一個(gè)具有很強(qiáng)金屬離子(如鑭系金屬離子和過(guò)渡金屬離子)螯合性能的基團(tuán)和一個(gè)可參與蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的活性反應(yīng)基團(tuán)(如與蛋白質(zhì)表面半胱氨酸反應(yīng))。連接后，由于順磁效應(yīng)，順磁中心附近氨基酸殘基的化學(xué)環(huán)境會(huì)發(fā)生較大的變化，導(dǎo)致核磁共振譜峰的化學(xué)位移亦發(fā)生明顯改變，進(jìn)而獲取相關(guān)的順磁數(shù)據(jù)。也就是說(shuō)，雙功能有機(jī)小分子順磁探針的設(shè)計(jì)與合成在蛋白質(zhì)的順磁研究中有著舉足輕重的地位，參見(jiàn)：ChineseJMagn Reson,2014,31,155-171。

一個(gè)性能良好的有機(jī)小分子順磁探針，通常含有多氨基多羧基的親水結(jié)構(gòu)。這些親水結(jié)構(gòu)通常又由一些常見(jiàn)的有機(jī)螯合配體衍生而來(lái)，如非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、吡啶-2,6-二甲酸(DPA)、2,6-吡啶二甲氨基-N,N,N′,N′-四乙酸(PyMTA)等，環(huán)狀結(jié)構(gòu)的1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)等。由上述配體衍生而來(lái)的順磁探針均可與順磁金屬離子配位形成熱力學(xué)穩(wěn)定的配合物。圖1中列出了已報(bào)道的部分代表性的順磁探針。

Leonov(Chem.Eur.J.,2005,11:3342-3348)和Haberz(Org.Lett.,2006,8:1275-1278)等人以EDTA為骨架，在乙二胺骨架上直接引入手性中心并導(dǎo)入活性連接基團(tuán)，分別報(bào)道了立體化學(xué)純的探針T1和T2，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：T1、T2與各項(xiàng)異性的順磁金屬離子配位后在¹H-¹⁵N HSQC譜圖上只呈現(xiàn)出一套順磁峰，充分限制了新手性中心的產(chǎn)生，避免了譜圖的復(fù)雜化，可很好地用于獲取蛋白質(zhì)的順磁信息，但上述化合物也有一定的弊端，它們需通過(guò)嚴(yán)格的手性拆分才能得到，其制備過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)。

Prudêncio等人(Chem.Eur.J.,2004,10:3252-3260)基于DTPA設(shè)計(jì)并報(bào)道了含有更多配位點(diǎn)的探針T3，且此探針具有兩個(gè)活性巰基，可同時(shí)與蛋白質(zhì)表面上距離為的兩個(gè)半胱氨酸殘基反應(yīng)(這里應(yīng)注意：含多個(gè)半胱氨酸殘基的蛋白在表達(dá)及純化中可能形成二聚或沉淀)，增加連接剛性，有效限制探針與蛋白質(zhì)表面的相互運(yùn)動(dòng)，避免PCS平均化。然而T3與Ln³⁺螯合后會(huì)產(chǎn)生多種對(duì)映異構(gòu)體，導(dǎo)致¹H-¹⁵N譜圖出現(xiàn)至少五套順磁峰，難以指認(rèn)，因此多用于PRE研究。

Su等人(Chem.Commun.,2015,51:2824-2827)創(chuàng)新性地將苯砜基引入吡啶環(huán)對(duì)位，報(bào)道了探針T4、T5，此項(xiàng)改進(jìn)極大限度的縮短了探針與目的蛋白間的距離，剛性也較二硫鍵或雙鍵等連接方式有顯著提升，探針骨架具有很強(qiáng)的螯合金屬離子的能力，產(chǎn)物無(wú)手性，探針-蛋白復(fù)合物在滴加Ln³⁺后也僅呈現(xiàn)出一套PCS，從而更有利于PCS數(shù)據(jù)的分析處理。

Graham等人(Bioconjugate Chem.2011,22,2118-2125)報(bào)道了DOTA大環(huán)類探針，即圖1中的化合物T6，這種大環(huán)化合物較為特殊的空間構(gòu)象，可與順磁金屬離子形成高配位化合物，對(duì)稱性高，結(jié)合緊密，具有高度的熱力學(xué)穩(wěn)定性，可獲取較大的PCS，但形成配合物的過(guò)程較為緩慢，通常需要長(zhǎng)時(shí)間的加熱或回流才能制備。相比之前的DOTA類探針，它在氮原子上引入了手性官能團(tuán)，可獲得更好的動(dòng)力學(xué)惰性和更少的非對(duì)映異構(gòu)體，從而避免出現(xiàn)多套峰而造成PCS復(fù)雜化。

因此，在設(shè)計(jì)與合成一個(gè)性能優(yōu)越的功能有機(jī)小分子順磁探針時(shí)，需綜合考慮以下幾方面：

1)被螯合的順磁金屬離子應(yīng)接近蛋白質(zhì)表面。距離太遠(yuǎn)將不利于順磁信息的準(zhǔn)確獲取。

2)體積小，與蛋白質(zhì)剛性連接。若探針體積過(guò)大，會(huì)因空間位阻等原因造成連接效率低下甚至無(wú)法連接，同時(shí)，在一定程度上也會(huì)影響溶液中蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及功能；若探針與蛋白質(zhì)連接后剛性不強(qiáng)，則會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)表面發(fā)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，造成PCS和RDC明顯降低。

3)無(wú)手性中心，構(gòu)象單一。探針與順磁金屬離子配位后若產(chǎn)生多個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體，NMR譜圖中會(huì)出現(xiàn)多套順磁峰，導(dǎo)致譜圖復(fù)雜而難以分析。

4)水溶性良好。一個(gè)水溶性好的探針才能更方便快捷地在生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定點(diǎn)修飾。

探針與蛋白質(zhì)的化學(xué)連接主要依賴于蛋白質(zhì)的表面活性殘基，半胱氨酸殘基中的巰基常被用于連接修飾，其主要原因有以下兩點(diǎn)：1)蛋白質(zhì)中表面活性巰基的含量相對(duì)較少(1-2％)，可達(dá)到蛋白質(zhì)單一定點(diǎn)修飾的目的(Protein.Eng.,2002,15:353-358.)；2)巰基化學(xué)發(fā)展已較為成熟，巰基的親核性也遠(yuǎn)強(qiáng)于蛋白質(zhì)中的其他親核基團(tuán)，這使其具有較高的反應(yīng)活性，可參與多種連接反應(yīng)。除此之外，在蛋白質(zhì)指定位點(diǎn)通過(guò)基因突變技術(shù)單一引入半胱氨酸殘基的簡(jiǎn)便性也使此種手段的應(yīng)用更加廣泛，參見(jiàn)Bioconjug.Chem.,2008,19:2527-2534。在以往的研究中，通過(guò)二硫鍵將含有活化巰基的探針與蛋白質(zhì)連接的方法應(yīng)用最為廣泛，參見(jiàn)J.Am.Chem.Soc.,2009,131:14761-14767。此外，巰基與缺電子烯烴的硫醇烷基化也能達(dá)到很好的連接效果，同時(shí)也突破了二硫鍵連接時(shí)連接產(chǎn)物在還原條件下不穩(wěn)定的限制，參見(jiàn)Chem.Eur.J.2013,19,1097-1103。之后，將苯砜基代替雙鍵，前者作為離去基與蛋白質(zhì)巰基發(fā)生親核取代反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，可選擇性與單一巰基連接，產(chǎn)物穩(wěn)定，連接效果較雙鍵而言更加剛性，參見(jiàn)Chem.Commun.,2015,51:2824-2827；非天然氨基酸的引入使得點(diǎn)擊化學(xué)，參見(jiàn)Bioconjugate Chem.,2013,24:260-268以及水環(huán)境下的多種偶聯(lián)反應(yīng)，參見(jiàn)J.Am.Chem.Soc.,2013,135,13612-13615能更好的應(yīng)用于蛋白質(zhì)連接，為蛋白質(zhì)連接技術(shù)注入新鮮活力。圖2為部分已報(bào)道的蛋白連接方式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)分析和存在問(wèn)題，提供一種用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的二乙烯三胺四乙酸類順磁探針，該探針具有八個(gè)配位點(diǎn)，通過(guò)苯砜基與蛋白質(zhì)巰基的反應(yīng)剛性連接，齒合度高、螯合性好、構(gòu)象單一、水溶性好，可直接用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的二乙烯三胺四乙酸類順磁探針，其化學(xué)名稱為4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

該探針具有八個(gè)配位點(diǎn)，含四個(gè)羧基、三個(gè)氮原子和一個(gè)吡啶氮，并通過(guò)吡啶環(huán)對(duì)位的苯砜基與蛋白質(zhì)巰基在水溶液中的親核取代反應(yīng)進(jìn)行剛性連接。

一種所述用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的二乙烯三胺四乙酸類順磁探針的制備方法，步驟如下：

1)2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制備

將2,6-二甲基吡啶、雙氧水和冰乙酸按用量比1g:1.8mL:5mL混合，在60-90℃下反應(yīng)5-10h，旋干溶劑，冰水浴下用飽和碳酸鉀溶液調(diào)pH至8-9，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，柱分離，得到淡黃色油狀液體2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；

2)4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制備

將上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、濃度為98wt％的硫酸和濃度為98wt％的硝酸按用量比1g:3mL:3.5mL混合，加熱回流反應(yīng)5-10h，按2-甲基吡啶-N-氧化物與冰水用量比為1g:25mL加入冰水并在水浴下用無(wú)水碳酸鉀調(diào)pH至8-9，依次用乙酸乙酯萃取、飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相、無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，得到淡黃色粉末狀固體4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物；

3)4-硝基-2-羥甲基-6-甲基吡啶的制備

將上述4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物、三氟乙酸酐和二氯甲烷按用量比1g:4.5mL:13mL混合，加熱回流反應(yīng)15-20h，旋干溶劑，按4-硝基-2-甲基吡啶-N-氧化物與飽和碳酸鉀溶液用量比為1g:18mL加入飽和碳酸鉀溶液，室溫下攪拌2-5h，依次用乙酸乙酯萃取、飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相、無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，柱分離，得到淡黃色固體4-硝基-2-羥甲基-6-甲基吡啶；

4)4-苯砜基-2-羥甲基-6-甲基吡啶的制備

將上述4-硝基-2-羥甲基-6-甲基吡啶、硫代苯亞磺酸鈉和無(wú)水乙腈按用量比1g:1.6g:40mL混合，加熱回流反應(yīng)15-20h，旋干溶劑，加入乙酸乙酯萃取，飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相、無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，柱分離，得到乳白色粉末狀固體4-苯砜基-2-羥甲基-6-甲基吡啶；

5)4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶的制備

將上述4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶、三溴化磷和三氯甲烷按質(zhì)量體積比1g:1.1mL:30mL混合，加熱回流反應(yīng)3-6h，旋干溶劑，然后按質(zhì)量體積比1g:25mL加入冰水，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8-9，依次用二氯甲烷萃取、飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相、無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，得到淡黃色油狀液體-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶；

6)N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)二乙基三胺的制備

將二乙基三胺、鄰苯二甲酰亞胺、冰乙酸按用量比1mL:2.9g:13mL混合，加熱回流3-5h，旋出冰乙酸，用飽和碳酸鉀溶液調(diào)pH至8-9，過(guò)濾，水洗，真空干燥，得乳白色固體N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)二乙基三胺；

7)4-苯砜基-2-[N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶的制備

將上述4-苯砜基-2-溴-6-甲基吡啶、鄰苯二甲酰亞胺保護(hù)后的二乙烯三胺、無(wú)水碳酸鉀和無(wú)水乙腈按質(zhì)量體積比1g:1.65g:3.2g:70mL混合，氬氣保護(hù)下加熱回流反應(yīng)5-10h，過(guò)濾并旋干溶劑，柱分離，得乳白色固體4-苯砜基-2-[N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶；

8)4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶的制備

將上述4-苯砜基-2-[N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶、80wt％水合肼、無(wú)水甲醇按質(zhì)量體積比1g:1mL:30mL混合，劇烈回流反應(yīng)20-30h，經(jīng)過(guò)濾并將濾液濃縮至干，用二氯甲烷萃取，飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相、無(wú)水硫酸鈉干燥，得到黃色粘稠液體4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶；

9)4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亞甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶的制備

將上述4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶、溴乙酸乙酯、無(wú)水碳酸鉀和無(wú)水乙腈按用量比1g:5mL:9g:55mL混合，氬氣保護(hù)、室溫條件下反應(yīng)40-50h，經(jīng)過(guò)濾并將濾液濃縮至干，殘留物依次用乙酸乙酯溶解、飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相、無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，柱分離后，得到棕黃色油狀液4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亞甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶；

10)4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸的制備

將上述4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亞甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇和蒸餾水按用量比1g:0.48g:10mL:10mL混合，室溫下攪拌反應(yīng)5-10h，分批少量加入H⁺離子交換樹(shù)脂調(diào)pH至3-4，用無(wú)水甲醇洗滌樹(shù)脂至無(wú)熒光，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，得乳白色固體4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，即目標(biāo)探針產(chǎn)物二乙烯三胺四乙酸類順磁探針。

一種所述用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的二乙烯三胺四乙酸類順磁探針的應(yīng)用，直接用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該探針具有八個(gè)配位點(diǎn)，含四個(gè)羧基、三個(gè)氮原子和一個(gè)吡啶氮，通過(guò)苯砜基與蛋白質(zhì)巰基的反應(yīng)剛性連接，齒合度高、螯合性好(多個(gè)配位點(diǎn))、構(gòu)象單一、水溶性好，可直接用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。

附圖說(shuō)明

圖1為部分已報(bào)道順磁探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖2為部分已報(bào)道的蛋白連接方式。

圖3探針4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亞甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶與目的蛋白的連接方式。

圖4 25℃，pH 6.4條件下，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液。0.10mM的蛋白-探針復(fù)合物與1.0倍量的順磁金屬離子Tm³⁺(銩)滴定前后的¹H-¹⁵N HSQC重疊譜圖，灰色表示未滴加金屬離子，黑色表示滴加順磁Tm³⁺(銩)。

圖5為二乙烯三胺四乙酸類順磁探針的合成路線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：

一種用于蛋白質(zhì)順磁標(biāo)記的二乙烯三胺四乙酸類順磁探針，其化學(xué)名稱為4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

該探針具有八個(gè)配位點(diǎn)，含四個(gè)羧基、三個(gè)氮原子和一個(gè)吡啶氮，并通過(guò)吡啶環(huán)對(duì)位的苯砜基與蛋白質(zhì)巰基在水溶液中的親核取代反應(yīng)進(jìn)行剛性連接；

其合成步驟如下：

1)2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制備

在250mL三口瓶中，將10g 2,6-二甲基吡啶、9mL雙氧水和50mL冰乙酸混合，在70℃下反應(yīng)4h，隨后立即加入另一半9mL雙氧水，繼續(xù)反應(yīng)6h，呈現(xiàn)淡黃色透明體系，旋干溶劑，冰水浴下用飽和碳酸鉀溶液調(diào)pH至8-9，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，柱分離，得到淡黃色油狀液體2,6-二甲基吡啶-N-氧化物7.25g。產(chǎn)率：63％。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：8.31(1H，d，J＝7.08Hz)，8.17(1H，d，J＝3.02Hz)，7.95(1H，dd，J＝7.08Hz，J＝3.02Hz)，2.61(6H，s)。

2)4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物的制備

在250mL三口瓶中，加入20mL濃度為98wt％的硫酸，冰水浴降溫，逐滴滴加7.30g上述2,6-二甲基吡啶-N-氧化物，然后繼續(xù)滴加25mL濃度為98wt％的硝酸混合，加熱回流(T＝120℃)反應(yīng)6h，按2-甲基吡啶-N-氧化物與冰水用量比為1g:25mL加入冰水并在水浴下用無(wú)水碳酸鉀調(diào)pH至8-9，依次用乙酸乙酯萃取、飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相、無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾后將濾液濃縮至干，得到淡黃色粉末狀固體4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物7.40g。產(chǎn)率：74％。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δppm：8.07(2H，s)，2.58(6H，s)。

3)4-硝基-2-羥甲基-6-甲基吡啶的制備

在250mL單口瓶中，加入35mL二氯甲烷，4g 4-硝基-2,6-二甲基吡啶-N-氧化物，冰水浴降溫，逐滴滴加9mL三氟乙酸酐，滴畢，加熱回流(T＝40℃)21h，體系呈現(xiàn)橙紅色，并隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)顏色逐漸加深。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液濃縮至干，向殘余物中加入20mL飽和碳酸鉀溶液，室溫?cái)嚢?h，體系中有橙紅色固體析出。乙酸乙酯萃取，飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾，濾液濃縮至干，柱分離，得淡黃色固體2.90g。產(chǎn)率：73％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:7.87(1H,s),7.81(1H,s),4.89(2H,d,J＝5.16Hz),2.74(3H,s)。

4)4-苯砜基-2-羥甲基-6-甲基吡啶的制備

在250mL三口瓶中，將2g 4-硝基-2-羥甲基-6-甲基吡啶、3.2g硫代苯磺酸鈉，0.20g四丁基溴化銨和80mL無(wú)水乙腈混合，抽真空，氬氣保護(hù)，加熱回流(T＝80℃)15h，體系呈現(xiàn)淡黃色，且反應(yīng)過(guò)程中伴隨有淡紅棕色氣體產(chǎn)生，反應(yīng)結(jié)束。過(guò)濾，濾液濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，飽和氯化鈉溶液洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾，濾液再次濃縮至干，柱分離，得乳白色固體1.75g。產(chǎn)率：56％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:7.98(2H,d,J＝6.88Hz),7.65(2H,d,J＝6.80Hz),7.56(3H,d,J＝10.28Hz),4.80(2H,s),2.64(3H,s)。

5)4-苯砜基-2-溴甲基-6-甲基吡啶的制備

在100mL單口瓶中，加入20mL氯仿，0.70g 4-苯砜基-2-羥甲基-6-甲基吡啶，冰水浴降溫，逐滴滴加溶有三溴化磷的氯仿溶液(0.80mL三溴化磷/10mL氯仿)，加畢，撤冰水浴，加熱回流(T＝60℃)4.5h，由乳白色渾濁變?yōu)榈S色澄清體系，反應(yīng)結(jié)束。將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)水相pH至8-9，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)相。過(guò)濾，濾液濃縮至干，得淡黃色油狀液體，放置若干小時(shí)后變?yōu)榈S色固體0.60g。產(chǎn)率：69％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.00(1H,s),7.98(1H,d,J＝1.32Hz),7.73(1H,s),7.68(1H,t,J＝7.36Hz),7.59(2H,t,J＝7.24Hz),7.54(1H,s),4.55(2H,s),2.64(3H,s)。

6)N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)二乙基三胺的制備

在500mL三口瓶中，加入150mL冰乙酸，35.25g鄰苯二甲酰亞胺，滴加12.20mL二乙烯三胺，滴畢，呈現(xiàn)淡黃色渾濁體系，加熱回流(T＝120℃)3.5h，體系逐漸變?yōu)榘导t色，停止加熱，反應(yīng)結(jié)束。將體系中的冰乙酸蒸出，用飽和碳酸鉀溶液調(diào)pH至9-10，有大量淡黃色固體析出，過(guò)濾并洗滌，真空干燥濾渣，得乳白色粉末狀固體38.90g。產(chǎn)率：89％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm：7.77-7.69(8H,m),3.81(4H,t,J＝5.96Hz),2.99(4H,t,J＝5.96Hz)。

7)4-苯砜基-2-[N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶的合成制備

在100mL單口瓶中，將0.50g 4-苯砜基-2-溴甲基-6-甲基吡啶、0.83gN,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)二乙基三胺、1.60g無(wú)水碳酸鉀和35mL無(wú)水乙腈混合，氬氣保護(hù)，加熱回流(T＝80℃)8h，變?yōu)殚冱S色體系，反應(yīng)結(jié)束。過(guò)濾，濾液濃縮至干，柱分離，得乳白色蓬松狀固體0.85g。產(chǎn)率：91％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:7.98(2H,d,J＝7.88Hz),7.77-7.70(8H,m),7.63(1H,s),7.59(1H,t,J＝7.04Hz),7.53(2H,t,J＝7.12Hz),7.36(1H,s),3.92(2H,s),3.78(4H,t,J＝6.36Hz),2.90(4H,t,J＝6.20Hz),2.55(3H,s)。

8)4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶的制備

在100mL單口瓶中，加入30mL甲醇，1.00g 4-苯砜基-2-[N,N-二(2-鄰苯二甲酰亞胺基)乙基氨甲基]-6-甲基吡啶，攪拌下滴加0.95mL 80％的水合肼，滴畢，加熱劇烈回流(T＝70℃)20h，隨著反應(yīng)的進(jìn)行瓶壁有土黃色固體附著，反應(yīng)結(jié)束。過(guò)濾，濾液濃縮至干，得淡黃色粘稠狀固體，二氯甲烷固相萃取，過(guò)濾，再次將濾液濃縮至干，重復(fù)萃取至最終濃縮物不再出現(xiàn)固體，得淡黃色粘稠油狀液體0.40g。產(chǎn)率：70％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:7.95(2H,d,J＝7.56Hz),7.70(1H,s),7.61(1H,t,J＝7.24Hz),7.52(2H,t,J＝7.40Hz),7.47(1H,s),3.78(2H,s),2.77(4H,t,J＝5.80Hz),2.60(4H,t,J＝5.74Hz),2.57(3H,s)。

9)4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亞甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶的制備

在100mL單口瓶中，將0.40g 4-苯砜基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]-6-甲基吡啶，4.40g無(wú)水碳酸鉀和25mL無(wú)水乙腈混合，冰水浴降溫，逐滴滴加溶有溴乙酸乙酯的無(wú)水乙腈溶液(2.20mL溴乙酸乙酯/20mL無(wú)水乙腈)，滴畢，撤冰水浴，氬氣保護(hù)，室溫?cái)嚢?8h，顏色逐漸變黃，反應(yīng)結(jié)束。過(guò)濾，濾液濃縮至干，柱分離，得棕黃色油狀液體0.40g。產(chǎn)率：50％。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:8.01(2H,d,J＝7.32Hz),7.82(1H,s),7.64(1H,t,J＝7.24Hz),7.57(2H,t,J＝7.12Hz),7.46(1H,s),4.15(8H,q,J＝7.08Hz),3.83(2H,s),2.86(4H,t,J＝6.44Hz),2.67(4H,t,J＝7.64Hz),2.59(3H,s),1.26(12H,t,7.12Hz)；MS-ESI(+):693.3。

10)4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸的制備

在100mL單口瓶中，加入0.38g 4-苯砜基-2-{N,N-二[乙二氨基-N′,N″-二(乙氧羰基亞甲基)]氨甲基}-6-甲基吡啶，4mL無(wú)水乙醇，6mL蒸餾水，逐滴滴加氫氧化鈉溶液(0.18g氫氧化鈉/3mL蒸餾水)，室溫?cái)嚢?h，分批少量加入H⁺離子交換樹(shù)脂調(diào)pH至3-4，無(wú)水甲醇多次洗滌H⁺離子交換樹(shù)脂，過(guò)濾，濾液呈現(xiàn)棕黃色透明狀，濃縮至干。將殘留物溶于10mL丙酮中，室溫?cái)嚢?.5h，過(guò)濾，紅外干燥濾渣，得淡黃色粉末狀固體0.26g，即為目標(biāo)產(chǎn)物二乙烯三胺四乙酸類順磁探針，產(chǎn)率：82％。¹H-NMR(400MHz,90％H₂O+10％D₂O)δppm:7.96(2H,d,J＝7.92Hz),7.86(1H,s),7.74(1H,s),7.66(1H,t,J＝7.52Hz),7.56(2H,t,J＝8.12Hz),3.83(2H,s),3.59(8H,s),3.27(4H,t,J＝6.96Hz),2.86(4H,t,J＝6.88Hz),2.53(3H,s)；¹³C-NMR(100MHz,90％H₂O+10％D₂O)δppm:169.72,160.91,157.70,151.91,150.98,137.40,135.23,130.00,128.16,121.61,118.72,57.30,56.67,52.10,48.09,22.66；MS-ESI(–):579.2。

該二乙烯三胺四乙酸類順磁探針的合成路線如圖5所示。

所制備的二乙烯三胺四乙酸類順磁探針直接用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。

該二乙烯三胺四乙酸類順磁探針的應(yīng)用研究：

高分辨順磁核磁共振在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究中發(fā)揮著重要的作用。此部分研究主要通過(guò)獲取贋接觸化學(xué)位移來(lái)驗(yàn)證探針的相關(guān)性能是否優(yōu)良，并旨利用上述信息研究生物大分子的空間結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化及分子間的相互作用。

該二乙烯三胺四乙酸類順磁探針含有多個(gè)配位點(diǎn)，可以螯合順磁金屬離子生成穩(wěn)定的絡(luò)合物，并通過(guò)吡啶對(duì)位的苯砜基與蛋白質(zhì)中的巰基選擇性反應(yīng)連接，與目的蛋白連接后，由于順磁效應(yīng)，連接位點(diǎn)附近氨基酸殘基的化學(xué)環(huán)境會(huì)發(fā)生較大變化，進(jìn)而導(dǎo)致核磁譜峰的化學(xué)位移也發(fā)生明顯改變，最終獲取PCS數(shù)據(jù)。此種連接方式剛性強(qiáng)，且順磁中心距離蛋白質(zhì)表面更近，便于順磁研究，可得到理想的高分辨核磁譜圖。

該二乙烯三胺四乙酸類順磁探針與蛋白質(zhì)的連接方式如圖3所示。

為了研究此類探針的順磁性能是否良好，我們將其與目的蛋白—人體泛素蛋白-S57C突變體在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行反應(yīng)連接，并用核磁手段來(lái)獲取相關(guān)順磁數(shù)據(jù)，具體操作過(guò)程如下：

1)配置50mM的4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸探針溶液，定量稱取，加入超純水和適量鹽酸溶解；

2)采集人體泛素蛋白-S57C在三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液pH 7.6時(shí)的¹H-¹⁵N HSQC譜圖作為空白對(duì)照；

3)在人體泛素蛋白-S57C中加0.5倍量的三(2-羧基乙基)膦(TCEP)，室溫放置20min；

4)再向3)中加入5倍量的已配制好的探針溶液，調(diào)節(jié)體系pH為7.6；

5)通過(guò)采集混合物在不同時(shí)刻的¹H-¹⁵N HSQC譜圖來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，直至反應(yīng)完全；

6)反應(yīng)完全后，將反應(yīng)混合物經(jīng)超濾濃縮并用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液洗滌2-3次，去除多余的游離探針和少量的鹽，之后進(jìn)一步使用Mini Q柱進(jìn)行純化，分離蛋白-探針復(fù)合物與未連接的蛋白和探針。

7)配制0.1mM，pH 6.4的蛋白-探針復(fù)合物溶液(用2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液配制)，加入10mM的硝酸銩溶液(1equiv)充分混合，采集¹H-¹⁵N HSQC譜圖。

我們將滴加硝酸銩前后的兩張¹H-¹⁵N HSQC譜圖重疊，如圖4(灰色：未滴加硝酸銩；黑色：滴加硝酸銩)所示。之后我們發(fā)現(xiàn)，人體泛素蛋白-S57C突變體的探針復(fù)合物與鑭系金屬離子三價(jià)銩作用后表現(xiàn)為單一順磁信號(hào)峰，并產(chǎn)生較大的PCS，這表明無(wú)論從連接剛性還是結(jié)合金屬離子強(qiáng)弱程度的方面考慮，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成的有機(jī)功能小分子順磁探4-苯砜基-6-甲基-2-[N,N-二(乙二氨基)氨甲基]吡啶-N′,N′,N″,N″-四乙酸具有良好的順磁性能，是一個(gè)在蛋白質(zhì)順磁研究中頗有前景的一個(gè)探針。

上述所有核磁實(shí)驗(yàn)都是在溫度為25℃下，Bruker-600MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀采樣。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Topspin、Sparky和Corel DRAW軟件處理完成。