本發(fā)明涉及制藥技術，具體涉及吡啶腙二硫代甲酸衍生物及其制備方法和應用。

背景技術：

癌癥是嚴重影響人類生活質量和生存的重大疾病之一，對其浸潤轉移其他組織與器官人類尚無可行方法加以阻止。當前癌癥治療的主要手段有：手術治療、放療、化療、生物治療和中醫(yī)藥治療。由于缺乏診斷技術，是否浸潤轉移無法確認，所以利用化學治療(化療)仍是臨床上殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長繁殖的主要手段。然而，化療藥物自身的毒副作用以及產生的耐藥性限制它們的廣泛應用。多藥聯合療法雖然有助于減少藥抗，但無法消除化療的脫發(fā)、嘔吐、白細胞減少等毒副作用。開發(fā)新型、高效、毒副作用小、選擇性高的藥物是當前藥物研究重要任務。

二硫代甲酸衍生物由于良好的生物活性備受藥物工作者青睞，它們廣泛用于殺蟲劑。研究表明：吡咯二硫代甲酸酯可抑制核因子(NF-kB)，進而抑制癌細胞侵襲轉移。此外，還表明二硫代甲酸氨基甲酸酯能夠上調包括血管細胞粘附分子，并有相關專利產生(見美國專利第5,380,747；中國專利：998076961)。鐵是生物體內重要的微量元素，是細胞生長必須的，由于癌細胞異?？焖偕L，對鐵的需求大于正常細胞，所以干擾鐵的代謝平衡是腫瘤藥物設計又一個策略。

技術實現要素：

本發(fā)明將二硫代甲酸與席夫堿結構單元有效結合，合成了一系列吡啶腙二硫代甲酸鹽，顯示優(yōu)異抗腫瘤活性和從鐵蛋白中釋放鐵的能力。

為了解決現有技術的不足，本發(fā)明提供了吡啶腙二硫代甲酸衍生物及其制備方法和應用。

本發(fā)明的技術方案是：吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制備方法，其特征在于，合成路線如下：

吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制備方法，所述的吡啶腙二硫代甲酸衍生物是二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀，取1mmol的KOH置于圓底燒瓶，用體積比5:1的乙醇-水混合物溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol,在溫度為0-5度環(huán)境中15分鐘之后向圓底燒瓶中逐滴加入1mmol二硫化碳，繼續(xù)反應30分鐘；隨后加入3ml溶解有1mmol二吡啶酮的無水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小時，濃縮，冷卻，得到紅棕色的粉末，即得二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制備方法，所述的吡啶腙二硫代甲酸衍生物是吡啶醛腙二硫代甲酸鉀，取1mmol的KOH置于圓底燒瓶，用體積比5:1的乙醇-水混合物溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol,在低溫環(huán)境中15min，之后向圓底燒瓶中逐滴加入1mmol二硫化碳1小時，繼續(xù)反應30分鐘；隨后加入3ml溶解有1mmol吡啶醛的無水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小時，濃縮，冷卻，得到紅棕色的粉末，即得吡啶醛腙二硫代甲酸鉀。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物在制備抑制血管形成藥物中的應用。

吡啶腙二硫代甲酸衍生物在制備治療地中海貧血藥物中的應用。

上述的應用，所述的吡啶腙二硫代甲酸衍生物是吡啶醛腙二硫代甲酸鉀或二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀。

本發(fā)明合成了一系列新型的吡啶腙二硫代甲酸鹽，具有新的生物學特性：(1)能從鐵蛋白中有效地奪取鐵離子，改變宿主細胞的鐵平衡，因而可用于地中海貧血的治療；(2)可抑制肝癌、結腸癌、卵巢癌細胞的生長，具有較小的半數抑制濃度；(3)可抑制癌細胞轉移；(4)抑制血管形成。

附圖說明

圖1a是2-二吡啶酮腙硫代甲酸對HepG2及Bel-7401肝癌細胞的抑制作用。

圖1b是2-吡啶醛腙硫代甲酸對HepG2肝癌細胞的抑制作用。

圖2a是2-二吡啶酮腙二硫代甲酸滴定鐵(III)的光譜。

圖2b是2-二吡啶酮腙二硫代甲酸與鐵(III)的絡合比為1:1其中DpkdtC代表2-二吡啶酮腙二硫代甲酸。

圖3a是不同螯合劑從鐵蛋白釋放鐵的動力學。

圖3b是不同螯合劑的化學結構。

圖4是2-二吡啶腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞抑制作用。

圖5a是對照組。

圖5b是0.25μM二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞形成圓環(huán)的抑制作用。

圖5c是0.5μM二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞形成圓環(huán)的抑制作用。

圖6是二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞轉移的抑制作用。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實施例中所用的試劑均為市售。

本發(fā)明實施例中使用的試劑和儀器如下：

試劑：MTT(Sigma)，胰酶(北京拜爾迪生物技術有限公司)，培養(yǎng)基(北京索萊寶生物技術有限公司)，血清(浙江天杭生物科技有限公司)，DMSO(天津市德恩化學試劑有限公司)，無水乙醇(天津市德恩化學試劑有限公司)，KOH(天津市德恩化學試劑有限公司)，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。80％水合肼(天津市天力化學試劑有限公司)，二硫化碳(天津市天力化學試劑有限公司)。

光譜分析儀(日本島津，型號：UV-2450)。

實施例1，二吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制備

取1mmol的KOH(56.1mg)置于圓底燒瓶，用乙醇-水混合物(5:1)溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol(50.1mg),在低溫環(huán)境中15分鐘之后向圓底燒瓶中逐滴加入1mmol(76.2mg)二硫化碳。繼續(xù)反應30分鐘。隨后加入3ml溶解有1mmol二吡啶酮的無水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小時，濃縮，冷卻，得到紅棕色的粉末，即得二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀。產率：80％，熔點：mp:140.5℃.NMR(D6-DMSO):13.35(s,NH),8.85(d,H,J＝4Hz),8.63(d,H,J＝4Hz),8.03(m,2H,J＝8Hz),7.95(d,H,J＝8Hz),7.63(dd,H,J＝4Hz),7.59(d,H,J＝8Hz),7.54(dd,H,J＝4Hz).IR(KBr壓片,cm^-1):3430,1624,1587,1519,1461,1430,1217,1187,1133,1051,1012,992,800,753,731,712,648,618,590.ESI-MS(m/z):350.9540(M-H+2K,calcd:350.9525).

實施例2、吡啶腙二硫代甲酸衍生物的制備

取1mmol的KOH(56.1mg)置于圓底燒瓶，用乙醇-水混合物(5-1)溶解放置在冰水浴，向其中加入80％的水合肼1mmol(50.1mg),在低溫環(huán)境中15min,之后向圓底燒瓶中逐滴加入1mmol(76.2mg)二硫化碳(1h)。繼續(xù)反應30分鐘。隨后加入3ml溶解有1mmol吡啶醛的無水乙醇溶液和一滴冰乙酸，回流1.5小時，濃縮，冷卻，得到紅棕色的粉末，即得吡啶醛腙二硫代甲酸鉀。產率：70％，熔點：mp:140.5℃.NMR(D₆-DMSO):8.64(d,H,J＝4Hz),8.29(s,H),7.94(m,2H,J＝8Hz),7.48(m,H,J＝8Hz)。ESI-MS(m/z):350.9540(M-H+2K,calcd:350.9525).

實施例3、抗腫瘤活性實驗

采用MTT法評估目標化合物的抗腫瘤活性。以HepG2(肝癌)、Bel-7402(肝癌)細胞為測試細胞株，選用對數生長期的貼壁腫瘤細胞，經胰酶消化后，用10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成5×10³個/ml的細胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板，每孔接種100微升，37℃，5％CO₂培養(yǎng)24小時。設立陰性對照組、陽性對照組及實驗組。細胞貼壁后實驗組更換新的含有不同濃度被測樣品的培養(yǎng)基。陽性組對照給予順鉑，陰性對照組則換為含有等體積溶劑的培養(yǎng)基。每組設三個復孔，37℃，5％CO₂培養(yǎng)48小時。棄去上清液，每孔加入10微升新鮮配制的10mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基。37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時。小心棄上清，并加入100微升DMSO，在平板震蕩器震蕩均勻后，在酶標儀上測定每孔在570納米的吸光度(OD)值。按下列公式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：抑制率(％)＝(對照組的OD值-實驗組的OD值)/對照組的OD值×100.并計算半數抑制濃度(IC50：50％細胞生長抑制時的濃度)。在形態(tài)上HepG2細胞及Bel-7402細胞經不同濃度的待測藥物處理48小時后，死細胞的數量隨著藥物濃度增加逐漸增加。細胞的增殖受到抑制。形態(tài)上隨著藥物濃度增加，貼壁性減弱，細胞逐漸變園，個數隨藥物濃度增加變化上升。

2-二吡啶酮腙硫代甲酸鉀對HepG2細胞的IC₅₀為：0.42μM；Bel-7402細胞為：IC₅₀為：3.54μM。順鉑對HepG2細胞的IC₅₀為：0.42μM；Bel-7402細胞為：IC₅₀為：11.2μM。吡啶醛腙硫代甲酸鉀對HepG2細胞的IC₅₀為：4.10μM。吡啶腙二硫代甲酸衍生物的細胞毒性如圖1所示：其中(a)2-二吡啶酮腙硫代甲酸對HepG2及Bel-7401肝癌細胞的抑制作用；(b)2-吡啶醛腙硫代甲酸對HepG2肝癌細胞的抑制作用。

實施例4、2-二吡啶酮腙硫代甲酸鉀從鐵蛋白中調動鐵活性

1、二吡啶酮腙二硫代甲酸鹽與不同鐵離子結合比例

試劑：1mM二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀(水溶液)；1mM硫酸亞鐵銨；1mM氯化鐵。

儀器：島津UV-2450分光光度計(光度測定或動力學模式)

操作步驟：

取11支容量瓶分別編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。分別加入50μl的1mM二吡啶酮腙二硫代甲酸鹽,然后加入分別加入1mM硫酸亞鐵銨10,20，30，40，50,60,70,80,90，100,110μl，然后加入Tris-HCl緩沖液(20mM，pH7.2)至5ml，混勻。30分鐘后進行掃描，掃描范圍：200nm-500nm。對于與三價鐵的結合的測定與上述步驟相同。所得結果證明：如圖2所示，1)2-二吡啶酮腙二硫代甲酸與鐵結合是1:1；2)2-二吡啶酮腙二硫代甲酸與鐵配合物的吸收峰在402納米。

2、藥物(二吡啶酮腙二硫代甲酸鹽)與鐵蛋白作用(釋放鐵)。

首先配制藥物(二吡啶酮腙二硫代甲酸鹽)用水溶解至1mM,鐵蛋白(Sigma)1mg/ml緩沖體系：Tris-HCl，pH＝7.2

操作步驟：

取50μl二吡啶酮腙二硫代甲酸鹽(或其他所示藥物),1μl鐵蛋白(Sigma，)置于Ependorff管，補加緩沖液至1ml,混合均勻后轉移至比色杯進行動力學掃描(室溫)，跟蹤波長為402納米，每隔5min掃描一次，直至90分鐘。從圖3a可以看出：類似結構，只有二吡啶酮腙二硫代甲酸可以有效從鐵蛋白中將鐵釋放出來。圖3是二吡啶酮腙二硫代甲酸對鐵蛋白中鐵的調動能力。

實施例5，抑制血管形成實驗

試劑：

ECM Matrix膠(Millipore)；MTT(Sigma)，胰酶(北京拜爾迪生物技術有限公司)，培養(yǎng)基(北京索萊寶生物技術有限公司)，血清(浙江天杭生物科技有限公司)，DMSO(天津市德恩化學試劑有限公司)，

1、對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞生長抑制。

細胞培養(yǎng)方法如對腫瘤細胞生長抑制實驗與實施例二，抗腫瘤活性實驗相同，但所使用的細胞為臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。根據MTT法，所得半數抑制濃度(IC₅₀)為3.4±0.3μM。結果如圖4，2-二吡啶腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞抑制作用。

2、對血管形成(圓環(huán))抑制作用

實驗步驟：1)將100μl冷的10X稀釋液加到900μl ECM Matrix,混合均勻。將50μl ECM膠加到96孔板，37℃固化1小時；2)選用對數生長期的貼壁HUVEC細胞，經胰酶消化后，用10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成5×10³個/ml的細胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板，每孔接種100微升。然后分別加入不同濃度2-二吡啶腙二硫代甲酸鉀。未加藥物為對照。37℃，5％CO₂培養(yǎng)10小時。倒置顯微鏡觀察，圓環(huán)的多少。結果顯示：0.5μM 2-二吡啶腙二硫代甲酸鉀即可抑制血管形成(吡咯二硫代甲酸鹽為50μM完全抑制)。圖5二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞形成圓環(huán)的抑制作用。

實施例6，抑制血管形成實驗

細胞劃痕實驗(Wound Healing)是一種操作簡單的研究細胞遷移/腫瘤侵襲的體外試驗方法。其原理是，當細胞長到融合成單層狀態(tài)時，在融合的單層細胞上人為制造一個空白區(qū)域，稱為“劃痕”。劃痕邊緣的細胞會逐漸進入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。若藥物具有抑制細胞遷移能力，則使“劃痕”難以愈合。

實驗步驟：1)培養(yǎng)板先用記號筆在12孔板背面畫橫線標記(方便拍照時定位同一個視野)；2)將HUVEC細胞消化后接入12孔板，數量以貼壁后鋪滿板底為宜；3)細胞鋪滿板底后，用250μl槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致；4)吸去細胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板三次，洗去劃痕產生的細胞碎片；5)加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄；6)將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔4-6小時取出拍照；7)根據收集圖片數據分析實驗結果。

結果：與對照相比，二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞遷移有明顯抑制作用(見圖6)。

圖6二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀對HUVEC細胞轉移的抑制作用。0和24小時見“痕”大小的比較：對照組；0.25μM二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀組；0.5μM二吡啶酮腙二硫代甲酸鉀組。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。