一種提高多粘芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法
【專利說明】一種提高多粘芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法
[0001 ]本發(fā)明得到天津市自然科學(xué)基金13JCYBJC25500資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用維生素C提高多粘類芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]在真菌引起的植物病害現(xiàn)已成為經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物和藥用植物穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的主要障礙，這些會導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)上的損失，還會產(chǎn)生對人類身體有害的霉菌毒素，使得真菌病害的防治顯得更為重要。目前使用的殺真菌劑大部分會造成環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，所以可以取代這些化學(xué)物質(zhì)環(huán)境友好型的生物防治物質(zhì)成為研究熱點(diǎn)。
真菌病害是植物病害中最重要的一類，可占到植物病害的80%以上，約3萬種，導(dǎo)致發(fā)展中國家的農(nóng)作物損失超過了 12%。真菌既危害生長期的作物，又危害采摘后的作物產(chǎn)品，如鐮刀菌屬能感染植物的根和其它部位，灰葡萄孢菌能引起200多種植物的綠色組織病變并且可以使儲存中的水果變質(zhì)。真菌引起的植物病害現(xiàn)已成為經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物和藥用植物穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的主要障礙，使得真菌病害的防治顯得更為重要。我們采取了使用殺真菌劑來對抗這些病原體，但這些殺菌劑大部分會造成環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，所以可以取代這些化學(xué)物質(zhì)環(huán)境友好型的生物防治物質(zhì)成為研究熱點(diǎn)。芽孢桿菌類的菌株可以產(chǎn)生多種抗菌藥物，包括羊毛硫抗生素、脂肽和大環(huán)內(nèi)酯物等。目前促進(jìn)多粘芽孢桿菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)的手段大多采用基因分子手段，但是，由于基因操作本身過程相對繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期相對較長的限制，加之構(gòu)建載體再生過程中外源基因的導(dǎo)入或內(nèi)源基因的修飾均可能導(dǎo)致整個(gè)代謝途徑的擾動，從而影響目標(biāo)代謝途徑物質(zhì)流和能量流分配，最終影響抗真菌物質(zhì)的形成。因此，尋找一種更為簡單且有效的方法尤為重要。由于外源還原劑(如GSH和微生物C)的添加可以夠影響到細(xì)胞所處環(huán)境氧化還原態(tài)勢，目前，通過外源還原劑的添加來調(diào)節(jié)生物所處外部環(huán)境的氧化還原電勢，促進(jìn)I，3_丙二醇、(R，R)-2，3-丁二醇等目標(biāo)產(chǎn)物的積累已有報(bào)告。但利用外源還原劑VC來提高產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的報(bào)道尚未見到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用維生素C促進(jìn)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法，包括如下步驟:
(1)種子培養(yǎng):將多粘類芽孢桿菌(P.polymyxa)CJX-518保藏編號為CGMCC N0.7096在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到一級種子;將一級種子在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到二級種子;上述的種子培養(yǎng)基成分以g/L計(jì):淀粉30，葡萄糖5，酵母浸粉2，蛋白胨4，MgS(V7H20 0.5，NaCl 0.5,K2HPO4 1.5，121°C蒸汽滅菌20 min；
(2)發(fā)酵培養(yǎng):按體積百分比為1%的接種密度將一級種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37 °C條件下發(fā)酵72h，當(dāng)發(fā)酵4h時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)組分別添加10、30和200 mg/L的維生素C水溶液
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由下述成分以g/l計(jì)組成:葡萄糖20，酵母浸膏粉3，NaCl 1，KH2PO42，(NH4)2S04 I,MgSO4.7H20 0.3,KCl 0.2,CaCl2 0.02, FeSO4.7H20 0.002,MnSO4.H2O
0.002,pH 為7.0。
本發(fā)明涉及的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，命名為Paenibacilluspolymyxa CJX-518。并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(ChinaGeneral Microb1logical Cultuer Collect1n Centre)，保藏號:CGMCC 7096。保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101，多粘類芽孢桿菌保藏的時(shí)間2013-01 -08。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了利用維生素C促進(jìn)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法在制備產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在發(fā)酵過程中，選擇在菌體有一定積累的時(shí)期添加1、30、200 mg/L的維生素C水溶液降低了因還原劑對微生物的毒害作用而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物積累受阻的影響;最終促進(jìn)發(fā)酵液中抗真菌活性物質(zhì)的積累。
本發(fā)明公開的提高多粘芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于:
本發(fā)明特征在于在P.polymyxa CJX-518發(fā)酵過程中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加還原劑維生素C，濃度為10、30和200mg/L;添加時(shí)間選擇在菌體有一定積累的時(shí)期(4h)，相對以往報(bào)道的在發(fā)酵起始階段添加還原劑的方式，如添加維生素C對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌合成丁二酸的影響中，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵起始階段添加維生素C，對菌體生長的作用并不明顯，40mg/L的維生素C雖然能促進(jìn)單位質(zhì)量菌體合成琥珀酸，但是與對照相比效果并不顯著，增加20%;這是因?yàn)樵诎l(fā)酵起始階段添加外源還原劑可破壞膜和重要生物大分子，對微生物造成毒害或致死，所以本發(fā)明選擇在菌體有一定積累時(shí)添加，可以降低因還原劑對微生物的毒害作用而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物積累受阻的影響;最終促進(jìn)發(fā)酵液中抗真菌物質(zhì)的積累。
【附圖說明】
[0005]
圖1為添加10 mg/L的維生素C對P.polymyxa CJX-518發(fā)酵過程中生物量積累的影響； 圖2為添加30 mg/L維生素C對P.polymyxa CJX-518發(fā)酵過程中生物量積累的影響；
圖3為添加200 mg/L維生素C對P.polymyxa CJX-518發(fā)酵過程中生物量積累的影響； 圖4為添加10 mg/L維生素C對P.polymyxa CJX-518產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的影響；
圖5為添加30 mg/L維生素C對P.polymyxa CJX-518發(fā)酵過程中產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的影響； 圖6為添加200 mg/L維生素C對P.polymyxa CJX-518發(fā)酵過程中產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的影響；
圖7為P.polymyxa CJX-518發(fā)酵上清液抑制立枯絲核菌(A)和灰葡萄孢子(B)生長示意圖。
[0006]【具體實(shí)施方式】:
下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下將一種產(chǎn)2，3-丁二醇的多粘類芽孢桿菌(Paenibaci Iluspolymyxa) CJX-518保藏編號為CGMCC 7096簡稱CJX-518。
實(shí)施例1:添加維生素C的發(fā)酵
一種利用維生素C提高多粘類芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法，包括如下步驟:
(1)培養(yǎng)基的配制
土豆培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):取去皮的土豆200g，切成小塊，加100ml水煮沸至一觸及破，用6層紗布收集濾液，加20g葡萄糖，20g瓊脂，定容至100ml，分裝后121°C蒸汽滅菌20min;
種子培養(yǎng)基成分以g/L計(jì):淀粉30，葡萄糖5，酵母浸粉2，蛋白胨4，MgS(V7H20 0.5，NaCl 0.5,K2HPO4 1.5，121°C蒸汽滅菌20 min；
發(fā)酵培養(yǎng)基成分以g/L計(jì):葡萄糖20，酵母浸膏粉3，NaCl 1，KH2PO4 2, (MM)2SO4 1，MgSO4.7H20 0.3,KCl 0.2,CaCl2 0.02, FeSO4.7H20 0.002,MnSO4.H2O 0.002,pH 為7.0，121°C蒸汽滅菌20 min；
(2)搖瓶培養(yǎng)
一級種子的培養(yǎng)
將CJX-518甘油菌接入50mL的種子培養(yǎng)基中，在溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm條件下，培養(yǎng)24h，制得一級種子培養(yǎng)液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
按體積百分比為1%的接種密度將一級種子接入250ml裝有10mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，攪拌轉(zhuǎn)速為200印111，溫度為37°(:，發(fā)酵7211。
在發(fā)酵4h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為10、30、200 mg/L的維生素C水溶液，各時(shí)間段檢測到的生物量積累如圖1所示，生成的抗真菌物質(zhì)如圖2所示。添加30mg/L的維生素C促進(jìn)效果最好，在36h、48h和60h時(shí)與對照相比，生物量積累分別提高了 17.9%、10.6%和9.97%;抗真菌活性分別提高了 72%、61.4%和61%。
(4 )抗真菌活性的測定
多粘芽孢桿菌抗真菌活性的測定采用牛津杯法，指示菌為立枯絲核菌和灰葡萄孢子，分別在經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的立枯絲核菌和含有灰葡萄孢子的PDA平板上放4個(gè)滅菌的牛津杯，取滅過菌的發(fā)酵上清液液SOyL點(diǎn)樣于牛津杯內(nèi)，待菌液干后，28°C倒置培養(yǎng)培養(yǎng)48h。
實(shí)施例2
對照組:不添加維生素C的發(fā)酵
(I)、(2)和(4)同實(shí)施例1步驟(1)、(2)和(4);
(3)按體積百分比為1%的接種密度將一級種子接入250ml裝有10mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，溫度為37 V，發(fā)酵72h。36h、48h、60h時(shí)間段檢測到的生物量積累如圖1所示，生成的抗真菌物質(zhì)如圖2所示。
結(jié)論:
(1)發(fā)酵過程中添加10mg/L、30mg/L、200mg/L的維生素C促進(jìn)P.polymyxa CJX-518的生物量積累；
(2)發(fā)酵過程中添加10mg/L、30mg/L、200mg/L的維生素C促進(jìn)P.polymyxa CJX-518的產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)； (3)添加30mg/L的維生素C促進(jìn)效果最好，在36h、48h和60h時(shí)與對照相比，生物量積累分別提高了 17.9%、10.6%和9.97%;抗真菌活性分別提高了 72%、61.4%和61%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用維生素C提高多粘類芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法，其特征是包括如下步驟: (1)種子培養(yǎng):將多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) CJX-518保藏編號為CGMCC N0.7096在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到一級種子;所述的種子培養(yǎng)基成分以g/L計(jì):淀粉30，葡萄糖 5，酵母浸粉 2，蛋白胨 4,MgSO4-7H20 0.5,NaCl 0.5,K2HPO4 1.5，121°C蒸汽滅菌20min; (2)發(fā)酵培養(yǎng):按體積百分比為1%的接種密度將一級種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37°C條件下發(fā)酵72h;當(dāng)發(fā)酵4h時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)組分別添加10、30和200 mg/L的維生素C水溶液。2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)基由下述成分以g/L計(jì)組成:葡萄糖20，酵母浸膏粉3，NaCl 1，KH2PO4 2, (NM)2SO4 I ,MgSO4.7H20 0.3,KCl 0.2,CaCl20.02, FeSO4.7H20 0.002,MnSO4.H2O 0.002,pH 為7.0。3.權(quán)利要求1述利用維生素C促進(jìn)多粘類芽孢桿菌產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的方法在促進(jìn)發(fā)酵液中抗真菌活性物質(zhì)的積累方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用外源添加還原劑維生素C提高多粘類芽孢桿菌(<i>Paenibacillus？polymyxa</i>)？CJX-518產(chǎn)真菌物質(zhì)的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過在發(fā)酵過程中，將多粘類芽孢桿菌(<i>Paenibacillus？？polymyxa</i>)？CJX-518保藏編號為CGMCC？NO.7096在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到一級種子。按體積百分比為1%的接種密度將一級種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為37℃條件下發(fā)酵72h;當(dāng)發(fā)酵4h時(shí)，不同實(shí)驗(yàn)組分別添加10、30和200？mg/L的維生素C水溶液。該方法促進(jìn)P.？polymyxa？CJX-518抗真菌物質(zhì)的積累。分批發(fā)酵方式下利用本方法可促使<i>P.？polymyxa</i>？CJX-518產(chǎn)抗真菌物質(zhì)顯著提高。CGMCC No.709620130108
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01, C12P1/04
【公開號】CN105602996
【申請?zhí)枴緾N201610088613
【發(fā)明人】徐秋曼, 趙倩倩, 程景勝
【申請人】天津師范大學(xué)
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年2月17日