通過尖孢鐮刀菌發(fā)酵改性小百部富集紅莧甾酮的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物改性植物化學(xué)成分領(lǐng)域，具體來說是建立了一種通過植物病原 真菌尖孢鐮刀菌改性小百部來大量富集紅莧留酮的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小百部又名滇百部，為百合科（ZiJiaceae)天門冬屬植物羊齒天門 冬乂/YJici/ws Buch. - Ham. ex D. Don的塊根，主產(chǎn)于云南和四川，為云南彝 族和傣族的習(xí)用藥物。其味甘苦，性平，民間多用于治療氣管炎，肺炎和咳嗽，在云南省的一 些地區(qū)，也作為中藥百部的代用品?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明小百部具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，超 過了同屬植物抗癌保健藥蘆筍，同時(shí)還具有顯著的抗二氧化硫毒氣、抑菌以及鎮(zhèn)咳等藥理 活性，是一種具有良好開發(fā)前景的天然藥物。有關(guān)該屬植物化學(xué)成分研究表明，留體皂苷為 該屬植物主要成分。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 12個(gè)留體皂苷、5個(gè)蛻皮留酮類化合物、2個(gè)木 脂素類化合物和1個(gè)苯丙素類化合物。其中蛻皮留酮、20-羥基蛻皮留酮、stachysterone C、20, 22-異丙亞二氧基蛻皮留酮這四種化合物含有相同的母核結(jié)構(gòu)。
[0003] 紅莧甾酮（沿/Arasterete)是一種含有19個(gè)碳的植物甾酮類化合物，它于1963年 首次從牛膝中分離得到。前期研究表明紅莧留酮具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性，在離體條件下 誘導(dǎo)果蠅器官芽外翻，并且高效的刺激小鼠肝臟蛋白質(zhì)的合成。毫無疑問，紅莧留酮還可能 具有更多的其它生物活性以及應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。但是，到目前為止，能夠分離得到紅莧留酮的 生物種類有限，分離過程也比較繁雜。而紅莧留酮的合成過程也相當(dāng)復(fù)雜，根據(jù)目前的報(bào) 道，可以以 dehydroepiandrosterone 或 3 〇，5 a -cycloandrostane-6, 17-dione 為底物分 別通過20步或7步合成得到。
[0004] 然而，合成過程也需要用到復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備，對(duì)生產(chǎn)環(huán)境也有相當(dāng)高的要求，并且 轉(zhuǎn)化率較低。因此，我們更需要一種簡便易行的，綠色無污染的，高效的產(chǎn)生紅莧留酮的方 法。
[0005] 近年來，因?yàn)槲⑸锷L周期短、避免了因條件劇烈而產(chǎn)生不必要的副反應(yīng)的特 點(diǎn)以及微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、立體選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，利用微生物(真菌、細(xì)菌 以及藻類)發(fā)酵改性的方法越來越受到人們的重視。在實(shí)際生產(chǎn)中，已經(jīng)有大量的應(yīng)用實(shí)例 通過微生物的發(fā)酵來生產(chǎn)一些新穎的、活性較高的以及對(duì)人體健康有益的食品或藥物等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在通過植物病原真菌尖孢鐮刀菌發(fā)酵改性傳統(tǒng)中藥材小百部，從而達(dá)到 高效富集紅莧留酮的目的，本發(fā)明克服了紅莧留酮在常規(guī)中藥材中含量少，合成成本高，合 成過程復(fù)雜，轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)，提供了一種轉(zhuǎn)化率高，設(shè)備要求低，簡便易操作，綠色無污 染，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的富集紅莧留酮的方法。
[0007] 本發(fā)明另一個(gè)目的在于利用植物病原真菌尖孢鐮刀菌來發(fā)酵改性小百部，從而達(dá) 到了高效富集紅莧留酮的效果。此種方法簡便易行，對(duì)設(shè)備要求低，綠色無污染，是一種非 常適用于工業(yè)化生產(chǎn)的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下具體技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 尖孢鐮刀菌的活化： 本發(fā)明所用的尖孢鐮刀菌首先進(jìn)行活化，即將尖孢鐮刀菌接種到經(jīng)過121 ° C高溫滅 菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-7 d后置于4 ° C冰箱中。
[0009] 藥材前處理： 取干燥的小百部藥材粉碎后，取適量的藥材粉末置于錐形瓶中，加入自來水浸潤后， 觀察藥材的濕潤度。將裝有藥材的錐形瓶加塞包裝后置于121 ° C高溫滅菌箱中滅菌30 min，取出后將藥材冷卻。
[0010] 藥材接菌： 將活化好的尖孢鐮刀菌菌絲在無菌環(huán)境下接種到經(jīng)過前處理的小百部上，加塞包裝后 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-20 d后取出。
[0011] 提取、分離、純化： 微生物發(fā)酵后的小百部經(jīng)過甲醇溶液超聲提取，過濾，濃縮得到粗提物。經(jīng)TLC (薄層 層析法）薄層層析法檢測，分別與原藥材和空白發(fā)酵組進(jìn)行對(duì)照。然后經(jīng)過硅膠柱進(jìn)行分 離，分離過程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿：甲醇(此二元溶劑的體積比由90:1逐漸變動(dòng)為 3:1)，再將這部分用石油醚：丙酮(此二元溶劑的體積比由6:1逐漸變動(dòng)為2:1)洗脫，然后 經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱純化，通過iH-NMR (核磁共振氫譜)，13C-NMR (核磁共振碳譜） 以及HR-ESI-MS (電噴霧高分辨率質(zhì)譜）鑒定得到化合物結(jié)構(gòu)。
[0012] 分離得到的紅莧甾酮（沿/Arosterete)和前體化合物20-羥基銳皮甾酮 (2〇-hydroxyecdysone)的結(jié)構(gòu)式如下：
其中所述浸潤小百部的自來水量要?jiǎng)偤檬顾幉谋３譂駶櫊顟B(tài)。
[0013] 用于提取的甲醇溶液為體積比為40%_90%的水溶液。
[0014] 采用本發(fā)明微生物發(fā)酵小百部富集紅莧留酮的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的 制備方法優(yōu)點(diǎn)在于： (1) 選用小百部為原料，一步催化反應(yīng)即可轉(zhuǎn)化生成紅莧甾酮； (2) 選用微生物酶為催化劑，其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，具有強(qiáng)的區(qū)域選擇性，立體選擇性和高 度的專一性，而且催化反應(yīng)條件溫和，不需要化學(xué)試劑的參與以及化學(xué)反應(yīng)的高溫高壓等 條件。
[0015] 綜上所述，該發(fā)明方法采用的原料便宜易得，反應(yīng)條件溫和、容易控制，環(huán)境無污 染，設(shè)備要求簡單，適宜擴(kuò)大化生產(chǎn)的富集紅莧留酮的工藝方法。
[0016]
【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的1H-NMR ; 圖2為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的13C-NMR ; 圖3為本發(fā)明中目標(biāo)化合物的HR-ESI-MS ; 圖4為本發(fā)明中原藥材粗提物、空白發(fā)酵粗提物、尖孢鐮刀菌發(fā)酵粗提物、20-羥基蛻 皮甾酮以及紅莧留酮的分析色譜圖；其中（a)是20-羥基蛻皮留酮的分析色譜圖、（b)是原 藥材粗提物的分析色譜圖、（c)是空白發(fā)酵粗提物的分析色譜圖、（d)是紅莧留酮的分析色 譜圖、（e)是尖孢鐮刀菌發(fā)酵粗提物的分析色譜圖。
[0017]
【具體實(shí)施方式】： 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于該具體實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明涵蓋了權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有可能的備選方案、改進(jìn)方案和等效方 案。
[0018] 實(shí)施例1 1.菌種和藥材： 植物病原真菌尖孢鐮刀菌是由云南省微生物研究所提供，小百 部于2013年11月購自于昆明藥材市場。
[0019] 2?菌種活化： 植物病原真菌尖孢鐮刀菌首先必須在培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，即將尖孢鐮刀菌接種到121 ° (：高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-7 d后取出放在4 ° C冰箱中， 備用。
[0020] 3?藥材前處理： 稱取藥材粉末于錐形瓶中，用適量自來水潤濕，加塞包裝后置于121 ° C高溫滅菌箱 中滅菌30 min。
[0021] 4?藥材接菌： 尖孢鐮刀菌菌絲在無菌環(huán)境下接種到經(jīng)過前處理的小百部上，加塞包裝后置于25-37 ° C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-20 d后取出。
[0022] 5?提取： 微生物發(fā)酵后的小百部經(jīng)過甲醇溶液超聲提取，過濾，濃縮得到粗提物。