一種基于稻殼固定化玉米赤霉烯酮降解酶的霉菌毒素脫毒劑的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于稻殼固定化玉米赤霉烯酮降解酶的霉菌毒素脫毒劑的制備方法及其應(yīng)用，屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米赤霉烯酮(ZEN)是一類污染范圍廣，具有類雌激素活性的鐮刀菌屬真菌毒素。ZEN在世界范圍內(nèi)能廣泛污染玉米、谷物等糧食作，世界范圍內(nèi)能廣泛污染玉米、谷物等糧食作，不僅給食品和飼料行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，還可以通過食物鏈在動體或人中積累，進而引起動物或人體發(fā)生急性中毒和慢。因此，找到一種安全高效ZEN脫毒技術(shù)是盡快解決我國ZEN污染糧食安全的污染糧食安全的重要任務(wù)。
[0003]人們對稻殼的利用歷史可以追溯到1000多年前，主要適用于燃燒，但是此過程給環(huán)境帶來了很大的污染，所以急需找到更加環(huán)保的方法來利用稻殼，而將稻殼作為固定化載體就是很好解決這個問題的方法。因此本發(fā)明是非常有意義的。
[0004]酶的固定化可以增加酶在各種環(huán)境中的穩(wěn)定性，還可以提高酶的重復利用率，是一種提高酶的使用價值的常見技術(shù)。然而，根據(jù)酶與固定化方法本身的特點及已有的酶固定化報道可知，酶的固定化可以分為吸附固定和化學鍵共價鏈接，吸附固定的酶不是很穩(wěn)定，很容易掉落。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的固定化酶方法，是利用稻殼固定化玉米赤霉烯酮降解酶，采用高碘酸鈉稻殼上的羥基，使其變成醛基，更容易與酶發(fā)生共價反應(yīng)，使酶固定。本發(fā)明以稻殼作為固定化載體，稻殼的具有大量的孔洞結(jié)構(gòu)，且稻殼中的二氧化硅與木質(zhì)素、纖維素間存在著較強的共價鍵作用，表面羥基多，具有較強的過濾和凈化能力，通過對稻殼進行表面改性可以增強稻殼對離子的吸收性能，而且還具有性質(zhì)穩(wěn)定，耐降解、傳質(zhì)好、比表面積大等優(yōu)勢。而且稻殼表面以及內(nèi)部都存在大量的羥基，很容易被高碘酸鈉氧化成醛基，與氨基發(fā)生酰胺反應(yīng)，最終固定酶或者蛋白質(zhì)。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種固定化酶的方法，將稻殼用NaOH溶液和HC1溶液進行前處理，之后用他104溶液將稻殼表面的羥基氧化為醛基，由于直接固定酶會限制酶的活性，所以再用尿素和戊二醛與氧化稻殼反應(yīng)，得到帶支臂的活化稻殼，清洗完畢將活化稻殼于游離酶液混合，冰浴中反應(yīng)，離心收集沉淀、洗滌，風干之后就得到固定化的酶。
[0007]所述方法包括如下步驟:
[0008](1)先將稻殼依次加入到堿溶液、酸溶液中進行前處理；
[0009](2)將前處理后的稻殼加入到Na104溶液中，避光攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢之后除去未反應(yīng)的Na104、清洗、風干，得到氧化型稻殼，然后將氧化型稻殼加入尿素溶液中攪拌反應(yīng)，再加入一定濃度的戊二醛攪拌反應(yīng)，完畢之后用去離子水清洗，得到活化稻殼；
[0010](3)將活化稻殼與游離酶液混合，冰浴攪拌，離心收集沉淀，并用緩沖液洗滌，冷凍干燥后，即可得固定化酶。
[0011]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(1)中堿溶液為0.5mol/L的NaOH，室溫攪拌反應(yīng)24h ;所述酸溶液為0.lmol/L的HC1溶液，室溫攪拌反應(yīng)12h。
[0012]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)是在2g/L的他104溶液中室溫反應(yīng)3h，然后用0.5mol/L丙酮攪拌反應(yīng)0.5h以去除未反應(yīng)的Na104。
[0013]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)的尿素溶液濃度為4mol/L，室溫反應(yīng)18h ;所述戊二醛濃度為0.5mol/L,室溫反應(yīng)2h。
[0014]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(3)中活化稻殼與游離酶液的配比為lOOOmg:100ml ;所述冰浴下攪拌的時間為18h ;所述緩沖液為20mmol/L、pH4.0的磷酸鈉-檸檬酸緩沖液。
[0015]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酶為玉米赤霉烯酮降解酶。
[0016]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述游離酶液的制備方法是:將產(chǎn)玉米赤霉烯酮降解酶的黑曲霉菌株活化培養(yǎng)后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)束后離心得發(fā)酵上清液，即為游離酶液。
[0017]所述游離酶液是黑曲霉(Aspergillus niger)FS10所產(chǎn)的，該菌株保藏于江南大學食品與科學學院。
[0018]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述游離酶液的制備方法是:黑曲霉孢子接種PDA培養(yǎng)基活化，然后刮取孢子于無菌生理鹽水中，調(diào)整孢子濃度為106CFU/mL，將孢子懸浮液以6%的接種量接種到PDB培養(yǎng)基，30°C、150rpm回轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24?48h得種子液，將將種子液按20%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0019]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述PDA培養(yǎng)基的組成為:10g/L馬鈴薯浸出液，20g/L葡萄糖，2g/L瓊脂。
[0020]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述PDB培養(yǎng)基的組成為:8g/L馬鈴薯浸出液，20g/L葡萄糖。
[0021]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:8g/L馬鈴薯浸出液，20g/L葡萄糖，2g/L磷酸氫二鉀，2g/L尿素，0.3g/L硫酸鎂，0.4g/L碳酸鈣。
[0022]本發(fā)明還要求保護根據(jù)所述方法得到的固定化酶及其應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的有益效果:
[0024](1)本發(fā)明中，先發(fā)酵黑曲霉菌獲得含有ZEN降解酶的發(fā)酵上清液，再通過高碘酸鹽氧化纖維法制備活化的稻殼載體，并用尿素和戊二醛去延伸醛基，使稻殼更容易與酶結(jié)，最后利用活化的稻殼和ZEN降解酶非活性中心的氨基發(fā)生酰胺縮合反應(yīng)而使ZEN得到固定化，且通過單因素變量法研宄固定化酶的熱、酸堿的穩(wěn)定性。本發(fā)明中活化稻殼表面粗糙且有部分孔狀結(jié)構(gòu)，與普通的稻殼相比，對酶的固定效果上更加有優(yōu)勢。
[0025](2)本發(fā)明采用了一種改性稻殼固定ZEN降解酶的方法，采用該方法固定的ZEN降解酶在熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性上與游離酶相比都有很大的優(yōu)越性，與其他固定化酶相比，該固定化酶蛋白負載量和酶活力有很大的提高并且生產(chǎn)成本大大降低。
【附圖說明】
[0026]圖1為未處理、堿化、帶支臂的稻殼的SEM表征圖；
[0027]圖2為未處理、堿化、帶支臂的稻殼、固定化ZEN紅外檢測；
[0028]圖3為游離酶和固定化酶的催化最適溫度的測定；
[0029]圖4為游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性的比較；
[0030]圖5為游離酶和固定化酶的催化最適pH的測定；
[0031 ]圖6為游離酶和固定化酶的pH穩(wěn)定性的比較；
[0032]圖7為直接固定酶和間接固定酶的相對活性的比較。
【具體實施方式】
[0033]所制備的同定化ZEN降解酶的性質(zhì)表征可采用以下方法:
[0034]酶活力的定量檢測:將含有l(wèi)Oppm ZEN溶液，用堿調(diào)節(jié)pH為4.0。取lmL底物溶液與9mL發(fā)酵上清液或者10mg固定化酶混合，使溶液中ZEN最終濃度為lppm，40°C反應(yīng)12h，立即用0.5mol/L乙腈終止反應(yīng)。酶活力單位⑶定義為在定溫度、pH條件下，每分鐘催化降解IppbZEN所需的酶量。
[0035]最適反應(yīng)溫度的測定:將游離酶和固定化酶的反應(yīng)體系分別在10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 °C下反應(yīng)12h，定量測定溶液中殘余ZEN，比較在不同反應(yīng)溫度下的
ZEN脫除率，分別得到游離酶和固定化酶的最佳催化溫度。
[0036]穩(wěn)定性的測定:將發(fā)酵上清液和固定化酶分別在10、20、30、40、50、60、70、80、90°C保溫lh，然后再在40°C、pH4.0條件下檢測溶液中殘余ZEN脫除率，測定不同溫度處理后游離酶和固定化酶的殘留活力，比較熱穩(wěn)定性。
[0037]最適反應(yīng)pH:配制 pH 為 2.5、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、
9.0,9.5,10.0的底物溶液，測定在不同pH條件下游離酶和固定化酶的酶活力，分別得出游離酶和固定化酶催化最適催化pH。
[0038]pH穩(wěn)定性測定:將發(fā)酵上清液和固定化酶分別放置在不同pH(2.5,3.5,4.0,4.5、
5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5,10.0)的磷酸鈉-檸檬酸鈉緩沖液中，冰浴下放置lh，然后將pH調(diào)到4.5，再在40°C下反應(yīng)12h，定量測定殘留酶活力，比較pH穩(wěn)定性。
[0039]實施例1:
[0040]黑曲霉菌的活化:將FS10原始菌種的孢子用接種環(huán)接種到PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，用滅菌接種環(huán)刮取平板邊緣新生、活力高的孢子于無菌生理鹽水中，調(diào)整孢子濃度為106CFU/mL ;所述PDA培養(yǎng)基的組成為:10g/L馬鈴薯浸出液，20g/L葡萄糖，2g/L瓊脂。
[0041]黑曲霉菌的培養(yǎng):將孢子懸浮液以6%的接種量接種到裝有500mLPDB培養(yǎng)基的1L錐形瓶中，30°C、150rpm回轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24?48h ;所述PDB培養(yǎng)基的組成為:8g/L馬鈴薯浸出液，20g/L葡萄糖。
[0042]上罐獲得酶液