本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，涉及一種煙酸或異煙酸類化合物及其用途。
背景技術(shù)：
梭菌屬細(xì)菌毒素包括肉毒神經(jīng)毒素和破傷風(fēng)毒素。破傷風(fēng)毒素由梭狀芽孢桿菌屬破傷風(fēng)梭狀桿菌在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生，在臨床上可引起破傷風(fēng)。肉毒神經(jīng)毒素(Clostridium Botulinum Neurotoxins，簡(jiǎn)稱肉毒毒素)是一組已知毒力最強(qiáng)的蛋白質(zhì)(包括A-G型)，主要是由梭狀芽孢桿菌屬肉毒桿菌在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生，其靜脈注射半數(shù)致死量約為1ng/kg，吸入半數(shù)致死劑量約為3ng/kg。常見(jiàn)肉毒毒素中毒主要是由于食用污染的食物、傷口感染產(chǎn)生毒素進(jìn)入體內(nèi)及嬰兒腸道中的毒素前體通過(guò)消化產(chǎn)生活性毒素而發(fā)生。此外，A型肉毒毒素已經(jīng)廣泛用于膽堿能神經(jīng)和肌肉功能障礙的臨床治療，以及應(yīng)用于美容去皺，治療使用中有可能因用藥過(guò)量、誤用濫用和(或)不良反應(yīng)而出現(xiàn)全身肉毒中毒癥狀。肉毒中毒潛伏期較短，病程發(fā)展快，病情較嚴(yán)重，病死率高。其中引起人類中毒的主要是A、B、E、F型，而A型對(duì)人的神經(jīng)毒性最強(qiáng)。目前用于肉毒中毒和破傷風(fēng)預(yù)防和治療的藥物是(型)特異性抗毒素馬血清，能對(duì)80％以上的中毒病人有效，但此類藥物存在明顯的副作用，臨床報(bào)道約9％病例出現(xiàn)血清病和過(guò)敏性反應(yīng)(Black RE,et al.Am J Med,1980,69:567-570)，嚴(yán)重限制了馬血清抗毒素的應(yīng)用，迫切需要尋找更加安全、有效的新型藥物。
破傷風(fēng)和肉毒中毒具有相似的致病過(guò)程，是由毒素的重鏈C端與神經(jīng)細(xì)胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，酸性環(huán)境使得其結(jié)構(gòu)重排，并促使重鏈N端進(jìn)入膜內(nèi)，同時(shí)輕鏈去折疊，二硫鍵被還原后作為鋅離子金屬酶轉(zhuǎn)入細(xì)胞，催化裂解一類胞內(nèi)底物蛋白(A、E型肉毒神經(jīng)毒素作用于突觸小體相關(guān)蛋白SNAP-25，B、D、F、G型肉毒神經(jīng)毒素及破傷風(fēng)毒素作用于突觸小泡相關(guān)膜蛋白VAMP)，從而影響乙酰膽堿的轉(zhuǎn)移，干預(yù)神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，而引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)麻痹或興奮。如果對(duì)結(jié)合、轉(zhuǎn)入和催化3個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)環(huán)節(jié)的抑制或阻遏，可有效抑制毒素的神經(jīng)毒性。而以具有酶活性的毒素輕鏈為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和發(fā)展催化類抑制劑成為近些年的研究熱點(diǎn)。Harry B等體外高通量篩選植物、海洋組織、真菌天然提取物對(duì)梭菌屬毒素產(chǎn)生抑制的物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了30種非亞型抑制劑，其中5種提取物可同時(shí)抑制B型、E型肉毒毒素。Smith LA等在2009年發(fā)現(xiàn)了喹啉醇衍生物CB7969312是一種潛在抑制劑，通過(guò)結(jié)合到A型肉毒毒素輕鏈活性位點(diǎn)的大疏水區(qū)口袋的Zn催化區(qū)域，有效地中和A型肉毒毒素對(duì)N2a細(xì)胞的毒性(Roxas-Duncan,V,et al.Agents Chemother.2009,53:3478-3486；Pang,Y.-P.et al.PLos One 2009,4,e7730.)。Janda KD等在2010年發(fā)現(xiàn)lomofungin能抑制A型肉毒毒素輕鏈(Ki值6.7±0.7uM)，顯示出典型的非競(jìng)爭(zhēng)性動(dòng)力學(xué)(Eubanks,L.M.,et al.ACS Med.Chem.Lett.2010,1:268-272.)。這些報(bào)道的天然產(chǎn)物或化合物對(duì)毒素輕鏈具有體外抑制作用，有些天然產(chǎn)物或化合物在整體毒素和動(dòng)物模型水平也具有抑毒效應(yīng)，但活性仍有提升空間。另外，目前報(bào)道的大多數(shù)化合物具有毒素型特異抑制活性，而交叉抑制作用還有待提高。因此有必要研究發(fā)展新的天然產(chǎn)物或活性化合物，可以對(duì)梭菌屬神經(jīng)毒素(多型肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素)具有更廣范圍的體外抑制和拮抗作用，而且可以在整體動(dòng)物水平體現(xiàn)出較高抗毒活性，從中研發(fā)新的治療藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種煙酸或異煙酸類化合物及其用途。
本發(fā)明提供的新煙酸或異煙酸類化合物，包括接受的鹽、酯、溶劑合物，該化合物的結(jié)構(gòu)通式如式I所示：
所述式I中，
R1、R2獨(dú)立地表示下述基團(tuán)中的任意一種：氫或-(CH2)mCOOH；
R3、R4、R5、R6、R7獨(dú)立地表示下述基團(tuán)中的任意一種：氫、羥基、氨基、鹵素、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基和低級(jí)環(huán)烷基；
所述低級(jí)烷基是指含1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和脂肪烴基；
所述低級(jí)烷氧基是指含1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷氧基；
所述低級(jí)環(huán)烷基是指含3至7個(gè)碳的環(huán)基；
X獨(dú)立地表示下述基團(tuán)中的任意一種：O、-S＝O和-SO2；
m是0或1或2或3。
本文中，所述低級(jí)烷基具體可為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或叔丁基；
所述低級(jí)烷氧基具體可為甲氧基或乙氧基；
所述低級(jí)環(huán)烷基具體可為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基或環(huán)庚基；
所述鹵素具體可為氯、溴、碘或氟；
上述式I所示化合物藥學(xué)上可接受的鹽為吡啶環(huán)上取代羧基與金屬離子，或吡啶環(huán)氮原子與有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸形成的各類鹽。
更優(yōu)的，式I所示化合物選自以下化合物：
2-(2-((5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；?磺?；?煙酸，其結(jié)構(gòu)式如2a所示；
2-(2-((5-氯-2–芐氧基苯胺基)乙?；?磺?；?異煙酸，其結(jié)構(gòu)式如2b所示；
2-(2-((5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；?亞磺?；?異煙酸，其結(jié)構(gòu)式如2c所示；
2-(2-(5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；醮?煙酸，其結(jié)構(gòu)式如6a所示；
2-(2-(5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；醮?異煙酸，其結(jié)構(gòu)式如6b所示。
本發(fā)明的第二方面，是提供了上述的煙酸類或異煙酸類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物的制備方法，為如下方法A或方法B：
所述方法A包括如下步驟：使式II所示化合物進(jìn)行氧化反應(yīng)，反應(yīng)完畢得到式I所示化合物；
式II中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7的定義同式I；
所述方法B包括如下步驟：
1)使式III所示化合物與氯乙酰氯或溴乙酰氯反應(yīng)，得到式IV所示化合物；
式III、式IV中R3、R4、R5、R6和R7的定義同式I；
2)使式IV所示化合物與式V所示化合物進(jìn)行醚化反應(yīng)，得到所述式I所示化合物；
式V中R1和R2的定義同式I。
另外，上述本發(fā)明提供的式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物以及它們的混合物在制備下述產(chǎn)品中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
1)預(yù)防和/或治療肉毒毒素暴露和/或中毒的藥物；
2)肉毒毒素內(nèi)肽酶抑制劑。
本發(fā)明還提供了一種肉毒毒素內(nèi)肽酶抑制劑，其活性成分為前述本發(fā)明提供的式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物以及它們的混合物。
本發(fā)明還提供了預(yù)防和/或治療肉毒毒素暴露和/或中毒的藥物，其活性成分為前述本發(fā)明提供的式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物以及它們的混合物。
本發(fā)明還提供了預(yù)防和/或治療肉毒毒素暴露和/或中毒的藥物制劑，其活性成分為前述本發(fā)明提供的式I所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯、溶劑合物以及它們的混合物。
上述應(yīng)用或肉毒毒素內(nèi)肽酶抑制劑或藥物或藥物制劑中，所述肉毒毒素具體可包括A型肉毒毒素和B型肉毒毒素。
上述藥物可通過(guò)注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等。
所述藥物可以制成注射液、懸浮劑、粉劑、片劑、顆粒劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
藥效試驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的巰基煙酸類化合物在體外能抑制肉毒毒素內(nèi)肽酶活性，同時(shí)對(duì)肉毒毒素中毒小鼠具有明顯的保護(hù)作用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。所述方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。所述原材料如無(wú)特別說(shuō)明均能從公開(kāi)商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例1、2-(2-((5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；?磺?；?煙酸的合成
稱取2-((2-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)硫醚)煙酸30mg溶于3mL無(wú)水乙酸中，緩慢加入雙氧水0.2mL，室溫反應(yīng)2h，柱純化得到白色固體，收率42％。
該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:9.86(s,1H),8.97(d,J＝4.9MHz,1H),8.29(s,1H),8.15(dd,J＝1.2,4.9MHz,1H),7.92(d,J＝2.4MHz,1H),7.04-7.16(m,2H),4.92(s,2H),3.84(s,3H)；ESI-MS(m/z):383.06(M-H+),766.87(2M-H+)。由上可知，該化合物結(jié)構(gòu)正確，目標(biāo)化合物編號(hào)2a。
實(shí)施例2、2-(2–((5-氯-2-芐氧基苯胺基)乙?；?磺酰基)異煙酸的合成
按照與上相同的步驟，僅將2-((2-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)硫醚)煙酸替換為2-((2-((5-氯-2-芐氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)硫醚)異煙酸，得到2-(2–((5-氯-2-芐氧基苯胺基)乙?；?磺?；?異煙酸。該產(chǎn)物為白色固體，收率53％。
該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:10.03(s,1H),8.42(d,J＝7.4MHz,1H),8.21(s,1H),7.99(s,1H),7.51(d,J＝7.5MHz,2H),7.32-7.44(m,3H),7.11(s,2H),6.75(t,1H),5.29(s,2H),5.13(s,2H)；ESI-MS(m/z):459.01(M-H+)。由上可知，該化合物結(jié)構(gòu)正確，目標(biāo)化合物編號(hào)2b。
實(shí)施例3、2-(2-((5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙酰基)亞磺?；?異煙酸的合成
按照與上相同的步驟，僅將2-((2-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)硫醚)煙酸替換為2-((2-((5-氯-2-甲氧基苯基)氨基)-2-氧代乙基)硫醚)異煙酸，得到2-(2-((5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙酰基)亞磺?；?異煙酸。該產(chǎn)物為白色固體，收率48％。
該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:7.97(s,1H),8.68(dd,J＝1.6,4.8MHz,1H),8.28(dd,J＝1.6,7.7MHz,1H),8.18(d,J＝2.2MHz,1H),7.35(q,1H),6.98-7.09(m,2H),4.00(s,2H),3.78(s,3H)；ESI-MS(m/z):383.17(M-H+),767.01(2M-H+)。由上可知，該化合物結(jié)構(gòu)正確，目標(biāo)化合物編號(hào)2c。
實(shí)施例4、2-(2-(5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；醮?煙酸的合成
稱取2-甲氧基-5-氯苯胺0.5g溶于10mL無(wú)水二氯甲烷中，加入三乙胺1mL，置于50mL茄形瓶中。精密量取氯乙酰氯0.25mL，稀釋于2mL無(wú)水二氯甲烷中，緩慢滴加至反應(yīng)瓶中，室溫反應(yīng)4h。用水淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取三次，合并濃縮有機(jī)相，柱層析得到2-氯-N-(5-氯-2-甲氧基苯基)乙酰胺，收率78％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:9.68(s,1H),8.12(d,J＝2.5MHz,1H),7.19(dd,J＝2.6,8.8MHz,1H),7.12(d,J＝8.8MHz,1H),4.43(s,2H),3.89(s,3H)；ESI-MS(m/z):272(M+K+).
稱取2-氯-N-(5-氯-2-甲氧基苯基)乙酰胺0.1g，2-羥基煙酸0.56g，碳酸鉀0.19g置于20mL茄形瓶中，加入5mL N,N-二甲基甲酰胺，室溫進(jìn)行醚化反應(yīng)過(guò)夜。用大量水與乙酸乙酯萃取，合并濃縮有機(jī)相，柱層析得到2-(2-(5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；醮?煙酸。白色固體，收率57％。
該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:10.02(s,1H),8.42(d,J＝7.2MHz,1H),8.22(d,J＝6.7MHz,1H),8.04(s,1H),7.10(m,2H),6.75(t,1H),5.11(s,2H),3.87(s,3H)；ESI-MS(m/z):335.31(M-H+)。由上可知，該化合物結(jié)構(gòu)正確，目標(biāo)化合物編號(hào)6a。
實(shí)施例5、2-(2-(5-氯-2-甲氧基苯胺基)乙?；醮?異煙酸的合成
按照與上相同的步驟，僅將2-羥基煙酸替換為2-羥基異煙酸，得到白色固體，收率62％。
該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下：
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:9.82(s,1H),8.08(d,J＝2.0MHz,1H),7.63(d,J＝6.8MHz,1H),7.33(d,J＝6.7MHz,1H),7.09-7.12(m,1H),6.80(d,J＝9.8MHz,1H),6.54(dd,J＝1.5,6.8MHz,1H),4.85(s,2H),3.87(s,3H)；ESI-MS(m/z):335.15(M-H+)。由上可知，該化合物結(jié)構(gòu)正確，目標(biāo)化合物編號(hào)6b。
實(shí)施例6、新的巰基煙酸類化合物對(duì)A型肉毒毒素內(nèi)肽酶活性的體外抑制作用。
采用底物切割法檢測(cè)化合物活性。A型肉毒毒素內(nèi)肽酶(BoNT/A-LC)的表達(dá)和純化參見(jiàn)文獻(xiàn)(L.Li,B.R.Singh,High-Level expression,purification,and characterization of recombinant type A botulinum neurotoxin light chain,Protein Expr Purif.1999,17:339–344.)。A型肉毒毒素底物CYA的構(gòu)建和表達(dá)純化參見(jiàn)文獻(xiàn)(D.R.Ruge,F.M.Dunning,T.M.Piazza,B.E.Molles,M.Adler,F.N.Zeytin,W.C.Tucker,Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters,J.Anal.Biochem.2011,411:200–209.)。在50μl反應(yīng)液(50mM Hepes–NaOH pH 7.4,10mM NaCl,0.1％Tween20,5mM dithiothreitol,10μM ZnCl2)中，加入終濃度10nM的BoNT/A-LC和100μg的化合物，37℃共孵育15min，再加入終濃度4μM的底物CYA(針對(duì)A型肉毒毒素)，體外切割30min。SDS-PAGE檢測(cè)和分析通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司Molecular Imager chemiDocTM XRS Imaging System)完成，凝膠圖像拍攝通過(guò)凝膠采集和圖像分析系統(tǒng)(ChampGel 5000Plus公司SAGECREATION)完成。數(shù)據(jù)通過(guò)Gel-Pro analyzer軟件分析處理，進(jìn)行蛋白片段灰度分析，與對(duì)照組進(jìn)行比較，計(jì)算出化合物的抑制率。
底物切割法檢測(cè)化合物體外抑制活性結(jié)果如表1所示，化合物對(duì)A型肉毒毒素內(nèi)肽酶活性具有不同的抑制作用，其抑制率范圍0-60.0％，其中實(shí)施例1所得2c所示化合物的抑制效果顯著，抑制率可達(dá)60.0％。
表1.底物切割法檢測(cè)化合物對(duì)A型肉毒毒素的抑制效果
實(shí)施例7、新的巰基煙酸類化合物對(duì)B型肉毒毒素內(nèi)肽酶活性的體外抑制作用。
采用底物切割法檢測(cè)化合物活性。B型肉毒毒素內(nèi)肽酶(BoNT/B-LC)的表達(dá)和純化參見(jiàn)文獻(xiàn)(J.Gilsdorf,N.Gul,L.A.Smith,Expression,purification,and characterization of Clostridium botulinum type B light chain,Protein Expr Purif 46(2006)256–267.)。B型肉毒毒素底物CYB的構(gòu)建和表達(dá)純化參見(jiàn)文獻(xiàn)(D.R.Ruge,F.M.Dunning,T.M.Piazza,B.E.Molles,M.Adler,F.N.Zeytin,W.C.Tucker,Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters,J.Anal.Biochem.2011,411:200–209.)。在50μl反應(yīng)液(50mM Hepes–NaOH pH 7.4,10mM NaCl,0.1％Tween20,5mM dithiothreitol,10μM ZnCl2)中，加入終濃度10nM的BoNT/B-LC和100μg的化合物，37℃共孵育15min，再加入終濃度4μM的底物CYB(針對(duì)B型肉毒毒素)，體外切割30min。SDS-PAGE檢測(cè)和分析通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司Molecular Imager chemiDocTM XRS Imaging System)完成，凝膠圖像拍攝通過(guò)凝膠采集和圖像分析系統(tǒng)(ChampGel 5000Plus公司SAGECREATION)完成。數(shù)據(jù)通過(guò)Gel-Pro analyzer軟件分析處理，進(jìn)行蛋白片段灰度分析，與對(duì)照組進(jìn)行比較，計(jì)算出化合物的抑制率。
底物切割法檢測(cè)化合物體外抑制活性結(jié)果如表1所示，化合物對(duì)B型肉毒毒素內(nèi)肽酶活性具有不同的抑制作用，其抑制率范圍0-85.0％，其中，實(shí)施例2所得6b所示化合物的抑制效果顯著，抑制率可達(dá)85.0％，其次為實(shí)施例2所得6a所示化合物，抑制率為80％。
表2.底物切割法檢測(cè)化合物對(duì)B型肉毒毒素的抑制效果
實(shí)施例8.新的巰基煙酸類化合物對(duì)動(dòng)物A型肉毒毒素中毒的保護(hù)效果
A型肉毒毒素(BoNT/A)的提取和鑒定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)(C.J.Malizio,M.C.Goodnough,E.A.Johnson,Purification of Clostridium botulinum type A neurotoxin,Methods Mol Biol.2000,145:27-39.)，Balb/c小鼠16-18g購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。肉毒毒素中毒的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)描述(C.H.Hatheway,J.D.Snyder,J.E.Seals,T.A.Edell,G.E.Lewis,Jr.Antitoxin levels in botulism patients treated with trivalent equine botulism antitoxin to toxin types A,B,and E.Infect Dis 1984,150:145-151.)的小鼠肉毒中毒模型方法，簡(jiǎn)要方法如下：以Balb/C小鼠為測(cè)試動(dòng)物，進(jìn)行隨機(jī)分組，10只/組，1mg的不同化合物為待檢樣品，先給小鼠尾靜脈注射5倍半數(shù)致死劑量(5LD50)的A型肉毒毒素，再給小鼠尾靜脈注射1mg的化合物(20％1,3-丙二醇溶解的化合物)溶液，同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組。持續(xù)觀察超過(guò)5天，觀察小鼠肉毒中毒體征(如出現(xiàn)蜂腰，皮毛倒立，呼吸微弱，四肢麻痹直至死亡)，記錄小鼠生存時(shí)間，計(jì)算存活率。
化合物在小鼠肉毒中毒模型中的抗毒作用如表36所示，化合物可以不同程度抑制A型肉毒毒素對(duì)受試動(dòng)物的致死效應(yīng)，其中，實(shí)施例1所得2c所示化合物的保護(hù)率最高(100％)，其次實(shí)施例2所得6a所示化合物的保護(hù)率為60％。
表3.化合物在小鼠A型肉毒中毒模型中的抗毒作用
注：表3中安慰劑為溶媒(體積百分濃度20％的1,3-丙二醇水溶液)；抗毒素為A型馬血清抗毒素(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)
實(shí)施例9.巰基煙酸類化合物對(duì)動(dòng)物B型肉毒毒素中毒的保護(hù)效果
B型肉毒毒素(BoNT/B)的提取和鑒定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)(H.Arimitsu,K.Inoue,Y.Sakaguchi,J.Lee,Y.Fujinaga,T.Watanabe,T.Ohyama,R.Hirst,K.Oguma,Purification of fully activated Clostridium botulinum serotype B toxin for treatment of patients with dystonia,Infect Immun.71(2003)1599-1603.)，Balb/c小鼠14-16g購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
肉毒毒素中毒的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)描述(C.H.Hatheway,J.D.Snyder,J.E.Seals,T.A.Edell,G.E.Lewis,Jr.Antitoxin levels in botulism patients treated with trivalent equine botulism antitoxin to toxin types A,B,and E.Infect Dis 1984,150:145-151.)的小鼠肉毒中毒模型方法，簡(jiǎn)要方法如下：以Balb/C小鼠為測(cè)試動(dòng)物，進(jìn)行隨機(jī)分組，10只/組，1mg的不同化合物為待檢樣品，先給小鼠尾靜脈注射3倍半數(shù)致死劑量(3LD50)的B型肉毒毒素，再給小鼠尾靜脈注射1mg的化合物(20％1,3-丙二醇溶解的化合物)溶液，同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組。持續(xù)觀察超過(guò)5天，觀察小鼠肉毒中毒體征(如出現(xiàn)蜂腰，皮毛倒立，呼吸微弱，四肢麻痹直至死亡)，記錄小鼠生存時(shí)間，計(jì)算存活率。
化合物在小鼠肉毒中毒模型中的抗毒作用如表4所示，化合物可以不同程度抑制B型肉毒毒素對(duì)受試動(dòng)物的致死效應(yīng)，其中，實(shí)施例2所得6b所示化合物的保護(hù)率最高，為80％；其次為實(shí)施例1所得2c所示化合物和實(shí)施例2所得6a所示化合物，其保護(hù)率均為20％。
表4.化合物在小鼠B型肉毒中毒模型中的抗毒作用
注：表4中安慰劑為溶媒(體積百分濃度20％的1,3-丙二醇水溶液)；抗毒素為B型馬血清抗毒素(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)。