本發(fā)明涉及一種兩親性多功能聚合物及其制備的納米膠束和應(yīng)用，特別涉及一種側(cè)鏈分別含有細(xì)胞外層膜兩性離子磷酰膽堿，膽固醇和葉酸的兩親性多功能聚合物及其納米載藥膠束的制備方法及應(yīng)用，屬于高分子化學(xué)與物理及生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著納米醫(yī)藥的快速發(fā)展，近幾十年來納米藥物載體備受關(guān)注。納米藥物傳輸體系（DDS）是以納米顆粒作為抗癌藥物及基因載體，將藥物等包載在納米顆?？障吨谢蛭皆谄浔砻?，通過血液循環(huán)的方式，利用增強(qiáng)的滲透和滯留（EPR）效應(yīng)實(shí)現(xiàn)納米顆粒物理靶向到癌癥組織并被癌細(xì)胞攝入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向藥物輸送和基因治療。

然而隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)當(dāng)納米顆粒通過靜脈注射或口服的方式在血液循環(huán)過程中，在到達(dá)其病變部位之前會(huì)經(jīng)歷被識(shí)別為外源物質(zhì)而通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）的高吞噬性單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng) （MPS）攝取而離開循環(huán)系統(tǒng)。這種攝取的納米藥物累積在其它正常器官組織中產(chǎn)生毒副作用，并嚴(yán)重影響藥物輸送的效率。此外，納米載藥載體進(jìn)入體內(nèi)后受高倍稀釋及其它因素的影響，載體解離引起藥物提前釋放影響載體的臨床應(yīng)用。還有，雖然葉酸已被用于不同抗癌藥的靶向性組分研究，來降低藥物對(duì)正常組織細(xì)胞的傷害，增加對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用，但許多研究報(bào)道葉酸組分的靶向作用較難表現(xiàn)（Lee J. H., et al. J. Controlled Release, 2015, 209, 219-228;Qiu L. Y., et al. International Journal of Pharmaceutics, 2013, 456, 315-324）。因此，從仿生角度出發(fā)進(jìn)行納米顆粒載體的設(shè)計(jì)或表面仿生改性有可能改善其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、外表面攜帶細(xì)胞外層膜兩性離子基團(tuán)使負(fù)載藥物的納米顆粒很難被體內(nèi)免疫系統(tǒng)識(shí)別及清除，更容易實(shí)現(xiàn)血液長(zhǎng)循環(huán)性能及高選擇性的靶向作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明以提高納米載藥系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的靶向作用、延長(zhǎng)在血液中循環(huán)時(shí)間為突破口，從細(xì)胞膜仿生角度出發(fā)，設(shè)計(jì)了一種含靶向基團(tuán)葉酸、仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的兩性離子親水基團(tuán)和強(qiáng)疏水性膽固醇側(cè)鏈的仿生多功能兩親性隨機(jī)共聚物。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)兩親性隨機(jī)共聚物膠束的制備方法，通過控制制備條件達(dá)到葉酸基團(tuán)盡可能多地在膠束外表面分布，以便達(dá)到更有效地與癌細(xì)胞表面葉酸受體蛋白結(jié)合進(jìn)入癌細(xì)胞的目的，獲得了一種既具良好的膠束穩(wěn)定性、體內(nèi)隱形性、低毒性、又具有被動(dòng)和主動(dòng)靶向作用的新型多功能載藥膠束。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供具有仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的體內(nèi)隱形及腫瘤靶向性納米載藥膠束的具體應(yīng)用。其能像人的紅細(xì)胞一樣在血液中長(zhǎng)循環(huán)，不易被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別，在癌變部位高效富集，達(dá)到治療癌癥的目的。

本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程如下：

結(jié)構(gòu)通式（I）所示的兩親性多功能聚合物，簡(jiǎn)稱為PMNCF，其中R為氫或甲基；

其中，x為10～1000的正整數(shù)，y為5～500的正整數(shù)，z為0～500的正整數(shù)；在x、y、z中，x摩爾百分?jǐn)?shù)為40~75%，y為10~30%，z為0～35%；優(yōu)選為x摩爾百分?jǐn)?shù)為40~75%，y為10~30%，z為10～35%；

n₁ 為1~3的正整數(shù)，R₁為同時(shí)帶有正負(fù)電荷的兩性離子親水基團(tuán)

n₂為5~50的正整數(shù)，R₂為含有膽固醇的憎水基團(tuán)

n₃為5~50的正整數(shù)，R₃為含有葉酸的腫瘤葉酸受體靶向基團(tuán)

上述兩親性多功能聚合物的制備方法：PMNCF由含有兩性離子及活性酯的兩種可聚合單體通過在溶液中自由基引發(fā)隨機(jī)共聚首先得到兩性離子單元摩爾分?jǐn)?shù)x為40%~75%的二元隨機(jī)共聚物PMN（Gong Y. K., et al. Macrom. Biosci., 2012, 12, 979-985），然后用含有氨基的膽固醇及含有氨基的葉酸分子對(duì)聚合物中的活性酯單元進(jìn)行酰胺化接枝反應(yīng)，活性酯單元1-x = 60%~25%，得到膽固醇單元摩爾分?jǐn)?shù)y為10%~30%，葉酸單元摩爾分?jǐn)?shù)z為0%~35%的多功能聚合物。

上述聚合反應(yīng)在無水有機(jī)溶劑二甲亞砜中進(jìn)行。

上述方法制備的兩親性多功能聚合物制備納米載藥膠束的方法：用二甲基亞砜溶解PMNCF聚合物及憎水性藥物，將占聚合物質(zhì)量百分?jǐn)?shù)10%~50%的藥物溶液與聚合物溶液加入快速攪拌的水溶液中自動(dòng)形成直徑30~150 納米的載藥膠束，形成穩(wěn)定的納米載藥膠束水溶液。

上述制備過程中，調(diào)節(jié)水溶液的pH為4~6很關(guān)鍵，大于6或小于4，將導(dǎo)致膠束不穩(wěn)定，靶向基團(tuán)暴露不充分，靶向性差。

所述具有憎水性藥物選自阿霉素、紫杉醇、表柔比星、羥基喜樹堿、吡柔比星、多西他賽、異長(zhǎng)春花堿、奧沙利鉑。

上述多功能型兩親性聚合物在水溶液中可自組裝形成膠束，可作為疏水性抗癌藥物的載體，制備過程中，用超濾離心方法對(duì)有機(jī)溶劑及游離藥物進(jìn)行分離，提純及濃縮納米載藥膠束。

具體地說，多功能兩親性聚合物載藥膠束采取如下方法制備：將兩親性聚合物（PMNCF）和藥物如阿霉素溶于DMSO中，滴加到pH為4~6的水中，利用兩親性聚合物自組裝實(shí)現(xiàn)藥物的負(fù)載。然后通過透析或超濾離心的方式除去有機(jī)溶劑以及游離的阿霉素得到載藥膠束。將形成的載藥膠束通過測(cè)量其粒徑、Zeta電位、儲(chǔ)存穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)等，評(píng)估載藥膠束的性能。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極的效果：（1）本發(fā)明通過在兩親性聚合物側(cè)鏈上引入細(xì)胞外層膜磷酰膽堿強(qiáng)親水基團(tuán)、膽固醇強(qiáng)疏水基團(tuán)及葉酸靶向基團(tuán)，在弱酸性水溶液中自組裝容易形成穩(wěn)定的可負(fù)載藥物的仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)膠束，賦予膠束體內(nèi)“隱形”功能；（2）本發(fā)明在弱酸性水溶液中組裝增加了葉酸基團(tuán)的溶解，有較多葉酸基團(tuán)分布于膠束外表面可最大限度地發(fā)揮主動(dòng)靶向作用；（3）本發(fā)明聚合物各單體基團(tuán)摩爾含量可根據(jù)實(shí)際需求來控制合成，因此形成的膠束粒徑范圍、靶向基團(tuán)含量等可控，可以進(jìn)行長(zhǎng)循環(huán)及靶向性能的優(yōu)化篩選；（4）形成的納米載藥膠束親水層外連接有設(shè)計(jì)含量的葉酸基團(tuán)，與乳腺癌細(xì)胞、KB細(xì)胞及HeLa細(xì)胞有2~4倍的高選擇性靶向作用；納米載藥膠束具有仿細(xì)胞外層膜親水層結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)抗免疫系統(tǒng)識(shí)別及清除作用優(yōu)異；（5）本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，可降低應(yīng)用成本。與普遍使用的兩親性嵌段共聚物的合成制備相比，制備兩親性隨機(jī)共聚物的條件及工藝過程非常簡(jiǎn)便易行，容易推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為聚合物PMNCF-23的¹H NMR譜圖；

圖2為系列載藥PMNCF膠束在不同的釋放介質(zhì)中的藥物累積釋放率(a)pH=5.0; (b) pH=7.4；

圖3不同濃度載阿霉素的PMNCF膠束與MADB-106細(xì)胞培48 h養(yǎng)后的癌細(xì)胞存活率；

圖4為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)不同聚合物膠束攝取2 h后的熒光顯微鏡照片；

圖5為大鼠乳腺癌細(xì)胞MADB-106不同時(shí)間對(duì)無FA修飾以及FA摩爾百分比不同的膠束攝取后的熒光顯微鏡照片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1 氨基化膽固醇的制備

將50 mL的無水二氯甲烷和37.5 mL的無水乙二胺加入到250 mL三頸圓底燒瓶中，置于冰鹽浴中使反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)至0℃。然后稱取5.02 g（0.0112 mol）的氯甲酸膽固醇酯，將其溶解于60 mL 的無水二氯甲烷中，溶解充分后將溶液轉(zhuǎn)移至恒壓滴液漏斗中。在高速攪拌狀態(tài)下將該溶液滴加到前述三頸圓底燒瓶中，反應(yīng)結(jié)構(gòu)式如下：

滴加完畢后，室溫條件下避光反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液用等體積的蒸餾水萃取三次，除去乙二胺鹽酸鹽和乙二胺，用大量無水硫酸鎂干燥有機(jī)相，過夜除去少量的水。將干燥后的有機(jī)相減壓抽濾除去硫酸鎂固體，得到的清液在室溫條件下避光旋蒸然后于30℃真空干燥，所得乳白色固體即為Chol-NH₂。

實(shí)施例2 氨基化葉酸的制備

第一步：?jiǎn)伟被Ｗo(hù)乙二胺（BOC-NH₂）的合成：

將4.40 g（0.0732 mol）乙二胺溶解在110 mL含10%三乙胺的甲醇溶液中，在劇烈攪拌下，將溶解在10 mL甲醇中的3.63 g（0.0172 mol）二碳酸二叔丁基酯慢慢滴加到上述溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。反應(yīng)完畢后，室溫旋蒸除去甲醇，得到油狀產(chǎn)物，將其溶解在100 mL二氯甲烷中，用10%碳酸鈉水溶液洗滌除去乙二胺，有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥過夜，過濾，真空干燥后得到單氨基保護(hù)的產(chǎn)物（BOC-NH₂）。

第二步：葉酸活性酯與單氨基保護(hù)的乙二胺反應(yīng)合成：

將1.00 g（0.0023 mol）葉酸（FA）加入到40 mL無水DMSO中，再加入0.5 mL三乙胺，避光攪拌過夜。加入0.50 g（0.0023 mol）DCC和0.52 g（0.0046 mol）NHS，避光繼續(xù)攪拌24 h對(duì)葉酸的γ位羧基進(jìn)行活化。過濾除去不溶物后，向?yàn)V液中加0.39 g（0.0025 mol）BOC-NH₂，室溫避光反應(yīng)過夜。過濾除去不溶物后，慢慢滴加到劇烈攪拌的400 mL無水乙醚和丙酮中（1:1，V/V），然后冰水浴0℃冷卻，靜置得到黃色沉淀。離心得到黃色沉淀然后用乙醚洗滌三次除去殘留的DMSO，得到的黃色粉末常溫真空干燥一天，得到單氨基保護(hù)的產(chǎn)物（FA-NHBOC）。

第三步：FA-BOC去保護(hù)：

將0.46 g（0.0008 mol）產(chǎn)物溶解于4 mL三氟乙酸中，室溫?cái)嚢? h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用30 mL無水乙醚沉淀。沉淀用5 mL DMF溶解后再用25 mL乙醚沉淀，棄去上清液后用乙醚洗滌三次，4 000 rpm/min離心得到黃色沉淀。最后室溫真空干燥一天，得到產(chǎn)物FA-NH₂。

實(shí)施例3 可聚合活性脂單體（NPEM）的制備

含有對(duì)硝基苯氧甲?；纂x去基團(tuán)的對(duì)硝基苯氧甲酰聚乙二醇甲基丙烯酸脂（NPEM）的制備作過程如下：在250 mL三頸圓底燒瓶中，加入17.05 g （0.0324 mol）甲基丙烯酸聚乙二醇酯，4.80 g（0.0475 mol）三乙胺及60 mL氯仿使其溶解。稱取9.62 g（0.0531 mol）對(duì)硝基苯氧甲酰氯溶解在100 mL氯仿溶液中用恒壓滴液漏斗以3 s/d的速度滴加至機(jī)械攪拌條件下-20℃的三頸燒瓶?jī)?nèi)。滴加完畢后保持此溫度繼續(xù)反應(yīng)2 h，然后恢復(fù)室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完畢后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將反應(yīng)液濃縮，再加入等體積50 mL冷的乙醚沉淀濾除三乙胺鹽酸鹽。室溫旋蒸除去乙醚，加入等體積的氯仿，得到淡黃色的液體。用等體積的pH= 3.0~4.0的磷酸緩沖溶液萃取以除去殘余的三乙胺鹽及三乙胺，重復(fù)3次后將收集的有機(jī)相在30℃旋蒸至沒有液滴出現(xiàn)為止，得到的淡黃色油狀物即為活性酯單體對(duì)硝基苯氧甲酰聚乙二醇甲基丙烯酸酯（NPEM）。

實(shí)施例4合成含磷酰膽堿基團(tuán)和活性酯基團(tuán)的二元聚合物（PMN）

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向250 mL三頸圓底燒瓶中加入10 mL無水乙醇，稱取0.11 g偶氮二異丁腈（AIBN）溶于6 mL THF，待完全溶解后取該溶液的四分之一體積轉(zhuǎn)移至上述三頸瓶?jī)?nèi)，升溫至70 ℃恒溫，磁力攪拌，保持該狀態(tài)30 min。向100 mL恒壓滴液漏斗內(nèi)加入60 mL溶有NPEM 3.57 g（0.0068 mol）和2.00 g（0.0068 mol）磷酰膽堿（MPC）的無水乙醇溶液，以及余下四分之三體積溶解有AIBN 的THF溶液。待充分混合后，將該溶液緩慢滴加至前述三頸瓶?jī)?nèi)反應(yīng)24 h，得到淡黃色的透明溶液。反應(yīng)完成后，減壓旋蒸除去三分之二溶劑后，在截留分子量為3 500 Da的透析袋內(nèi)透析。先用其良溶劑無水乙醇透析3次，然后用pH=3.0~4.0的磷酸緩沖液透析6次，每次3~8 h。之后-50 ℃冷凍干燥，得到的白色絮狀物即為共聚物PMN。¹H-NMR 測(cè)得共聚物PMN中NPEM組分的摩爾百分含量為39%。同樣的方法來合成一系列NPEM組分的摩爾百分含量分別為27%、36%和42%的共聚物。

實(shí)施例 5仿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)兩親性多功能共聚合物PMNCF的合成

利用活性酯基團(tuán)在弱堿性條件下將氨基化的葉酸和膽固醇接枝到聚合物PMN分子鏈上，稱取0.50 克 PMN-39，將其轉(zhuǎn)移至250 mL三頸圓底燒瓶?jī)?nèi)，量取20 mL的DMSO轉(zhuǎn)移至其中，再加入200 μL三乙胺，溫度調(diào)節(jié)至80 ℃恒溫?cái)嚢? h使其充分溶解。稱取氨基化膽固醇0.15 g（0.0003 mol），將其溶解于30 mL的DMSO中，待溶解充分，將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗滴入燒瓶?jī)?nèi)恒溫反應(yīng)3 h。然后向該反應(yīng)燒瓶?jī)?nèi)滴加含0.59 g（0.0012 mol）FA-NH₂的30 mL DMSO溶液，80 ℃恒溫避光反應(yīng)20 h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液用截留分子量為3 500 Da的透析袋透析。先用DMSO于45 ℃透析3次后，再用蒸餾水避光透析8次，每次3~8 h。透析完畢后，將產(chǎn)物在-50℃下冷凍干燥，即得聚合物PMNCF。用¹H-NMR確定聚合物及各組分的摩爾百分含量，測(cè)得共聚物PMNCF中各組分的摩爾百分含量為 MPC/Chol/FA = 61/16/23，用PMNCF-23表示（圖1）。

實(shí)施例6 PMNCF-9膠束制備

將2 mL 5 mg/mL PMNCF-9聚合物的DMSO溶液緩慢滴入到快速攪拌的10 mL pH 5.0的去離子水中，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌6 h。將混合溶液轉(zhuǎn)移至截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋中，在20 mL超純水中透析48 h，其間每隔3~4 h更換新鮮超純水。透析完成后，移出透析袋內(nèi)的溶液，以6 000 rpm/min離心20 min除去大顆粒雜質(zhì)。移取上清液用動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS）分別測(cè)定膠束分散液的Zeta電位和粒徑大小及其分布。

實(shí)施例7 PMNCF-31膠束制備

50 mg PMNCF-31聚合物于攪拌下溶解于10 mL DMSO中，然后將該溶液緩慢滴入到50mL快速攪拌下pH=5.0的去離子水中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌6 h。將膠束溶液轉(zhuǎn)移至截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 000的超濾離心管中，以4 000 rpm/min離心超濾20 min，重復(fù)3次除去DMSO。濃縮液用超純水定容得到一定濃度（1 mg/mL）的膠束溶液，動(dòng)態(tài)光散射得Zeta電位-13.9±0.8 mV，數(shù)目平均水合粒徑56.0±7.5 nm， PDI=0.219。

實(shí)施例8 載阿霉素PMNCF膠束

稱取30 mg 的PMNCF-23聚合物溶于6 mL DMSO。將11.4 mg鹽酸阿霉素溶于2 mL DMSO后加入6.1 mg三乙胺攪拌4 h。與上述PMNCF-23溶液混合均勻后以3 s/d滴加到快速攪拌的30 mL去離子水中（pH=5.12），滴加完成后繼續(xù)攪拌6 h。再將混合溶液轉(zhuǎn)移至截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500 Da的透析袋中，于500 mL超純水中透析48 h，其間每隔3~8 h更換新鮮超純水。透析完成后，取出透析袋內(nèi)的溶液，以6 000 rpm/min離心20 min，除去大顆粒雜質(zhì)。上清液用截留分子量為3 000 Da的超濾離心管在4 000 rpm/min離心超濾20 min，最后用 0.45 μm濾膜過濾，稀釋定容得到6 mg/mL和1 mg/mL的膠束溶液。移取1 mg/mL的載藥膠束溶液用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)得Zeta電位-8.7±1.7 mV，數(shù)目平均水合粒徑87.1±4.9 nm， PDI=0.072。

實(shí)施例9 載藥膠束控制釋放特征曲線

取4.0 mL載藥阿霉素膠束（1 mg/mL）溶液加入截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500 Da的透析袋中，并將透析袋置于50 mL旋蓋離心管中，用量筒量取20 mL的釋放介質(zhì)（pH=7.4或pH=5.0）的緩沖溶液。在恒溫37℃，100 rpm/min搖床上進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，間隔一定時(shí)間取透析介質(zhì)3 mL分析釋藥濃度，同時(shí)補(bǔ)加3 mL新鮮介質(zhì)透析液繼續(xù)釋藥過程。得到的阿霉素釋藥曲線如圖2所示。與游離阿霉素的釋放曲線相比，載藥膠束具有明顯的緩釋效果。

實(shí)施例10載阿霉素PMNCF膠束的細(xì)胞毒性

通過四唑鹽比色法（MTT法）檢測(cè)細(xì)胞存活率，從而判斷細(xì)胞毒性，評(píng)估空白膠束、載藥膠束和游離阿霉素對(duì)細(xì)胞毒性、濃度依賴性和載藥膠束緩釋效果。本實(shí)驗(yàn)用大鼠乳腺癌（MADB-106）細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。

MADB-106細(xì)胞于96孔板內(nèi)貼壁培養(yǎng)24 h后，用含PMNCF膠束的RPMI 1640培養(yǎng)液替換細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h、48 h。吸出培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)液后加入無菌PBS洗去死細(xì)胞，淋洗3次。用倒置顯微鏡下觀察不同濃度的聚合物膠束對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。然后向每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL MTT的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。小心吸掉上清液后每孔加入DMSO 200 μL，置于恒溫37℃的搖床上振蕩10 min使其灰色結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的OD值，計(jì)算得到各試樣細(xì)胞相對(duì)成活率（圖3）。

實(shí)施例11 載熒光探針香豆素-6 膠束的制備

稱取25 mg PMNCF聚合物溶于5 mL二甲基亞砜中，攪拌6 h使其溶解充分。加入50 μL濃度為0.5 mg/mL香豆素-6的三氯甲烷溶液混合均勻后，在劇烈攪拌下滴加到25 mL去離子水中（pH=5.12），滴加完成后繼續(xù)攪拌6 h。然后將膠束溶液轉(zhuǎn)移至截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500 Da的透析袋中，于500 mL蒸餾水中透析48 h，其間每隔3~8 h更換一次蒸餾水。透析后取出透析袋內(nèi)的溶液，在離心機(jī)中以6 000 rpm/min離心20 min，除去大顆粒雜質(zhì)。取上清液（10 mL）用截留分子量為3 000 Da的超濾離心管在離心機(jī)中以4 000 rpm/min離心20 min，然后再補(bǔ)加超純水定容到10 mL，以此方法再離心數(shù)次上清液達(dá)到濃縮和進(jìn)一步除去游離香豆素-6 的目的。最后將濃縮液定容到5或25 mL得到濃度為5 mg/mL或1 mg/mL的載熒光探針膠束溶液。

實(shí)施例12 體外細(xì)胞攝取率測(cè)定

用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（MPM）來測(cè)定對(duì)不同膠束或納米顆粒的攝取率。

第一步：用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)基配制濃度1.0×10⁶個(gè)/mL的MPM細(xì)胞細(xì)胞懸液分注于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 000 μL，在37℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h使細(xì)胞貼壁。

第二步：棄去原培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組加入用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋好的載香豆素-6的PMNCF膠束培養(yǎng)液（0.20 mg/mL）1 000 μL，空白組加細(xì)胞培養(yǎng)基1 000 μL，對(duì)照組加0.20 mg/mL的載等量香豆素-6的聚乳酸納米顆粒1 000 μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；置入37℃、5% CO₂、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)2 h。

第三步：2 h后移出并回收含有未被攝取的香豆素-6培養(yǎng)液于離心管中，1 500 rpm/min條件下離心10 min，上清液用熒光分光光度計(jì)在430 nm處激發(fā)，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，掃描速度1200 nm/min，激發(fā)電壓700 V，掃描445~630 nm波長(zhǎng)范圍的熒光發(fā)射光譜，讀取500 nm處的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度。

以加入的載香豆素-6膠束分散液熒光強(qiáng)度為對(duì)照，按照以下公式計(jì)算巨噬細(xì)胞對(duì)聚合物膠束的攝取率。

其中I₀——加入的載熒光探針聚合物膠束分散液的熒光強(qiáng)度

I ——被巨噬細(xì)胞攝取后，載熒光探針聚合物膠束分散液上清液的熒光強(qiáng)度。

第四步：細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔用200 μL PBS淋洗三次洗去吸附在細(xì)胞表面并未牢固結(jié)合的聚合物膠束或納米顆粒，然后在倒置熒光顯微鏡下通過明場(chǎng)和熒光場(chǎng)觀察細(xì)胞形貌及有無熒光現(xiàn)象，定性判斷巨噬細(xì)胞對(duì)膠束的吞噬情況。利用熒光分光光度計(jì)計(jì)算攝取率的結(jié)果與熒光倒置顯微鏡定性觀察明場(chǎng)和熒光場(chǎng)巨噬細(xì)胞吞噬情況基本一致。對(duì)比說明含PC基團(tuán)聚合物膠束大大降低了被巨噬細(xì)胞吞噬的幾率。吞噬率計(jì)算結(jié)果如圖4所示。

實(shí)施例13 葉酸受體靶向膠束的靶向性測(cè)定

以大鼠乳腺癌細(xì)胞MADB-106細(xì)胞為模型細(xì)胞，考察腫瘤細(xì)胞攝取膠束的情況，評(píng)價(jià)體外癌細(xì)胞靶向性能。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：

MADB-106細(xì)胞于含10% FBS、含雙抗及不含葉酸的RPMI-1640培養(yǎng)液中以密度為5×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔的密度種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)液，每孔加入0.20 mg/mL的一系列負(fù)載香豆素-6膠束分散液1.0 mL，在37℃、飽和濕度下、5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育不同時(shí)間（2 h、6 h、12 h），通過明場(chǎng)和熒光場(chǎng)定性的考察不同培養(yǎng)時(shí)間腫瘤細(xì)胞對(duì)膠束攝取的情況。培養(yǎng)不同時(shí)間后，收集含有未被攝取的膠束培養(yǎng)液，測(cè)熒光強(qiáng)度定量判斷腫瘤細(xì)胞的攝取效率。用PBS反復(fù)淋洗孔板內(nèi)細(xì)胞三次，洗去吸附在細(xì)胞表面并未牢固結(jié)合的膠束。在倒置熒光顯微鏡下觀察明場(chǎng)和熒光場(chǎng)，定性判斷腫瘤細(xì)胞攝取情況。如圖5結(jié)果顯示，PMNCF-31的膠束攝取率是無葉酸修飾膠束的3~5倍，說明膠束通過葉酸受體介導(dǎo)可以顯著提高癌細(xì)胞對(duì)膠束的攝取能力，從而實(shí)現(xiàn)載藥膠束的細(xì)胞靶向性。