本發(fā)明涉及甾體藥物的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種發(fā)酵降解植物甾醇制備4-雄烯二酮的方法。

背景技術(shù)：

雄烯二酮是合成甾類激素藥物重要的原料和中間體，4-雄烯二酮傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝是從黃姜等植物中提取薯蕷皂苷，再經(jīng)化學(xué)合成制備4-雄烯二酮；另一種是利用微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)4-雄烯二酮。前者廢水排放量大，黃姜種植不穩(wěn)定，國(guó)家管控越來(lái)越嚴(yán)格；后者操作簡(jiǎn)單、污染較小，為現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。但是后者也存在一定的缺點(diǎn)，比如一般發(fā)酵過(guò)程為油水兩相發(fā)酵，過(guò)程投料量低，蒸汽、水、電、人工等消耗大，收率相對(duì)于理論值偏低、后提取工藝存在溶劑使用較多等問(wèn)題。在申請(qǐng)?zhí)枮?01310490547的中國(guó)專利申請(qǐng)中公開了雄烯二酮生產(chǎn)配方的優(yōu)化，在申請(qǐng)?zhí)枮?01410113381的中國(guó)專利申請(qǐng)中公開了一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物甾醇制備4-雄烯二酮的方法，在申請(qǐng)?zhí)枮?01310181803的專利申請(qǐng)中公開了一種用于制備雄烯二酮的微生物菌株及其應(yīng)用，上述方法雖然均對(duì)雄烯二酮的制備方法，特別是發(fā)酵方法提出了優(yōu)化設(shè)計(jì)，但是，上述專利中都存在底物甾醇投料量低的缺點(diǎn)，這樣在無(wú)形中增加了廢水處理的成本，同時(shí)發(fā)酵罐的利用率低，增加產(chǎn)品成本。雖然使用乳化劑可以代替植物油，但是當(dāng)?shù)孜锿读狭看笥?％時(shí)底物剩余量就會(huì)大大增加，所以如何提高底物投料量同時(shí)提高發(fā)酵收率是一個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述背景技術(shù)，本發(fā)明提供了一種高底物濃度的4-雄烯二酮的發(fā)酵方法，通過(guò)添加乳化劑和植物油，使底物植物甾醇的投料量由原來(lái)的4％提高到現(xiàn)在的8％，有效的節(jié)約了發(fā)酵成本，提高了發(fā)酵收率，減少了廢水的排放。

一種4-雄烯二酮的制備方法，其特征在于，所述方法包括：

1)菌種繁殖，所述菌種為mycobacteriumsp.nrrlb-3805；

2)將底物植物甾醇與植物油、乳化劑在發(fā)酵罐中混合后升溫到100-120℃乳化，并將乳化后的溶液與水、培養(yǎng)基混合后滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基；優(yōu)選地，在所述植物甾醇、植物油和乳化劑三者中植物甾醇16-20重量份，植物油16-20重量份，乳化劑0.8-1.6重量份；更優(yōu)選地，在所述植物甾醇、植物油和乳化劑三者中植物甾醇20重量份，植物油16重量份，乳化劑1重量份；

3)將步驟1)繁殖后的菌種接入到步驟2)得到的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

4)由經(jīng)過(guò)步驟3)發(fā)酵的培養(yǎng)基中提取4-雄烯二酮。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)所述的菌種繁殖是通過(guò)包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的：

a)一級(jí)種子罐培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時(shí)使一級(jí)種子罐中的菌種濃度達(dá)到5g每100ml發(fā)酵液以上；所述一級(jí)種子罐的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸鈉4-6g/l，磷酸氫二銨0.4-0.8g/l，以去離子水定容至所需體積并調(diào)節(jié)ph值至7.5；

b)將步驟a)培養(yǎng)的菌種以10-20％的接種量接種到二級(jí)種子罐中，培養(yǎng)30小時(shí)，至二級(jí)種子罐中的菌種濃度達(dá)到10％以上；所述二級(jí)種子罐的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸鈉4-6g/l，磷酸氫二銨0.4-0.8g/l，以去離子水定容至所需體積并調(diào)節(jié)ph值至7.5。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述菌種濃度的檢測(cè)方法為取10ml發(fā)酵液在離心機(jī)上在10000g的條件下離心10分鐘，測(cè)沉淀濕重，并計(jì)算所述沉淀濕重與所述10ml發(fā)酵液的比值。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組份：玉米漿干粉20-30g/l，黃豆餅粉15-25g/l，磷酸二氫鉀2-4g/l，硫酸鎂0.2-0.5g/l，硫酸亞鐵0.02-0.05g/l，植物甾醇80-100g/l，乳化劑4-8g/l，植物油80-100g/l，泡敵1-2g/l，ph值7.5-8.0。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述乳化劑選自吐溫60、吐溫80、司盤60、曲拉通x-100和卵磷脂中的一種或多種，優(yōu)選為卵磷脂。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物油選自玉米油、瓜子油、菜籽油、豆油，優(yōu)選為豆油。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵條件為：

溫度30±1℃，罐壓0.04-0.06mpa，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，通氣比為0.3-0.5，發(fā)酵過(guò)程中利用磷酸或者氨水控制ph為7.2±0.2，

當(dāng)植物甾醇剩余量低于5％時(shí)放罐；發(fā)酵周期為180±20h。

本發(fā)明還提供了一種用于制備4-雄烯二酮的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組份：玉米漿干粉20-30g/l，黃豆餅粉15-25g/l，磷酸二氫鉀2-4g/l，硫酸鎂0.2-0.5g/l，硫酸亞鐵0.02-0.05g/l，植物甾醇80-100g/l，乳化劑4-8g/l，植物油80-100g/l，泡敵1-2g/l，ph值7.5-8.0。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述乳化劑選自吐溫60、吐溫80、司盤60、曲拉通x-100、卵磷脂，優(yōu)選為卵磷脂。

在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物油選自玉米油、瓜子油、菜籽油、豆油，優(yōu)選為豆油。

另一方面，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的目的在于提高發(fā)酵過(guò)程中底物的投料量，推動(dòng)反應(yīng)進(jìn)程，使發(fā) 酵的收率得到提高，同時(shí)節(jié)約人工水電等提高設(shè)備利用率，發(fā)揮工藝的最佳水平。

由于發(fā)酵底物植物甾醇不溶于水，易溶于油，限制了水相中菌體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化，在申請(qǐng)?zhí)枮?01410113381的中國(guó)專利雖然也提到了使用乳化劑實(shí)現(xiàn)助溶效果，但是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)僅使用乳化劑無(wú)法將大顆粒的底物溶解，阻礙了轉(zhuǎn)化，使其最后的轉(zhuǎn)化率只有73％，發(fā)酵培養(yǎng)基中仍然有大量底物剩余，并且發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用乳化劑時(shí)底物的投料量只有1.5％-3％。在付出艱苦的勞動(dòng)后發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用植物油和乳化劑的混合體系，不僅乳化效果大大提高，而且植物油的使用還可以使底物的投料量達(dá)到10％，另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中植物油還可以為菌體的生長(zhǎng)提供部分碳源，同時(shí)減少了發(fā)酵過(guò)程中的泡沫。最終根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了90％，效價(jià)達(dá)到了50g/l。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說(shuō)明和闡釋本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明。

除非特別指明，本發(fā)明所使用的試劑和材料均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1種瓶培養(yǎng)

培養(yǎng)基組分為：

將生長(zhǎng)成熟的斜面接種到3l大種瓶中，大種瓶的裝量為500ml，31.5℃，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為40±3h，菌株(mycobacteriumsp.nrrlb-3805)從英國(guó)國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏中心(ncimb)購(gòu)買，商品號(hào)為ncimb11678。長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期后期，菌體量達(dá)到最大，ph值達(dá)到6.5左右。

實(shí)施例2500l一級(jí)罐(種子罐)培養(yǎng)：

培養(yǎng)基配方為：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸鈉4-6g/l，磷酸氫二銨0.4-0.8g/l，ph值7.5。

將生長(zhǎng)好的種瓶接種到500l種子罐，接種量為1l，培養(yǎng)工藝為：溫度30±1℃，罐壓0.04-0.06mpa，攪拌轉(zhuǎn)速50-100rpm，通氣比為0.3-0.5，培養(yǎng)周期為40h。

實(shí)施例33噸二級(jí)罐培養(yǎng)

培養(yǎng)基配方為：葡萄糖6-10g/l，甘油6-10g/l，硝酸鈉4-6g/l，磷酸氫二銨0.4-0.8g/l，ph值7.5。

一級(jí)罐移種條件：ph值升至7.5以上，顯微鏡檢查沒(méi)有其他雜菌，菌濃達(dá)到5％以上，菌體形態(tài)粗壯。

培養(yǎng)工藝為：溫度30±1℃，罐壓0.04-0.06mpa，攪拌轉(zhuǎn)速50-100rpm，通氣比為0.3-0.5，培養(yǎng)周期為30h。

移種條件為：ph小于8.0，菌濃大于10％，鏡檢正常，菌體粗壯。

實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿干粉20-30g/l，黃豆餅粉15-25g/l，磷酸二氫鉀2-4g/l，硫酸鎂0.2-0.5g/l，硫酸亞鐵0.02-0.05g/l，植物甾醇80-100g/l，乳化劑4-8g/l，植物油80-100g/l，泡敵1-2g/l，ph值7.5-8.0。

消毒前先對(duì)底物、油、乳化劑進(jìn)行高溫乳化；乳化后加水和培養(yǎng)基進(jìn)行消毒，消毒溫度為125±2℃；

培養(yǎng)工藝為：溫度30±1℃，罐壓0.04-0.06mpa，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，通氣比為0.3-0.5，發(fā)酵過(guò)程中利用磷酸或者氨水控制ph7.2±0.2。

發(fā)酵周期為180±20h，當(dāng)植物甾醇剩余量低于5％時(shí)放罐。

實(shí)施例5發(fā)酵培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿干粉25g/l，黃豆餅粉20g/l，磷酸二氫鉀3g/l，硫酸鎂0.5g/l，硫酸亞鐵0.05g/l，植物甾醇100g/l，乳化劑5g/l，植物油80g/l，泡敵2g/l，ph值8.0。

消毒前先對(duì)底物、油、乳化劑進(jìn)行高溫乳化；乳化后加水和培養(yǎng)基進(jìn)行消毒，消毒溫度為125±2℃；

培養(yǎng)工藝為：溫度30±1℃，罐壓0.04-0.06mpa，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，通氣比為0.3-0.5，發(fā)酵過(guò)程中利用磷酸或者氨水控制ph7.2±0.2。

發(fā)酵周期為180±20h，當(dāng)植物甾醇剩余量低于5％時(shí)放罐。

實(shí)施例6發(fā)酵結(jié)果檢測(cè)(成品提取)

對(duì)實(shí)施例4的發(fā)酵放罐檢測(cè)轉(zhuǎn)化率大于90％，效價(jià)為50g/l；其中，實(shí)施例5的發(fā)酵放罐檢測(cè)轉(zhuǎn)化率大于94％，效價(jià)為55g/l。

將實(shí)例5中得到的發(fā)酵液加堿調(diào)節(jié)ph到9-11，升溫到90℃保溫皂化，然后加入5％的珍珠巖進(jìn)行板框過(guò)濾，得到濾餅。濾餅用50％-70％甲醇水回流萃取3-5遍，萃取液過(guò)濾、脫色、濃縮得到粗品。粗品加入5倍甲醇精制3次得到精品。精品純度大于99％，單個(gè)雜質(zhì)小于0.5％。

盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可進(jìn)行各個(gè)條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利要求的范圍，其包括所述每個(gè)因素的等同替換。