本發(fā)明涉及野生酸棗加工和皂甙類和黃酮類的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種利用野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)皂甙類和黃酮類的方法。

背景技術(shù)：

酸棗[ziziphusjujubamill.var.spinosa(bunge)huexh.f.chow.]為鼠李科棗屬的一種灌木或小喬木，種仁、果肉、葉和根均可入藥，能起到鎮(zhèn)靜安神、斂汗生津、養(yǎng)肝寧心的作用，廣泛分布于我國中、北部地區(qū)，抗逆性強(qiáng)，是一種耐旱、耐寒、耐鹽堿的野生藥用植物，并且具有較高經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值的野生果樹資源。中醫(yī)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，酸棗可以“安五臟，輕身延年”，酸棗仁用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴、是一種廣受人們認(rèn)可的安神藥物。酸棗仁皂苷a、b、b1(jujubosidea、b、b1)較早從酸棗仁的甲醇提取液中分離出的3個中性皂苷。近年，運(yùn)用多種色譜和波譜方法(ir,uv,ms,nmr)分離鑒定出酸棗仁皂苷e、d、h(jujubosidee、d、h)及一種新羽扇豆烷型三萜化合物，命名為羅珠子酸甲酯(alphitolicacidmethylester)。近年酸棗仁生物堿及脂肪酸類成分研究也有新進(jìn)展，如從酸棗仁中分離出環(huán)肽類生物堿jubanine。較早報道的黃酮類為黃酮苷spinosin和zivulgarin。目前對酸棗的研究多集中于果仁部分，并發(fā)現(xiàn)與酸棗仁寧心安神功效發(fā)揮密切相關(guān)的物質(zhì)可能為其所含有的三萜皂苷類、黃酮類及環(huán)肽類生物堿等化學(xué)成分，而對酸棗其他組織的研究報道國內(nèi)外報道均較少。目前僅劉東、高振峰等分別從山西酸棗體內(nèi)分離獲得76株內(nèi)生細(xì)菌和40株內(nèi)生真菌，吳家飛等從南酸棗(choerospondiasaxillaris)中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強(qiáng)的菌株wyg5，有關(guān)酸棗內(nèi)生菌的研究目前尚未見報道。迄今為止，有眾多學(xué)者對酸棗進(jìn)行過一些研究，但主要集中在酸棗仁的化學(xué)成分和藥理藥效方面，而少見關(guān)于酸棗產(chǎn)藥用活性成分內(nèi)生菌的報道，鑒于藥用植物內(nèi)生菌具有潛在的重要應(yīng)用價值，為尋找植物內(nèi)生菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似有效成分。酸棗資源是有限的，人們對它的過度利用已經(jīng)對生態(tài)環(huán)境造成了破壞，利用酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)生與宿主有相同或相似藥用價值的成分，既可以節(jié)約藥材，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，還可以彌補(bǔ)季節(jié)性的缺陷，實現(xiàn)循環(huán)可持續(xù)地生產(chǎn)。

工業(yè)上目前傳統(tǒng)的制備酸棗仁總皂苷的方法主要是提取技術(shù)，主要有熱回流提取法、超聲提取法、高速逆流色譜分離法及酶法提取等，這些方法的主要弊端在于所得酸棗仁總皂苷純度低、提取能耗大、有機(jī)溶劑對環(huán)境污染嚴(yán)重等。從酸棗仁中提取分離總黃酮類物質(zhì)的方法均為萃取法。如：藥材先用石油醚或乙醚索式提取法脫脂后，用甲醇或70％乙醇加熱回流提取，再用乙酸乙脂或正丁醇萃取得總黃酮，目前所使用的技術(shù)中采用萃取法從酸棗仁中提取分離總黃酮類物質(zhì)，不但重現(xiàn)性不好，而且提取物中雜質(zhì)較多，黃酮含量不高。用現(xiàn)有技術(shù)制備獲得的皂甙類和黃酮類工藝復(fù)雜，成本高，如何才能有效地解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，開發(fā)研究出一種具有產(chǎn)業(yè)化前景、生產(chǎn)工藝簡單、經(jīng)濟(jì)效益良好、無二次污染等特點(diǎn)的綠色、環(huán)境友好型的全新皂甙類和黃酮類生產(chǎn)和制備技術(shù)是一個亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供利用野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)皂甙類和黃酮類化合物的方法，該方法采用微生物發(fā)酵方法制備皂甙類和黃酮類，與傳統(tǒng)的通過酸棗等提取的方法相比，工藝簡單，成本低，不發(fā)生結(jié)構(gòu)異化，完整地保持了皂甙類和黃酮類有效成分的原有化學(xué)結(jié)構(gòu)和優(yōu)良藥效；采用野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵法制備皂甙類和黃酮類，微生物培養(yǎng)所用的營養(yǎng)基質(zhì)是工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)物，既可以使廢棄物得到有效利用，又能帶來較大的經(jīng)濟(jì)效益；反應(yīng)快捷、產(chǎn)物污染小、途徑新，目前尚未有利用野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵的方法來制備皂甙類和黃酮類的報道。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種利用野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)皂甙類和黃酮類的方法，包括如下步驟：選取從野生酸棗內(nèi)提取純化的芽孢桿菌(unculturedbacillussp.)，genbank登錄號：ky393358；

步驟(1)菌種活化

將在4℃下保存的所述芽孢桿菌菌株由斜面轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基中，30℃下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～20h；

步驟(2)制備種子液

取上述經(jīng)活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中(裝液量100ml/500ml三角瓶)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，30℃震蕩培養(yǎng)12～20h。

步驟(3)發(fā)酵

將上述種子液按2％～4％(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，控制溫度28～31℃，ph7.0～7.2，保持溶氧飽和度12％以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液。

步驟(4)皂甙類和黃酮類的精制

將(4)中的皂甙類和黃酮類發(fā)酵液組分經(jīng)過離心、過濾、醇沉、萃取、低壓濃縮、層析、結(jié)晶和干燥后得到高純度的皂甙類和黃酮類。

進(jìn)一步的，上述技術(shù)方案中，按照質(zhì)量體積比，所述步驟(1)中培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，1.5％瓊脂，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。

進(jìn)一步的，上述技術(shù)方案中，按照質(zhì)量體積比，所述步驟(2)中培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。

進(jìn)一步的，上述技術(shù)方案中，按照質(zhì)量體積比，所述步驟(3)中培養(yǎng)基的組成為：4％～6％葡萄糖，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。發(fā)酵溫度28～31℃，通氣量0.7-0.9:1(v:v)，攪拌速度180-190r/min，ph7.0～7.2。

進(jìn)一步的，本發(fā)明中，離心、過濾、醇沉、萃取、低壓濃縮、層析、結(jié)晶和干燥屬于現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)產(chǎn)物需要合理選擇；本發(fā)明優(yōu)選將發(fā)酵液收集后，經(jīng)4000r/min高速離心15min，分為菌體和發(fā)酵液兩部分，過濾得到的菌體采用體積分?jǐn)?shù)60％乙醇，210w超聲浸提30min，過濾、收集浸提液，再經(jīng)真空抽濾，合并過濾的發(fā)酵液和浸提液，50℃減壓濃縮，去除乙醇。用乙酸乙酯萃取，濃縮后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取上述乙酸乙酯萃取物，加少許甲醇使之溶解，樣品溶于熱乙醇中，配置濃度為1mg/ml上樣液，并加入5ml氯化鈉。取30ml上樣液以2ml/min的流速通過樹脂層并浸泡樹脂2h，用濃度為95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分別對乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在60℃水浴鍋蒸餾除去溶劑得到固體并烘干至粉末。上硅膠柱(5innerdiameter×130cm)，用體積比為9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脫，并收集洗脫產(chǎn)物再用sephadexlh-20，以甲醇作為流動相洗脫，進(jìn)行進(jìn)一步純化并結(jié)晶。

進(jìn)一步的，本發(fā)明中皂甙類和黃酮類的測定方法：

hplc分析的檢測條件為:黃酮類檢測：色譜柱為kromasilc18(5μm,4.6mm×150mm)；流動相：甲醇：0.2％磷酸＝50:50(v/v)；流速：0.8ml/min；檢測波長：260；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μl；皂苷類檢測：色譜柱為kromasilc18(5μm,4.6mm×150mm)；流動相：乙腈：水＝2:3(v/v)；流速：1ml/min；檢測波長：204；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μl。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明開創(chuàng)了利用酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵方法制備皂甙類和黃酮類的規(guī)模化生產(chǎn)新途徑；本發(fā)明優(yōu)化了皂甙類和黃酮類的分離純化技術(shù)與工藝參數(shù)，建立了一套下游加工方法，此方法具有工藝簡單，成本低，不發(fā)生結(jié)構(gòu)異化，完整地保持了皂甙類和黃酮類有效成分的原有化學(xué)結(jié)構(gòu)和優(yōu)良藥效易于操作等優(yōu)點(diǎn)；同時具有生產(chǎn)周期短，不受氣候和地理環(huán)境條件的限制，易于提取和應(yīng)用面廣等特性，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明利用葡萄糖為原料，通過野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵技術(shù)制備，發(fā)酵液組分簡單，產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，雜質(zhì)少，易于純化，制備得到的皂甙類和黃酮類與皂甙類和黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品一致。

附圖說明

圖1酸棗內(nèi)生菌菌株發(fā)酵液與蘆丁標(biāo)品薄層層析圖譜比較圖。圖中j:為內(nèi)生菌菌株發(fā)酵液；x:蘆丁標(biāo)品；

圖2皂甙類和黃酮類對照品與內(nèi)生菌發(fā)酵液高效液相色譜比較圖。

其中，2-a是黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品；2-b是皂甙a標(biāo)準(zhǔn)品；2-c是內(nèi)生菌發(fā)酵液，其中a為黃酮類物質(zhì)，b為皂甙類物質(zhì)。

圖3為本發(fā)明中菌種的16srdna圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：如圖1-3所示：

實施例1

一種利用野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵生產(chǎn)皂甙類和黃酮類的方法，其步驟如下：選取從野生酸棗內(nèi)提取純化的芽孢桿菌(unculturedbacillussp.)，genbank登錄號：ky393358；其16srdna圖如圖3所示；

(1)菌種活化

將在4℃下保存菌株由斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基中，30℃下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～20h。其中培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，1.5％瓊脂，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。

(2)制備種子液

取上述經(jīng)活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中(裝液量100ml/500ml三角瓶)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，30℃震蕩培養(yǎng)12～20h。其中培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。

(3)發(fā)酵

將上述種子液按2％～4％(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，控制溫度28～31℃，ph7.0～7.2，保持溶氧飽和度12％以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液。其中培養(yǎng)基的組成為：4％～6％葡萄糖，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。發(fā)酵溫度28～31℃，通氣量0.7-0.9:1(v:v)，攪拌速度180-190r/min，ph7.0～7.2。

(4)皂甙類和黃酮類的精制

將發(fā)酵液收集后，經(jīng)4000r/min高速離心15min，分為菌體和發(fā)酵液兩部分，過濾得到的菌體采用體積分?jǐn)?shù)60％乙醇，210w超聲浸提30min，過濾、收集浸提液，再經(jīng)真空抽濾，

合并過濾的發(fā)酵液和浸提液，50℃減壓濃縮，去除乙醇。用乙酸乙酯萃取，濃縮后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取上述乙酸乙酯萃取物，加少許甲醇使之溶解，樣品溶于熱乙醇中，配置濃度為1mg/ml上樣液，并加入5ml氯化鈉。取30ml上樣液以2ml/min的流速通過樹脂層并浸泡樹脂2h，用濃度為95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分別對乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在60℃水浴鍋蒸餾除去溶劑得到固體并烘干至粉末。上硅膠柱(5innerdiameter×130cm)，用體積比為9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脫，并收集洗脫產(chǎn)物再用sephadexlh-20，以甲醇作為流動相洗脫，進(jìn)行進(jìn)一步純化并結(jié)晶。

附圖1薄層層析(tlc)檢測結(jié)果表明，野生酸棗內(nèi)生菌菌株在rf為0.46處有與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品顏色相同，遷移率相當(dāng)?shù)娘@色斑，紫外光下顯黃色熒光，進(jìn)一步確定野生酸棗內(nèi)生菌菌株具有能夠發(fā)酵產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的能力。

實施例2本發(fā)明制備的皂甙類和黃酮類的檢測

(1)菌種活化

將在4℃下保存菌株由斜面轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基中，30℃下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～20h。其中培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，1.5％瓊脂，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。

(2)制備種子液

取上述經(jīng)活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中(裝液量100ml/500ml三角瓶)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，30℃震蕩培養(yǎng)12～20h。其中培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。

(3)發(fā)酵

將上述種子液按2％～4％(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，控制溫度28～31℃，ph7.0～7.2，保持溶氧飽和度12％以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液。其中培養(yǎng)基的組成為：4％～6％葡萄糖，0.06％nh4no3，0.5％kh2po4，0.01％mgso4，其余為水。ph7.0～7.2，115℃滅菌25min。發(fā)酵溫度28～31℃，通氣量0.7-0.9:1(v:v)，攪拌速度180-190r/min，ph7.0～7.2。

(5)皂甙類和黃酮類的精制

將發(fā)酵液收集后，經(jīng)4000r/min高速離心15min，分為菌體和發(fā)酵液兩部分，過濾得到的菌體采用體積分?jǐn)?shù)60％乙醇，210w超聲浸提30min，過濾、收集浸提液，再經(jīng)真空抽濾，

合并過濾的發(fā)酵液和浸提液，50℃減壓濃縮，去除乙醇。用乙酸乙酯萃取，濃縮后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取上述乙酸乙酯萃取物，加少許甲醇使之溶解，樣品溶于熱乙醇中，配置濃度為1mg/ml上樣液，并加入5ml氯化鈉。取30ml上樣液以2ml/min的流速通過樹脂層并浸泡樹脂2h，用濃度為95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分別對乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在60℃水浴鍋蒸餾除去溶劑得到固體并烘干至粉末。上硅膠柱(5innerdiameter×130cm)，用體積比為9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脫，并收集洗脫產(chǎn)物再用sephadexlh-20，以甲醇作為流動相洗脫，進(jìn)行進(jìn)一步純化并結(jié)晶。

附圖2皂甙類和黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品與野生酸棗內(nèi)生菌發(fā)酵液高效液相色譜比較圖。由發(fā)酵產(chǎn)物的hplc圖譜顯示，皂甙類保留時間為rt＝6.732，黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品保留時間rt＝5.015并各有一主要吸收峰，酸棗內(nèi)生菌菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的出峰順序依次為：組分a在保留時間rt＝5.432min，出現(xiàn)新的吸收峰，組分b在保留時間rt＝6.715min處有一主要吸收峰，可以看出，組分a與組分黃酮類的保留時間相近，組分b與組分皂甙類的保留時間相近，由此可以確定野生酸棗內(nèi)生菌菌株發(fā)酵液制備得到的物質(zhì)與皂甙類和黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)一致。

通過分析可以證明本發(fā)明制備的產(chǎn)品為高純度皂甙類和黃酮類。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。