本發(fā)明涉及一種桑葉活性肽，特別是涉及一種桑葉免疫活性肽及其制備方法。

背景技術：

免疫調節(jié)是指免疫系統(tǒng)中的免疫細胞與免疫分子之間、以及免疫系統(tǒng)與其他系統(tǒng)之間相互作用，使機體的免疫應答處于最合適的水平，從而維持生物體內生理動態(tài)平衡。一旦免疫調節(jié)失衡，就會引發(fā)病原微生物感染、免疫缺陷病、腫瘤及超敏反應等不良癥狀。因此尋找具有免疫活性的免疫分子顯得尤為重要。近期研究認為，通過諸如免疫肽、免疫多糖等天然活性物質來提高機體免疫調節(jié)活性是最有希望替代抗生素治療的方法。免疫活性肽是指一類能夠通過增強機體免疫力，增強巨噬細胞吞噬能力從而提高機體抵御外來病原體感染能力的免疫功能肽。免疫活性肽作為小分子物質，能夠完整的被腸道吸收或者在腸道與受體結合來發(fā)揮免疫作用，具有活性強、易吸收、穩(wěn)定性強等獨特的優(yōu)勢。目前免疫肽主要來源于動物、植物、微生物。其中植物蛋白免疫肽因具有來源廣、成本低、活性高等特點而成為研究熱點。目前制備的植物源免疫肽主要有大米肽、米糠肽、綠豆肽等，而葉蛋白免疫肽的研究較少。

桑樹屬桑科桑屬植物，在我國栽培歷史悠久。桑葉是桑樹的葉子，國家衛(wèi)生部將其列為藥食兩用植物。桑葉中含有豐富的蛋白質、生物堿、多糖、黃酮、酚酸等物質，具有較高的營養(yǎng)價值。傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)中桑葉主要用作蠶飼料，易出現(xiàn)過剩、浪費等現(xiàn)象，為了實現(xiàn)資源的最優(yōu)利用，目前對桑葉中的多種成分，如多糖、酚酸、黃酮、生物堿等進行了提取并進行生理活性的分析。如中國專利cn102370707a用乙醇溶液制備桑葉、桑枝提取物，經(jīng)大孔樹脂多次洗脫分離，得到主要成分為dnj、多糖及黃酮的桑葉/桑枝提取物，并將其用于美白及降血糖研究；中國專利cn102771862a用50%~70%的酸性乙醇溶液制備了具抑菌活性的桑葉酚酸提取物；中國專利cn104274534a用超臨界萃取技術制備了全成分桑葉提取物，對其多糖含量進行了分析。目前的專利及研究主要集中在桑葉中酚類、dnj的提取及其在降血糖、美白等藥理活性中的應用，提取溶劑多為有機溶劑，產(chǎn)物溶解性較低。因此，需要對桑葉中更多的化學成分及生理活性進行研究，以期進一步提高桑葉的綜合利用價值。

研究表明，桑葉中蛋白質含量為干基重量的15%~30%，是蛋白含量較高的植物。其氨基酸組成與脫脂大豆粉大體一致，可以用作動物飼料添加劑或食品添加劑。目前有少數(shù)文獻及專利對桑葉蛋白及桑葉肽的提取優(yōu)化進行了分析，而對于桑葉免疫活性肽的制備尚無研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有桑葉活性成分及免疫肽研究存在的不足之處，提供了一種經(jīng)濟高效的桑葉免疫活性肽及其制備方法，所得桑葉肽具有純度高、免疫活性高的特點。

本發(fā)明的目的通過如下方法實現(xiàn)：

一種桑葉免疫活性肽的制備方法，用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶6種蛋白酶單獨酶解或者復合酶解桑葉蛋白，并用deaesepharosefastflow陰離子柱層析、sephadexg-50、g-25或g-15凝膠柱層析及rp-hplc對其進行分離純化制備，得到桑葉免疫活性肽；

包括以下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎后過篩，得桑葉粉；提取桑葉蛋白后，取桑葉蛋白用水溶解，配制成質量濃度為1%-10%的溶液，在95-100℃蛋白變性5min，冷卻后采用加入所述6種蛋白酶中的一種、加入六種酶中的兩種或加入六種蛋白酶中的三種進行酶解，酶解后95-100℃滅酶活10min，冷卻至室溫后，在離心力為5000-10000g條件下離心15-20min，取上清冷凍干燥得到具有免疫活性的桑葉肽粗品；蛋白酶的總添加量為底物質量的1%-5%；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用tris-hcl或者去離子水溶解，并用0.22-0.45μm的濾膜過濾；取10-30ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱層析，用不同濃度的nacl溶液沖洗柱子，收集組分；100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進行免疫活性測定，將活性最高的組分通過sephadexg-50、g-25或g-15凝膠柱層析分離，收集分離的組分進行冷凍干燥，測定免疫活性，收集活性高的組分用rp-hplc進一步分離純化，所得組分冷凍干燥后測定免疫活性，活性最高的組分即為桑葉免疫活性肽。

上述方法中，步驟（1）桑葉蛋白的提取采用水提鹽沉或堿提酸沉法（孫崇臻，等.不同制備方法桑葉蛋白功能性質的比較[j].現(xiàn)代食品科技，2015,31(12),242-249.）。

上述方法中，步驟（1）中，當選用加入六種蛋白酶中的一種時，蛋白酶的酶解條件為：中性蛋白酶37-45℃，ph6.8-7.2，堿性蛋白酶45-55℃，ph7.5-8.5；復合蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解溫度45-55℃，ph6.5-7.5；胰蛋白酶32-40℃，ph7.5-8.5；6種單獨酶解時間均為1-8h，e/s為1-6%；當選用加入六種酶種蛋白酶中的兩種時，酶解條件為：在單獨酶解條件下，各自酶解時間控制在1-4h；當選用加入六種酶種蛋白酶中的三種時，三酶復合酶解滿足：在單酶水解條件下，各自酶解時間控制在0.5-3h。

上述方法中，所述tris-hcl濃度為15-25mm，ph為7.2-8.2。

上述方法中，步驟（2）所述過離子柱的溶液濃度為5-30mg/ml；nacl洗脫液濃度為0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l；洗脫流速1.0-1.5ml/min，8min/管，每個洗脫濃度接收40管。

上述方法中，步驟（2）所述sephadexg-50、g-25或g-15凝膠柱層析的溶液濃度為5-30mg/ml，加樣體積1-5ml，純水洗脫，洗脫流速0.3-0.8ml/min，3-6min/管。

上述方法中，步驟（2）中采用rp-hplc分離純化的條件為：使用c18柱，上樣濃度0.5-20mg/ml，上樣體積0.02-5ml；檢測波長220nm；流動相為a：0.05-0.3%的三氟乙酸（tfa），b：含0.05-0.3%tfa的乙腈；洗脫梯度為：單酶酶解產(chǎn)物：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流動相a；復合酶解產(chǎn)物：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，流速為0.2-20ml/min（可在此基礎上根據(jù)實際情況進行梯度優(yōu)化）。

上述方法中，所述桑葉肽進行免疫活性分析：包括巨噬細胞raw264.7分泌細胞因子no，il-6，tnf-α的能力及胞飲中性紅的能力。

本發(fā)明還提供了一種利用上述方法制備的一種具有免疫活性的桑葉肽。

本發(fā)明以6種蛋白酶單獨酶解或復合酶解制備桑葉免疫活性肽，并用deaesepharosefastflow陰離子柱及sephadexg-50、g-25或者g-15凝膠柱進行分離純化，制備工藝簡單；純化過程溫和，較好的保持了桑葉肽的免疫活性，克服了目前對桑葉提取物化學成分研究相對單一、制備過程復雜、產(chǎn)物溶解性低的缺陷。同時，桑葉免疫活性肽的制備，擴大了桑葉的應用范圍，并提升了其藥食兩用價值。

本發(fā)明制備的桑葉肽具有極強的溶解性及良好的免疫活性，可以作為天然免疫調節(jié)劑，很好的用于食品及藥品行業(yè)。

相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果：

1）本發(fā)明制備了桑葉免疫活性肽，極大的豐富了桑葉有效成分的研究范圍，強化了其應用價值。

2）本發(fā)明提供了一種簡便可行的桑葉免疫活性肽的制備方法。

3）本發(fā)明制備的免疫活性肽具有極強的溶解性、良好的免疫活性。

4）本發(fā)明制備過程未涉及任何有機溶劑，操作條件溫和，最大程度的保留了桑葉肽的免疫活性，保證了產(chǎn)品的安全性。

5）本發(fā)明的制備過程操作簡便，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1a為deaesepharoseff陰離子柱層析圖；圖1b為各離子組分中性紅胞飲率測定結果；

圖2asephadexg-25凝膠柱層析圖；圖2b各分離組分中性紅胞飲率；

圖3為rp-hplc液相圖譜；

圖4a~圖4d為桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細胞raw264.7分泌no(a)、il-6(b)、tnf-α(c)及胞飲中性紅的影響（d）；

圖5a~圖5d為桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細胞raw264.7分泌tnf-α(a)、no(b)、il-6(c)及胞飲中性紅的影響（d）。

具體實施方式

為了更好的理解本發(fā)明，以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但需要說明的是，實施例并不構成對本發(fā)明保護范圍的限制。

實施例1

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（中性蛋白酶酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎后過篩，得桑葉粉；取30g桑葉粉加600ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細胞粉碎15min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達到65%飽和度。離心（離心力8000g，4℃，20min）取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質量濃度為1%的溶液，95℃加熱5min。冷卻后調ph7.0，加入1%的中性蛋白酶（諾維信，neutrase0.8l），45℃酶解2h后，95℃滅酶活10min。冷卻至室溫，8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用tris-hcl（20mm，ph7.8）水溶解，配制10mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取15ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.0ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進行收集（8min/管）。共得到d1-d7七個組分，將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進行免疫活性測定（結果見圖1a和圖1b）。圖1adeaesepharoseff陰離子柱層析圖；圖2b為各離子組分中性紅胞飲率測定結果。其中a-f:不同字母代表各組分中性紅胞飲率具有顯著差異，p<0.05。

由圖1a可知，桑葉免疫活性粗肽經(jīng)過deaesepharoseff陰離子柱分離后得到7個不同的組分。由圖1b可知，7個組分的中性紅胞飲率均顯著優(yōu)于空白組，說明離子分離后得到的不同組分均有免疫活性，其中d4、d5的免疫活性最高，顯著優(yōu)于其他組分，d3次之。綜合考慮產(chǎn)品得率及免疫活性，因此選擇得率高活性高的d5進一步純化。

將組分d5用水配成濃度5mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取2ml加入到sephadexg-25凝膠柱中進行層析分離。流速0.3ml/min，5min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值，繪制洗脫曲線（圖2a）并測定中性紅胞飲率（圖2b）。圖2a-圖2b為sephadexg-25凝膠柱層析圖（a）及各分離組分中性紅胞飲率（b）。a-d:不同字母代表各組分中性紅胞飲率具有顯著差異，p<0.05。由圖2-a可知，d5經(jīng)過sephadexg-25凝膠柱分離后，得到s1、s2兩個組分。由圖2-b得知，s1、s2的中性紅胞飲率均顯著高于空白組，其中s1的吞噬率最高，且顯著優(yōu)于lps組。選擇s1組分進一步純化。

選擇s1進行rp-hplc液相純化。將s1用超純水配制成濃度為1mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用日本島津液相色譜儀進行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（300sb-c18，5μm,9.4×250mm）中，以0.05%的tfa（a）及含0.05%tfa的乙腈（b）為流動相進行梯度洗脫。洗脫梯度：0-9-10-30-31-35min，90-90-65-50-90-90%的流動相a。使用紫外檢測器進行檢測，檢測波長220nm，流速1ml/min。由圖3可知，s1經(jīng)過rp-hplc分離后，在1-10min出現(xiàn)兩個溶劑峰，17.954min得到1個組分，說明制備的桑葉免疫活性肽具有較高純度。

對本發(fā)明實施例制備純化的桑葉肽進行免疫活性測定：將桑葉免疫肽用dmem培養(yǎng)基溶解稀釋，配制濃度為5~150μg/ml的溶液，進行小鼠巨噬細胞raw264.7分泌no、il-6、tnf-α及胞飲中性紅的測定，結果如圖4所示。圖4桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細胞raw264.7分泌no(a)、il-6(b)、tnf-α(c)及胞飲中性紅的影響（d）。**:代表不同濃度桑葉肽及脂多糖（lps）與對照組具有極顯著差異，p<0.01。

當機體受到病原體感染時，巨噬細胞首先產(chǎn)生吞噬作用，然后通過分泌no或者產(chǎn)生ros來殺死病原體。il-6,tnf-α等細胞因子也會被同時分泌參與炎癥反應。這些免疫應答的刺激調節(jié)可以增強機體對抗外源病原體的威脅，從而發(fā)揮免疫作用。由圖4a~圖4d可知，經(jīng)過本發(fā)明實施例制備的桑葉免疫活性肽處理后，小鼠巨噬細胞no（a）、il-6(b)、tnf-α(c)的表達量均顯著升高。同時，在5-100μg/ml的范圍內，三個細胞因子的表達量隨著濃度的升高而增加。其中，桑葉免疫活性肽對il-6的激活表達最為顯著，經(jīng)過100μg/ml活性肽處理后的raw264.7的il-6表達水平是陰性對照組的500倍左右（圖4-b）。與細胞因子分泌表達結果相似，不同濃度的桑葉活性肽中性紅胞飲率均顯著優(yōu)于陰性對照組，具有顯著的胞飲效果。綜上，本發(fā)明實施例制備的桑葉肽具有很強的免疫調節(jié)活性，是一種具有較高應用價值的免疫活性肽。

實施例2

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（堿性蛋白酶與中性蛋白酶復合酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎后過篩，得桑葉粉；取30g桑葉粉加900ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細胞粉碎20min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達到65%飽和度。離心（8000g，4℃，20min）取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質量濃度為5%的溶液，95℃加熱5min。冷卻后調ph7.2，加入2%的中性蛋白酶（諾維信，neutrase0.8l），45℃酶解1h后，95℃滅酶活15min。冷卻至55℃，調ph8.0，加入1%的堿性蛋白酶（諾維信3701，alcalase3.0t）酶解3h，95℃滅酶活10min后，8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用水溶解，配制15mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取25ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.5ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進行收集（8min/管），將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進行免疫活性測定。取免疫活性最高的離子組分用水配制濃度10mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取1ml加入到sephadexg-15凝膠柱中進行層析分離。流速0.5ml/min，3min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值及其免疫活性。

選擇免疫活性高的凝膠組分進行rp-hplc液相純化。用超純水配制成濃度為10mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用waters液相色譜儀進行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（sunfireprepc18，5μm,19x250mm）中，以0.1%的tfa（a）及含0.1%tfa的乙腈（b）為流動相進行梯度洗脫。洗脫梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，使用pad檢測器進行檢測，檢測波長220nm，流速10ml/min。

對實施例2制備純化的桑葉肽進行免疫活性測定：將桑葉免疫肽用dmem培養(yǎng)基溶解稀釋，配制濃度為5~150μg/ml的溶液，進行小鼠巨噬細胞raw264.7分泌no、il-6、tnf-α及胞飲中性紅的測定，結果如圖5a~圖5d所示。圖5a~圖5d為桑葉免疫活性肽對小鼠巨噬細胞raw264.7分泌tnf-α(a)、no(b)、il-6(c)及胞飲中性紅的影響（d）。**:代表與對照組存在極顯著差異，p<0.01。由圖5可知，實施例2制備的桑葉肽在5-150μg/ml范圍內，能夠極顯著的提高no、il-6、tnf-α的表達量，同時顯著提高了中性紅胞飲率，因此具有較強的免疫活性。

實施例3

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（復合蛋白酶、木瓜蛋白酶復合酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎過篩得桑葉粉；取30g桑葉粉加500ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細胞粉碎15min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達到65%飽和度。8000g離心20min，取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質量濃度為4%的溶液，95℃加熱5min。冷卻后調ph7.0，加入2%的復合蛋白酶（丹麥諾維信，protamex），50℃酶解2h后，95℃滅酶活5min。冷卻至50℃，調ph7.0，加入2%的木瓜蛋白酶（上海阿拉丁，p123425）酶解1h，95℃滅酶活5min。冷卻后8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品；

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用水溶解，配制15mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取20ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.5ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進行收集（8min/管），將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進行免疫活性測定。取免疫活性最高的離子組分用水配制濃度10mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取2ml加入到sephadexg-25凝膠柱中進行層析分離。流速0.5ml/min，5min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值及其免疫活性。

選擇免疫活性高的凝膠組分進行rp-hplc液相純化。用超純水配制成濃度為20mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用waters液相色譜儀進行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（sunfireprepc18，5μm,19x250mm）中，以0.1%的tfa（a）及含0.1%tfa的乙腈（b）為流動相進行梯度洗脫。洗脫梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，使用pad檢測器進行檢測，檢測波長220nm，流速15ml/min。對分離的組分進行免疫活性測定，得到活性最高的組分即為桑葉免疫活性肽。

實施例4

一種桑葉免疫活性肽的制備方法（復合蛋白酶、胰蛋白酶與風味蛋白酶復合酶解），包括如下步驟：

（1）桑葉免疫活性肽粗品制備：新鮮桑葉洗凈晾干，粉碎過篩得桑葉粉；取30g桑葉粉加300ml蒸餾水混勻，溶解后超聲細胞粉碎15min，室溫提取2h后離心（8000g，4℃，20min），上清液加入固體硫酸銨，達到65%飽和度。8000g離心20min，取沉淀，透析脫鹽后冷凍干燥得到桑葉蛋白。取5g桑葉蛋白用水溶解，配制質量濃度為3%的溶液，95℃加熱8min。冷卻后調ph7.5，加入2%的復合蛋白酶（諾維信，protamex），50℃酶解1h后，95℃滅酶活5min。冷卻至37℃，調ph8.0，加入1%的胰蛋白酶（上海阿拉丁，t105532）酶解1h，95℃滅酶活5min。冷卻至45℃，調ph7.0，加入1%的風味蛋白酶（諾維信，flavourzyme500lapu/g）酶解0.5h，95℃滅酶活5min后，8000g離心15min，取上清冷凍干燥，得到桑葉免疫活性肽粗品。

（2）桑葉免疫活性肽的分離純化：

將（1）中桑葉免疫活性肽粗品用水溶解，配制25mg/ml的溶液，并用0.22μm的濾膜過濾。取15ml濾液通過deaesepharosefastflow陰離子柱，分別用0、0.05、0.15、0.3、0.5、0.75及1mol/l的nacl溶液以1.2ml/min速度沖洗柱子，用自動收集器進行收集（8min/管），將收集組分通過100da透析袋透析脫鹽，冷凍干燥后用水溶解，進行免疫活性測定。取免疫活性最高的離子組分用水配制濃度20mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾后，取1ml加入到sephadexg-25凝膠柱中進行層析分離。流速0.3ml/min，5min/管收集樣品，220nm測定洗脫組分吸光值及其免疫活性。

選擇免疫活性高的凝膠組分進行rp-hplc液相純化。用超純水配制成濃度為20mg/ml的溶液，用0.22μm的濾膜過濾。使用waters液相色譜儀進行分析。將樣品溶液注入反相制備柱（sunfireprepc18，5μm,19x250mm）中，以0.05%的tfa（a）及含0.05%tfa的乙腈（b）為流動相進行梯度洗脫。洗脫梯度：0-10-15-20-25min，100-50-20-100-100流動相a，使用pad檢測器進行檢測，檢測波長220nm，流速5ml/min。對分離的組分進行免疫活性測定，得到活性最高的組分即為桑葉免疫活性肽。

本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。