專利名稱：一種提取純化4-雄烯二酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，涉及一種從植物留醇發(fā)酵液中提取純化4-雄烯二酮(4-AD)的方法。
背景技術(shù)：
4-雄烯二酮(AndrostenedioneJ-AD)是甾體類激素藥物的重要中間體，可用于生產(chǎn)性激素、孕激素、蛋白同化激素等100余種藥物。微生物轉(zhuǎn)化留醇產(chǎn)生4-AD的發(fā)酵系統(tǒng)很多，其中分枝桿菌油水兩相發(fā)酵系統(tǒng)可高效降解植物留醇側(cè)鏈產(chǎn)生4-AD，并具有較高的甾醇加入量和較低的底物及產(chǎn)物抑制性等優(yōu)點(diǎn)。但微生物發(fā)酵系統(tǒng)目前普遍存在目標(biāo)產(chǎn)物4-AD難于提取分離的問題，4-AD的純度較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何提取并純化得到高純度4-AD。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種提取純化4-雄烯二酮的方法。本發(fā)明的植物留醇發(fā)酵液的來源可以為采用本領(lǐng)域常用菌種對(duì)植物留醇進(jìn)行常規(guī)發(fā)酵后所得的發(fā)酵液，例如采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發(fā)酵植物甾醇原料，得到植物留醇發(fā)酵液。本發(fā)明提取純化4-雄烯二酮的方法為采用乙酸乙酯溶解植物留醇發(fā)酵液的油相以去除菌體，經(jīng)減壓蒸餾后用甲醇萃取，經(jīng)脫色重結(jié)晶后得到4-雄烯二酮純品。具體地，該方法包括如下步驟1)取植物留醇發(fā)酵液加熱，加入中性鹽使分層，收集上層，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上層，加熱減壓蒸餾，得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上層，加熱減壓濃縮，降溫結(jié)晶，得4-雄烯二酮粗品；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加熱溶解，加水?dāng)嚢?，靜置分層，取乙酸乙
酯層，降溫結(jié)晶；5)向步驟4)所得結(jié)晶中加入甲醇溶解，脫色，結(jié)晶，得到4-雄烯二酮純品。其中步驟1)所述加熱的溫度為70-90°C，優(yōu)選78-85°C，更優(yōu)選80°C ；所述中性鹽選自氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉或硫酸鉀等，優(yōu)選氯化鈉，中性鹽的加入量為植物留醇發(fā)酵液的 l-5w/v %，優(yōu)選 2-4w/v %，更優(yōu)選 3w/v % ；步驟2)所述乙酸乙酯的加入體積為所述第一油相體積的1-5倍，優(yōu)選2-4倍，更優(yōu)選3倍；所述加熱的溫度為50-70°C，優(yōu)選58-62°C，更優(yōu)選60°C ；步驟3)所述甲醇的加入體積為所述第二油相體積的1-5倍，優(yōu)選2-3倍；所述濃縮為濃縮至甲醇體積的1/8-1/5，優(yōu)選1/7-1/6 ；所述加熱的溫度為50-70°C，優(yōu)選58-62°C， 更優(yōu)選60°C ；所述降溫為降至15-35°C，優(yōu)選20-30°C，更優(yōu)選25°C ；
步驟4)所述乙酸乙酯的加入量為4-雄烯二酮粗品的3-6倍，優(yōu)選4-6倍，更優(yōu)選 5倍；所述水的加入量為4-雄烯二酮粗品的1-4倍，優(yōu)選1-3倍，更優(yōu)選2倍；所述加熱溫度為55-70°C，優(yōu)選60-65°C，更優(yōu)選62°C ；所述降溫為降至15_35°C，優(yōu)選20_30°C，更優(yōu)選 25 0C ；步驟5)中，將步驟4)所得結(jié)晶用甲醇溶解后加熱至55-70°C，優(yōu)選60_65°C，更優(yōu)選62°C ；采用活性炭進(jìn)行脫色，脫色后的溶液在50-70°C、優(yōu)選58-62°C減壓濃縮至甲醇體積的1/3-2/3、優(yōu)選濃縮至1/2 ；然后降溫至3-10°C、優(yōu)選4-8°C結(jié)晶，更優(yōu)選5°C結(jié)晶；離心，得到4-雄烯二酮純品；步驟5)中，所述甲醇的加入量為4-雄烯二酮粗品的6-12倍，優(yōu)選8_12倍，所述活性炭的加入量為4-雄烯二酮粗品的0. 2-0. 6w/w%,優(yōu)選0. 4-0. 6w/w%。在一個(gè)實(shí)施方案中，提取純化4-雄烯二酮的方法包括如下步驟1)將植物留醇發(fā)酵液加熱至80°C，加入3w/v%的氯化鈉，攪拌溶解30min，靜置分層后，使發(fā)酵液中的水相與油相分離，收集上層，得到第一油相(含大量4-AD、菌體、留醇及雜質(zhì))，備用；2)將上述得到的第一油相按1 3 (ν/ν)加入乙酸乙酯，攪拌，靜置分層，收集上層乙酸乙酯相(下層為菌體及少量水)；將上述得到的乙酸乙酯相在60°C減壓蒸餾，得到第二油相(含4-AD、留醇及少量雜質(zhì))，蒸出的乙酸乙酯可回收利用；3)將上述得到的第二油相按1 2(v/v)加入甲醇，常溫下經(jīng)萃取塔萃取，得到上層輕相和下層重相，輕相為甲醇相，重相經(jīng)60°C減壓蒸餾后得到澄清油(主要為植物油脂， 發(fā)酵時(shí)的原料，可重復(fù)利用發(fā)酵)；將上層甲醇相在60°C減壓濃縮，濃縮至原甲醇相體積的 1/6 ；將濃縮后的溶液進(jìn)行降溫結(jié)晶，降溫至室溫，離心，加少量甲醇洗滌，得到4-AD粗品；4)將上述得到的4-AD粗品按1 5 (v/m)加入乙酸乙酯，攪拌，加熱至60°C完全溶解，按1 2(v/m)加水洗滌除雜，靜置30min分層，分去水相后，將乙酸乙酯層降溫結(jié)晶， 降溫至室溫，離心，加入少量乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD結(jié)晶；5)將上述得到的初精制4-AD結(jié)晶按前述4_AD粗品1 10 (v/m)的比例加入甲醇溶解，加熱至62°C加入活性炭脫色，活性炭加量為前述4-AD粗品的0. 5% (m/m)，脫色 30min后，抽濾，濾液在60°C減壓濃縮至原體積的1/2，降溫至5°C結(jié)晶，離心，加少量甲醇洗滌后得到精制4-AD純品；將4-AD純品在45°C鼓風(fēng)干燥8h，每一小時(shí)翻一次盤。本發(fā)明的方法采用乙酸乙酯溶解植物留醇發(fā)酵液的油相以去除菌體，經(jīng)減壓蒸餾后用甲醇萃取，經(jīng)脫色重結(jié)晶后得到4-雄烯二酮純品。與化學(xué)合成法相比，該方法至少具有工藝簡單、反應(yīng)條件溫和、所需生產(chǎn)設(shè)備少，且提取收率高和產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)之一，所用提取試劑乙酸乙酯、甲醇等經(jīng)回收后，可循環(huán)使用，回收油也可重復(fù)利用，減少廢棄物排放，對(duì)環(huán)境污染小，符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展方向，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。所生產(chǎn)的4-雄烯二酮作為重要原料藥，社會(huì)需求量巨大，經(jīng)濟(jì)效益十分明顯。具體實(shí)施方法以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發(fā)酵植物甾醇原料，得到植物甾醇發(fā)酵液(4-AD含量0. 76 %，留醇含量0.27%，總糖含量1.37%，還原糖含量0. 54 %，氨基氮含量0. 34%,溶磷63mg/L)。1.取50L植物留醇發(fā)酵液，加熱至80°C，加入1.5kg氯化鈉，攪拌溶解30min，靜置2h分層后，分去下層水相，收集上層油相①15L(4-AD含量2. 48%，留醇含量0. 86% )待用。2.將上述得到的15L油相①加入45L乙酸乙酯，攪拌lh，靜置2h后分層，收集上層乙酸乙酯相(4-AD含量0.82%，留醇含量0.28% )；將上述得到的乙酸乙酯相60°C減壓蒸餾，得到油相②12L(4-AD含量3. 04%，留醇含量1. 03% )。3.將上述得到的油相②加入25L甲醇常溫下經(jīng)萃取塔萃取，得到輕相和重相，輕相為甲醇相26L(4-AD含量1. 49%，留醇含量0. 12% )，重相經(jīng)60°C減壓蒸餾后得到澄清油可重復(fù)利用；將上述得到的26L甲醇相60°C減壓濃縮，濃縮至4L。將濃縮后的甲醇溶液進(jìn)行降溫結(jié)晶，降溫至250C，離心，加IOOmL甲醇洗滌，得到350g 4-AD粗品(4-AD含量63%， 甾醇含量7. 64%)。4.將上述得到的350g 4-AD粗品加入1. 8L乙酸乙酯，攪拌，加熱至60°C完全溶解粗品后，加700mL水洗雜，攪拌30mim，靜置30min分層，分去水相后，乙酸乙酯相降溫結(jié)晶， 降溫至室溫，離心，加入50mL乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD 245g(4_AD含量87. 5%，甾醇含量 3. 02% )。5.將上述得到的初精制4-AD加入3. 5L甲醇溶解后加熱至62°C加入1. 75g活性炭脫色，脫色30min后，抽濾，甲醇溶液60°C減壓濃縮至1. 5L，降溫至5°C結(jié)晶，離心，加50mL 甲醇洗滌后在45°C鼓風(fēng)干燥8h，每一小時(shí)翻一次盤。得到精制4-AD 150g(4-AD含量99%， 甾醇未檢出)。實(shí)施例2采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發(fā)酵植物甾醇原料，得到植物甾醇發(fā)酵液(4-AD含量1. 26 %，留醇含量0. 43 %，總糖含量1.27%，還原糖含量0. 47 %，氨基氮含量0.31%，溶磷57mg/L)。1.取500L植物留醇發(fā)酵液，加熱至85°C，加入18kg氯化鉀，攪拌溶解30min，靜置 2h分層后，分去下層水相，收集上層油相①200L(4-AD含量3. 13%，留醇含量1. 05% )待用。2.將上述得到的200L油相①加入800L乙酸乙酯，攪拌lh，靜置2h后分層，收集上層乙酸乙酯相(4-AD含量1.02%，留醇含量0.34%)；將上述得到的乙酸乙酯相62°C減壓蒸餾，得到油相②190L(4-AD含量3. 28%，甾醇含量0. 95% )03.將上述得到的油相②加入400L甲醇常溫下經(jīng)萃取塔萃取，得到輕相和重相，輕相為甲醇相400L(4-AD含量1. 55%，留醇含量0. 09% )，重相經(jīng)60°C減壓蒸餾后得到澄清油可重復(fù)利用；將上述得到的400L甲醇相62°C減壓濃縮，濃縮至65L。將濃縮后的甲醇溶液進(jìn)行降溫結(jié)晶，降溫至30°C，離心，加1.5L甲醇洗滌，得到6. 25kg 4-AD粗品(4-AD含量 65%，甾醇含量5.5% )。4.將上述得到的6. 25kg 4-AD粗品加入32L乙酸乙酯，攪拌，加熱至65°C完全溶解粗品后，加1.3L水洗雜，攪拌30mim，靜置30min分層，分去水相后，乙酸乙酯相降溫結(jié)晶， 降溫至室溫，離心，加入800mL乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD 4. lkg(4_AD含量87. 5%，甾醇含量2. 11% )0
5.將上述得到的初精制4-AD加入63L甲醇溶解后加熱至65°C加入313g活性炭脫色，脫色30min后，抽濾，甲醇溶液62°C減壓濃縮至30L，降溫至8°C結(jié)晶，離心，加500mL甲醇洗滌后在45°C鼓風(fēng)干燥8h，每一小時(shí)翻一次盤。得到精制4-AD 2. 5kg(4_AD含量99. 1%, 甾醇未檢出)。實(shí)施例3采用分枝桿菌(Mycobacterium Smegmatis)直接發(fā)酵植物甾醇原料，得到植物甾醇發(fā)酵液(4-AD含量1. 04%，留醇含量0. 36 %，總糖含量1.18%，還原糖含量0. 41 %，氨基氮含量0. 36 %，溶磷48mg/L)。1.取200L植物留醇發(fā)酵液，加熱至78°C，加入6. 8kg硫酸鈉，攪拌溶解30min，靜置2h分層后，分去下層水相，收集上層油相①70L(4-AD含量2. 94%，留醇含量0. 97% )待用。2.將上述得到的70L油相①加入240L乙酸乙酯，攪拌lh，靜置2h后分層，收集上層乙酸乙酯相(4-AD含量0.72%，留醇含量0.34%)；將上述得到的乙酸乙酯相58°C減壓蒸餾，得到油相②53L(4-AD含量3. 26%，留醇含量1. 17%).3.將上述得到的油相②加入93L甲醇常溫下經(jīng)萃取塔萃取，得到輕相和重相，輕相為甲醇相115L(4-AD含量1. 54%，留醇含量0. 16% )，重相經(jīng)60°C減壓蒸餾后得到澄清油可重復(fù)利用；將上述得到的115L甲醇相58°C減壓濃縮，濃縮至15L。將濃縮后的甲醇溶液進(jìn)行降溫結(jié)晶，降溫至20°C，離心，加IOOmL甲醇洗滌，得到1.9kg 4-AD粗品(4-AD含量 68%，甾醇含量6.41% )。4.將上述得到的1. 9kg 4-AD粗品加入8. IL乙酸乙酯，攪拌，加熱至60°C完全溶解粗品后，加2. 5L水洗雜，攪拌30mim，靜置30min分層，分去水相后，乙酸乙酯相降溫結(jié)晶， 降溫至室溫，離心，加入150mL乙酸乙酯洗滌，得到初精制4-AD 1. 05kg(4-AD含量88. 1%， 甾醇含量2. 65% )05.將上述得到的初精制4-AD加入12. 8L甲醇溶解后加熱至60°C加入3. 95g活性炭脫色，脫色30min后，抽濾，甲醇溶液58°C減壓濃縮至3. 8L，降溫至4°C結(jié)晶，離心，加 50mL甲醇洗滌后在45°C鼓風(fēng)干燥8h，每一小時(shí)翻一次盤。得到精制4_AD 780g(4_AD含量 99%，甾醇未檢出)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種從植物留醇發(fā)酵液中提取純化4-雄烯二酮的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)取植物留醇發(fā)酵液加熱，加入中性鹽使分層，收集上層，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上層，加熱減壓蒸餾，得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上層，加熱減壓濃縮，降溫結(jié)晶，得4-雄烯二酮粗Pm ；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加熱溶解，加水?dāng)嚢?，靜置分層，取乙酸乙酯層，降溫結(jié)晶；5)向步驟4)所得結(jié)晶中加入甲醇溶解，脫色，結(jié)晶，得到4-雄烯二酮純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述加熱的溫度為70-90°C，優(yōu)選 78-85 "C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述中性鹽選自氯化鈉、氯化鉀、 硫酸鈉或硫酸鉀，其加入量為植物留醇發(fā)酵液的l-5w/v%，優(yōu)選2-4w/v%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述乙酸乙酯的加入體積為所述第一油相體積的1-5倍，優(yōu)選2-4倍；所述加熱的溫度為50-70°C，優(yōu)選58_62°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述甲醇的加入體積為所述第二油相體積的1-5倍，優(yōu)選2-3倍；所述濃縮為濃縮至甲醇體積的1/8-1/5，優(yōu)選1/7-1/6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述加熱的溫度為50-70°C，優(yōu)選 58-620C ；所述降溫為降至15-35°C，優(yōu)選20_30°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述乙酸乙酯的加入量為4-雄烯二酮粗品的3-6倍，優(yōu)選4-6倍，所述水的加入量為4-雄烯二酮粗品的1-4倍，優(yōu)選1-3 倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述加熱溫度為55-70°C，優(yōu)選 60-65°C，所述降溫為降至15-35°C，優(yōu)選20_30°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中將步驟4)所得結(jié)晶用甲醇溶解后加熱至55-70°C，優(yōu)選60-65°C ；采用活性炭進(jìn)行脫色，脫色后的溶液在50-70°C減壓濃縮至甲醇體積的1/3-2/3，降溫至3-10°C結(jié)晶，離心，得到4-雄烯二酮純品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述甲醇的加入量為4-雄烯二酮粗品的6-12倍，優(yōu)選8-12倍；所述活性炭的加入量為4-雄烯二酮粗品的0. 2-0.，優(yōu)選 0. 4-0. 6w/w%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從植物甾醇發(fā)酵液中提取純化4-雄烯二酮的方法。該方法采用乙酸乙酯溶解植物甾醇發(fā)酵液的油相以去除菌體，經(jīng)減壓蒸餾后用甲醇萃取，經(jīng)脫色重結(jié)晶后得到4-雄烯二酮純品。該方法具有提取率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)，回收的油可重復(fù)利用，對(duì)環(huán)境污染小，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07J1/00GK102432657SQ20111034489
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者張雪鋒, 李倩, 李榮杰 申請(qǐng)人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司