本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及化合物在制備西他列汀中的用途及制備西他列汀的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是由于胰島素分泌改變，導(dǎo)致胰島素缺乏及作用減弱，或者胰島素活性降低，或者在兩者共同影響下，出現(xiàn)的代謝性疾病，以高血糖為特征，并同時(shí)伴有蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝紊亂。糖尿病及其并發(fā)癥對人類健康的危害程度居心血管疾病、腫瘤之后的第三位，成為危害人類健康的重要疾病。國際糖尿病聯(lián)合會預(yù)計(jì)，到2030年，患病總?cè)藬?shù)將超過4.35億人。而我國已成為世界糖尿病患病率增長速度最快的國家之一，目前約有4000萬糖尿病患者，人數(shù)僅次于印度，居世界第二位。在糖尿病的四種類型中，ii型糖尿病占90％以上，多見于30歲以上的中老年人，病因主要是由于機(jī)體對胰島素不敏感。
西他列汀磷酸鹽(sitagliptinphosphate)是2006年fda批準(zhǔn)上市的第一個(gè)二肽基肽酶-iv(dpp-4)抑制劑，用于治療ii型糖尿病，其單用或與二甲雙胍、吡格列酮合用都有明顯的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反應(yīng)少。它主要通過抑制dpp-4對胰高血糖素樣肽-1(glp-1)和糖依賴性胰島素釋放肽(gip)的降解以達(dá)到治療的目的，輕度增加glp-1的含量并減弱glp-1代謝物的拮抗作用，所以在有效發(fā)揮降糖作用的同時(shí)不會引起因glp-1含量過高而引起的惡心嘔吐等副作用；同時(shí)，gip促進(jìn)胰島素分泌具有血糖依賴性，故能大大降低口服降糖藥導(dǎo)致的低血糖副作用的發(fā)生率。西他列汀磷酸鹽由默克公司開發(fā)，于2006年8月及10月分別被墨西哥衛(wèi)生部及美國fda批準(zhǔn)為治療ii型糖尿病的藥物，商品名為捷諾維(januvia)，目前已經(jīng)在全世界60多個(gè)國家批準(zhǔn)使用，2012年銷售額已達(dá)40.86億美元，同比增長23％。因此，西他列汀是屬于國際最新且附加值極高的“重磅炸彈”。
然而，西他列汀的合成方法仍有待進(jìn)一步改進(jìn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明是基于發(fā)明人對以下問題和事實(shí)的發(fā)現(xiàn)而提出的：
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，西他列汀合成中的關(guān)鍵步驟是手性氨基中間體的構(gòu)建，而現(xiàn)有的利用轉(zhuǎn)氨酶獲得手性氨基中間體的方法中，底物水溶性不高，手性氨基中間體的時(shí)空產(chǎn)率不高，進(jìn)而西他列汀的時(shí)空產(chǎn)率也低下。
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出了一種時(shí)空產(chǎn)率高的制備西他列汀的方法。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了式i所示化合物或式i所示化合物的立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、氮氧化物、水合物、溶劑化物、代謝產(chǎn)物、藥學(xué)上可接受的鹽或前藥在制備西他列汀中的用途，
其中，r1為含羥基的取代基。式i所示化合物或式i所示化合物的立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、氮氧化物、水合物、溶劑化物、代謝產(chǎn)物、藥學(xué)上可接受的鹽或前藥水溶性高，利用其獲得手性氨基中間體進(jìn)而獲得西他列汀，相比于現(xiàn)有技術(shù)，氨基轉(zhuǎn)化率大幅提高，西他列汀的產(chǎn)率也大幅提高。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述用途還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述r1為羥烷基。羥烷基的空間結(jié)構(gòu)簡單，易于轉(zhuǎn)氨酶對底物-式i所示化合物進(jìn)行催化反應(yīng)，并且當(dāng)r1為羥烷基時(shí)，式i所示化合物的水溶性進(jìn)一步提高，進(jìn)而西他列汀的產(chǎn)率進(jìn)一步提高。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述r1為羥乙基、羥丙基或羥丁基。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)r1為羥乙基、羥丙基或羥丁基時(shí)，式i所示化合物在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基轉(zhuǎn)化效率在97％以上，進(jìn)而西他列汀的產(chǎn)率顯著提高。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備式ii所示化合物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：使式i所示化合物與異丙胺進(jìn)行接觸，所述接觸是在轉(zhuǎn)氨酶的催化下進(jìn)行的，其中，所述轉(zhuǎn)氨酶是由seqidno：1所示的核苷酸序列編碼的，
其中，r1為含羥基的取代基，任選地，所述r1為羥烷基，任選地，所述r1為羥乙基、羥丙基或羥丁基。
atggcattctcagcagacacgccggaaattgtttacacccacgatacgggcctggactacattacctacagcgactacgaactggacccggcaaacccgctggctggcggtgcagcatggattgagggtgcgtttgtgccgccgagtgaagcccgtatttccatctttgatcagggtttctatacgtctgacgcaacctacaccacgtttcatgtttggaacggtaatgctttccgtctgggcgaccacattgaacgcctgttcagcaatgcagaatctattcgcctgatcccgccgctgacgcaagatgaagtcaaagaaatcgcgctggaactggtggccaagaccgaactgcgtgaagccatggtcaccgtgacgattacccgcggctatagctctacgccgtttgaacgtgatatcaccaaacatcgcccgcaggtgtatatgagtgcgtgcccgtaccaatggattgttccgttcgatcgtatccgcgacggtgtgcacctgatggttgcacagagcgtccgtcgcaccccgcgtagttccattgatccgcaggtgaagaactttcaatggggcgacctgattcgtgcaatccaagaaacccatgatcgcggtttcgaactgccgctgctgctggattgtgacaacctgctggctgaaggtccgggctttaatgtggttgtcatcaaagatggtgtggttcgtagcccgggtcgtgcagctctgccgggtattacgcgcaagaccgttctggaaatcgcggaatctctgggccacgaagcgattctggccgatatcacgccggcagaactgtacgatgctgacgaagttctgggttgctcaaccggcggtggcgtctggccgttcgtttcggtcgatggtaattcaatttcggacggtgtgccgggtccggttacccagagcattatccgtcgttactgggaactgaatgtggaaccgtcgtcgctgctgaccccggtgcaatactga(seqidno：1)。
式ii所示化合物是制備西他列汀的過程中，產(chǎn)生的西他列汀中間體。本發(fā)明實(shí)施例所述提出的制備西他列汀中間的方法，轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨效率顯著提高，西他列汀中間體的產(chǎn)率顯著提高。
在本方面的第三方面，本發(fā)明提出了一種制備西他列汀的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：(1)式i所示化合物與異丙胺進(jìn)行接觸，以便獲得式ii所示化合物；(2)式ii所示的化合物與氫氧化鋰進(jìn)行接觸，以便獲得
式iii所示的化合物；(3)對式iii所示化合物進(jìn)行氨基保護(hù)處理，以便獲得式iv所示化合物；(4)式iv所示化合物與式v所示化合物進(jìn)行接觸，以便獲得式vi所示化合物；以及(5)式vi所示化合物與鹽酸進(jìn)行接觸，以便獲得所述西他列汀，其中，在步驟(1)中，所述接觸是在轉(zhuǎn)氨酶的催化下進(jìn)行的,所述轉(zhuǎn)氨酶是由seqidno：1所示的核苷酸序列編碼的，
本發(fā)明實(shí)施例所述提出的制備西他列汀的方法，操作簡便，氨基轉(zhuǎn)化效率高，西他列汀的產(chǎn)率大。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述制備西他列汀的方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(1)中，所述接觸是在含二甲基亞砜的水溶液中進(jìn)行的，所述二甲基亞砜的濃度為20體積％，并且所述接觸是在45℃、磁力攪拌的條件下進(jìn)行的。在上述反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度下，轉(zhuǎn)氨酶催化氨基轉(zhuǎn)化的效率進(jìn)一步提高。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(3)中，所述氨基保護(hù)處理是通過與boc酸酐進(jìn)行接觸進(jìn)行的，所述接觸是在四氫呋喃中進(jìn)行的。保護(hù)基團(tuán)boc的脫除條件溫和，且反應(yīng)產(chǎn)物的分離提純較之其他類型的氨基保護(hù)基團(tuán)容易，進(jìn)而西他列汀的產(chǎn)率和純度進(jìn)一步顯著提高。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(5)中，所述接觸是在甲醇中進(jìn)行的，西他列汀的純度和產(chǎn)率進(jìn)一步提高。
在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種制備西他列汀的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：(1)5.5ml濃度為1.83m，ph為8.5的異丙胺水溶液，2.5ml濃度為20mg/ml的轉(zhuǎn)氨酶溶液,其中，所述轉(zhuǎn)氨酶溶液中含有1mm/l的磷酸吡哆醛，和2ml濃度為500mm/l的3-羰基-4-(2，4,5-三氟苯基)丁酸羥乙酯的二甲基亞砜溶液加入50ml單口燒瓶中，并在45℃下磁力攪拌反應(yīng)24h，其中，轉(zhuǎn)氨酶是由seqidno：1所示的核苷酸序列編碼的；(2)加入氫氧化鋰，并調(diào)節(jié)步驟(1)所得溶液的ph,使得ph>10，減壓蒸餾除去異丙胺；(3)向步驟(2)所得溶液中繼續(xù)加入427mgboc酸酐和3ml四氫呋喃,反應(yīng)過夜，繼而用10ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取兩次，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，減壓蒸餾獲得200mgboc-(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸；(4)取166mg式iv化合物所示化合物和114mg式v所示化合物的鹽酸鹽，加至5ml二氯甲烷中，冰鹽浴下加入81mg1-羥基苯并三氮唑與115mg1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳酰亞胺鹽酸鹽，加入150mg三乙胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)，反應(yīng)液用5ml水洗滌3次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得236mg式vi所示化合物；(5)稱取200mg得到的式vi所示化合物至5ml甲醇中，加入5ml濃鹽酸:甲醇＝1:5的溶液，室溫?cái)嚢?小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，并用na2c03中和，用5ml乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，除溶劑得油狀物。加入6ml乙醇與lml水，加熱到80℃，加入60mg濃磷酸，攪拌2小時(shí)并降至室溫，再攪拌12小時(shí)，析出173mg固體，所得固體即為西他列汀(為西他列汀的磷酸鹽)。本發(fā)明實(shí)施例所提出的制備西他列汀的方法，操作簡便，氨基轉(zhuǎn)化效率高并且西他列汀的產(chǎn)率大。
具體實(shí)施方式
下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
在以下實(shí)施例中，高效液相色譜法(hplc)的測定方法如下所述：
反應(yīng)液用乙腈稀釋20倍，離心后取5微升在ultimate3000hplc上分析轉(zhuǎn)化率。其中，色譜柱為watersxterrarpc18colume(3.9×150mm,5微米)，流動相為乙腈和10mm的乙酸銨水溶液，0-10min，10％-90％乙腈；10-11min，90％乙腈；11-12min，90％-10％乙腈；12-15min，10％乙腈，流速為0.8ml/min，檢測波長265nm。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)氨酶的制備
在以下實(shí)施例中，轉(zhuǎn)氨酶來源于codexis公司對節(jié)桿菌來源的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行改造后的酶，轉(zhuǎn)氨酶的制備方法如下所述：
將編碼轉(zhuǎn)氨酶的目的基因(由武漢天一輝遠(yuǎn)公司合成)插入到表達(dá)質(zhì)粒prsfduet-1中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，并將轉(zhuǎn)化液涂布到含有卡那霉素的lb平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。將所得的重組e.colibl21(de3)接種至含卡那霉素的lb培養(yǎng)基(lb培養(yǎng)基中含有l(wèi)og/l蛋白棟,5g/l酵母膏以及10g/lnacl,ph7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，并按1％(v/v)的接種量接入裝有500m1lb培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基盛裝在2000m1三角瓶中)，置37℃、220rpm的搖床中震蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的od600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為1mmo1/l的iptg作為誘導(dǎo)劑，在30℃的條件下誘導(dǎo)16h后，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞，并用100mm的三乙醇胺溶液(ph＝8.5,含1mm磷酸吡哆醛)重懸，并再次離心。收集的細(xì)胞再次用25ml100mm的三乙醇胺溶液(ph＝8.5,含1mm磷酸吡哆醛)重懸后，超聲破碎，16000g離心20min后得到的上清即為粗轉(zhuǎn)氨酶液，粗轉(zhuǎn)氨酶液在-4℃可以存放幾天?；蛘?，可直接將收集的細(xì)胞于-80℃凍存，需用時(shí)再取出制備粗轉(zhuǎn)氨酶液。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)氨酶對3-羰基-4-(2，4,5-三氟苯基)丁酸羥乙酯的轉(zhuǎn)胺反應(yīng)
10ml單口燒瓶中加入1.1ml1.83m的異丙胺水溶液(ph＝8.5)、0.5ml的粗轉(zhuǎn)氨酶溶液、0.4ml250mm/l的3-羰基-4-(2，4,5-三氟苯基)丁酸羥乙酯的二甲基亞砜(dmso)溶液，45℃下磁力攪拌反應(yīng)24h，用高效液相色譜法(hplc)測定氨基的轉(zhuǎn)化率大于99％。反應(yīng)結(jié)束后，將ph調(diào)為11.0，并用10ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取兩次，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥過夜后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，減壓蒸餾獲得25mg(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸羥乙酯，收率90.5％,純度>95％，光學(xué)純度>98％.
實(shí)施例3轉(zhuǎn)氨酶對3-羰基-4-(2，4,5-三氟苯基)丁酸羥丙酯的轉(zhuǎn)胺反應(yīng)
10ml單口燒瓶中加入1.1ml1.83m的異丙胺水溶液(ph＝8.5)、0.5ml的粗轉(zhuǎn)氨酶溶液、0.4ml250mm/l的3-羰基-4-(2，4,5-三氟苯基)丁酸羥丙酯的二甲基亞砜(dmso)溶液，45℃下磁力攪拌反應(yīng)24h，用高效液相色譜法(hplc)測定氨基的轉(zhuǎn)化率大于99％。反應(yīng)結(jié)束后，將ph調(diào)為11.0，并用10ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取兩次，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥過夜后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，減壓蒸餾獲得25mg(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸羥丙酯，收率90.5％,純度>95％，光學(xué)純度>98％.
實(shí)施例4制備boc-(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸
50ml單口燒瓶中加入5.5ml1.83m的異丙胺水溶液(ph＝8.5)、2.5ml粗轉(zhuǎn)氨酶溶液(含1mm/l的磷酸吡哆醛plp)、2ml500mm/l的3-羰基-4-(2，4,5-三氟苯基)丁酸羥乙酯的dmso溶液，45℃下磁力攪拌反應(yīng)24h后，加入氫氧化鋰，并調(diào)節(jié)所得溶液的ph，使得ph>10減壓蒸餾除去異丙胺，然后加入427mgboc酸酐(boc)2o和3ml四氫呋喃(thf),反應(yīng)過夜，用10ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取兩次，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，減壓蒸餾，即可獲得200mgboc-(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸，收率60.6％,純度>96％，光學(xué)純度>98.6％。為了方便理解，上述反應(yīng)過程的化學(xué)反應(yīng)流程如下所示：
獲得的boc-(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸可繼續(xù)用于制備西他列汀，西他列汀的產(chǎn)率高。由boc-(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸獲得西他列汀的化學(xué)反應(yīng)流程如下所示：
實(shí)施例5轉(zhuǎn)氨酶對不同底物的氨基轉(zhuǎn)化率的比較
10ml單口燒瓶中加入1.1ml1.83m的異丙胺水溶液(ph＝8.5)，0.5ml粗轉(zhuǎn)氨酶溶液(含1mm/l的磷酸吡哆醛)，0.4ml含有100mm/l的不同底物的dmso溶液，45℃下磁力攪拌反應(yīng)8h，用hplc測定氨基轉(zhuǎn)化率，測定結(jié)果如表1所示。
表1：
由表1可以看出，
另外，發(fā)明人還考察了轉(zhuǎn)氨酶的其它反應(yīng)底物，發(fā)現(xiàn)r1為含羥基的取代基時(shí)，氨基轉(zhuǎn)化效率大于90％，均大于現(xiàn)有技術(shù)中所用的轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)底物。
在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。
盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。