本發(fā)明屬于分子克隆領(lǐng)域，具體涉及一種松墨天牛氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因克隆與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶(glutamine--fructose-6-phosphateaminotransferase，gfat)是己糖胺通路(hbp)的限速酶，參與幾丁質(zhì)的合成和蛋白質(zhì)的糖基化。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后先轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖，在gfat催化下生成6-磷酸葡糖胺，經(jīng)過中間代謝環(huán)節(jié)，最終轉(zhuǎn)化為二磷酸尿嘧啶n-乙酰氨基葡萄糖(udp-glcnac)。

松墨天牛(monochamusalternatushope)，隸屬于鞘翅目(coleoptera)，天?？?cerambycidae)，主要危害馬尾松(pinusmassoniana)，油松(p.tabulaeformis)，黑松(p.thunbergii)等生長衰弱或新伐倒的針葉樹，是松材線蟲(bursaphelenchusxylophilus(steiner&buhrer))病的主要傳播媒介昆蟲。目前，gfat在松墨天牛中尚未有報(bào)道，本發(fā)明從松墨天牛cdna文庫中克隆了gfat基因，研究了該基因在松墨天牛各蟲態(tài)、成蟲6個(gè)部位、幼蟲5個(gè)組織中的表達(dá)，旨在為研究gfat結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)糸奠定基礎(chǔ)，為闡明gfat在松墨天牛幾丁質(zhì)合成中的作用提供參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從松墨天牛中分離克隆谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因，申請人將該基因命名為magfat。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列，其cdna序列由2624個(gè)核苷酸組成，自5′至3′端序列如seqidno：1所示。

所述的松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因編碼氨基酸序列為第1-2058位核苷酸，終止密碼子序列是tag，為第2058-2060位核苷酸。

所述的2058個(gè)核苷酸序列編碼686個(gè)氨基酸，其序列如seqidno：2所示。

一種松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列的克隆方法，其特征在于：包括如下步驟：

松墨天?？俽na提取、mrna的反轉(zhuǎn)錄、根據(jù)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的松墨天牛cdna文庫，篩選出谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶序列，以此序列為基礎(chǔ)，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物outer：5′-atctcgctcgtgatgttcg-3′和inner：5′-tatgagggaccccgttta-3′，并利用3′-fullracecoresetwithprimescript^tmrtase試劑盒中的通用引物3′raceouter：5′-taccgtcgttccactagtgattt-3′和3′raceinner：5′-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3′進(jìn)行3′race。將已知的5′端序列和3′端序列拼接得到完整的谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列；具體步驟如下：

(1)松墨天?？俽na提取

松墨天牛幼蟲由廣東省林科院惠贈(zèng)，采用人工飼料飼養(yǎng)。分別收集交配期成蟲的觸角、頭(去除觸角)、胸、足、翅、腹節(jié)等組織樣品和幼蟲的體壁、脂肪體、血淋巴、中腸、馬氏管等組織樣品；同時(shí)收集松墨天牛的3齡幼蟲以及10d蛹及羽化3d的成蟲。樣品置液氮中迅速冷卻后保存于-80℃冰箱備用。

取-80℃保存的松墨天牛樣品，置于已用液氮預(yù)冷的無rna酶的研缽，用液氮快速冷凍并研磨成粉末狀，按照rna抽提試劑盒(omega公司)使用說明，提取松墨天牛各樣本的總rna，并獲得約40μl總rna，-80℃保存。

(2)mrna的反轉(zhuǎn)錄

提取的總rna經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度儀(nanodrop2000)檢測后，按rtreagentkitwithgdnaeraser反轉(zhuǎn)錄說明書合成單鏈cdna，稀釋20倍用作實(shí)時(shí)熒光定量pcr(rt-qpcr)的模板。

(3)pcr與race

以合成的cdna為模板，加入10×extaq聚合酶反應(yīng)緩沖液2.5μl(含mg²⁺)，正向和反向引物各0.5μl(10μmol/l)，dntp2μl(2.5μmol/l)，extaqdna聚合酶0.5μl(5u/μl)，加ddh2o至25μl，混勻離心(3000r/min10s)后進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

以特異性引物outer及試劑盒中提供的通用引物3′raceouter進(jìn)行第1輪pcr，特異性引物inner及通用引物3′raceinner通過巢式pcr。pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94攝氏度30s；55℃(第1輪)、58℃(巢式)30s、72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析?；厥漳康钠?、與pmd20-t載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆測序。

(4)序列測定

pcr及race產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接到pmd20-t克隆載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌dh5α中，經(jīng)氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)重組質(zhì)粒12h，提取白斑質(zhì)粒dna檢測。測序由上海生物工程有限公司完成。

(5)完整的松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因序列的獲得

將已知松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶5′端片段和中間保守片段與擴(kuò)增的3′端片段的序列進(jìn)行拼接，即得到完整的松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因序列。

(6)松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列測定結(jié)果

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因，命名為magfat，序列全長由2624個(gè)核苷酸組成，見序列表，編碼686個(gè)氨基酸殘基，見序列表；松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因編碼氨基酸序列為第1-2058位核苷酸，終止子密碼位于基因2058-2060位，終止密碼為tag，2061-2624為3′末端非編碼序列。

一種松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因的生物信息學(xué)分析

從ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)genbank數(shù)據(jù)庫中檢索16種昆蟲谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，分別為：triboliumcastaneum赤擬谷盜(xp_008191288.1)；cerapachysbiroi畢氏粗角蟻(xp_011340931.1)；acromyrmexechinatior頂切葉蟻(xp_011059147.1)；linepithemahumile阿根廷蟻(xp_012222258.1)；monomoriumpharaonis法老蟻(xp_012523497.1)；harpegnathossaltator印度跳蟻(xp_011142953.1)；camponotusfloridanus佛羅里達(dá)弓背蟻(xp_011262248.1)；bombusterrestris阿里山潛蠅繭蜂(xp_012163447.1)；apisflorea歐洲熊蜂(xp_012345419.1)；fopiusarisanus云南小蜜蜂(xp_011301753.1)；megachilerotundata苜蓿切葉蜂(xp_012142070.1)；athaliarosae鋸蠅(xp_012264018.1)；nasoniavitripennis麗蠅蛹集金小蜂(xp_008204365.1)；microplitisdemolitor菜蛾盤絨繭蜂(xp_008554199.1)；muscadomestica家蠅(xp_005184307.1)；ceratitiscapitata地中海實(shí)蠅(xp_012158557.1)。將松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列與ncbi數(shù)據(jù)庫中的16種昆蟲谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，其中，松墨天牛與赤擬谷盜(triboliumcastaneum)相似性最高，為88％，與畢氏粗角蟻(cerapachysbiroi)的相似性為84％，與其他昆蟲的相似性都大于80％。

基于17種昆蟲的寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示：松墨天牛與赤擬谷盜遺傳距離最近，在同一分支；與菜蛾盤絨繭蜂(microplitisdemolitor)等遺傳距離較遠(yuǎn)。

一種松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)模式

用rt-qpcr分析了magfat在不同蟲態(tài)、成蟲各部位和幼蟲組織中的表達(dá)模式。magfat在成蟲的表達(dá)量最高，蛹和幼蟲的表達(dá)量分別是成蟲的0.59倍和0.29倍(圖1)。成蟲各部位的表達(dá)模式為：翅膀的表達(dá)量最高，為對(duì)照的25.70倍，觸角的表達(dá)量最低，為對(duì)照的1.23倍，頭、胸、腹、足分別為對(duì)照的2.14、20.10、18.74、15.68倍，成蟲各部位magfat基因表達(dá)差異顯著(p＜0.05)(圖2)。幼蟲各組織的表達(dá)模式為：體壁的表達(dá)量最高，為對(duì)照的0.93倍，血淋巴的表達(dá)量最低，為對(duì)照的0.023倍，脂肪體、馬氏管、中腸分別為對(duì)照的0.37、0.26、0.28倍，基因表達(dá)有顯著差異(p＜0.05)(圖3)。圖1-3中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示差異顯著(p＜0.05)。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)提供一種松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因及其克隆方法，該序列由2624個(gè)核苷酸組成，其中1-2058位核苷酸是松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因編碼氨基酸序列，2058-2060位核苷酸是終止子序列tag。

(2)采用該方法克隆的核苷酸序列質(zhì)量好，產(chǎn)量高，操作簡單，應(yīng)用廣泛。

附圖說明

圖1是松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因在松墨天牛各蟲態(tài)中的表達(dá)圖。

圖2是松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因在松墨天牛成蟲各部位中的表達(dá)圖。

圖3是松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因在松墨天牛幼蟲各組織中的表達(dá)圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

一種松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列，其cdna序列由2624個(gè)核苷酸組成，序列如序列表所示。

所述的松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因編碼氨基酸序列為1-2058位核苷酸，終止子密碼為tag，位于基因2058-2060位；所述的2058個(gè)核苷酸序列編碼686個(gè)氨基酸，其序列如序列表所示。

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因的克隆程序如下：

1、松墨天?？俽na提取

取-70℃保存的松墨天牛樣品，置于已用液氮預(yù)冷的無rna酶的研缽中，加入液氮快速冷凍并研磨成粉末狀，取其中約100mg，按照e.z.n.a.^tmtotalrnakitii總rna提取試劑盒(omega)說明書提取松墨天?？俽na。并獲得約0.04ml總rna，-70℃保存。

2、mrna的反轉(zhuǎn)錄

10μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，含2.5μl的總rna，1μl3′raceadaptor(5μm)，2μl5×primescriptbuffer，1μldntpmixture(10mmeach)，0.25μlrnaseinhibitor(40u/μl)，0.25μlprimescriptrtase(200u/μl)，3μlrnasefreedh2o，42℃反應(yīng)60min，70℃反應(yīng)15min，冰浴冷卻后放入-20℃冰箱保存。

3、松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列3′race的擴(kuò)增

(1)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的松墨天牛cdna文庫^[11]，篩選出一段谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶序列，以此序列為基礎(chǔ)，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物outer：5′-atctcgctcgtgatgttcg-3′和inner：5′-tatgagggaccccgttta-3′，并利用試劑盒中的通用引物3′raceouter：5′-taccgtcgttccactagtgattt-3′和3′raceinner：5′-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3′進(jìn)行3′race。

(2)race

以特異性引物outer及試劑盒中提供的通用引物3′raceouter進(jìn)行第1輪pcr，特異性引物inner及通用引物3′raceinner通過巢式pcr。pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94攝氏度30s；55℃(第1輪)、58℃(巢式)30s、72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析。

(3)松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶目的片段的回收

參考通用型dna純化回收試劑盒的使用說明書進(jìn)行：

①pcr產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下用潔凈的手術(shù)刀割下含需回收dna瓊脂塊(盡量切除多余部分)，放入干凈的離心管中，稱取重量。

②向膠塊中加入等倍體積溶液pc(如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100μl，則加入100μlpc溶液)，50℃水浴放置10min左右，期間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，直至溶液呈淺黃色且無膠塊。

③柱平衡步驟：向吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液bl，室溫下，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

④將②所得溶液加入一個(gè)吸附柱cb2中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

⑤向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw(使用前請檢查是否已加入無水乙醇)，回收的dna是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，如平末端連接，所以加入漂洗液pw后靜置2～5min再離心。12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2放入收集管。

⑥向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液。

⑦將吸附柱cb2放入收集管，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。

⑧將吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液eb，室溫放置2min，12000r/min離心2min，收集dna溶液。

⑨dna產(chǎn)物于-20℃保存。

(4)松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶3′端片段的測序

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶3′端片段經(jīng)通用型dna純化回收試劑盒回收后，克隆至載體pmd20-t中，轉(zhuǎn)化dh5α大腸桿菌，篩選陽性克隆，進(jìn)行dna測序。

4、完整松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列的獲得

將已知的松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶含5′端及中間保守片段的序列以及克隆的該酶的3′端片段的序列進(jìn)行拼接，即得到完整松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列。

5、松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列測定結(jié)果

一種松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列，其cdna序列由2624個(gè)核苷酸組成，編碼氨基酸序列為1-2058位核苷酸，編碼686個(gè)氨基酸，終止子密碼為tag，位于基因2058-2060位。

實(shí)施例2松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因的生物信息學(xué)分析

松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因的1-2058位核苷酸序列編碼686個(gè)氨基酸。

從ncbi(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)genbank數(shù)據(jù)庫中檢索16種昆蟲谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，分別為：triboliumcastaneum赤擬谷盜(xp_008191288.1)；cerapachysbiroi畢氏粗角蟻(xp_011340931.1)；acromyrmexechinatior頂切葉蟻(xp_011059147.1)；linepithemahumile阿根廷蟻(xp_012222258.1)；monomoriumpharaonis法老蟻(xp_012523497.1)；harpegnathossaltator印度跳蟻(xp_011142953.1)；camponotusfloridanus佛羅里達(dá)弓背蟻(xp_011262248.1)；bombusterrestris阿里山潛蠅繭蜂(xp_012163447.1)；apisflorea歐洲熊蜂(xp_012345419.1)；fopiusarisanus云南小蜜蜂(xp_011301753.1)；megachilerotundata苜蓿切葉蜂(xp_012142070.1)；athaliarosae鋸蠅(xp_012264018.1)；nasoniavitripennis麗蠅蛹集金小蜂(xp_008204365.1)；microplitisdemolitor菜蛾盤絨繭蜂(xp_008554199.1)；muscadomestica家蠅(xp_005184307.1)；ceratitiscapitata地中海實(shí)蠅(xp_012158557.1)。將松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列與ncbi數(shù)據(jù)庫中的16種昆蟲谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，其中，松墨天牛與赤擬谷盜(triboliumcastaneum)相似性最高，為88％，與畢氏粗角蟻(cerapachysbiroi)的相似性為84％，與其他昆蟲的相似性都大于80％。

基于17種昆蟲的寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示：松墨天牛與赤擬谷盜遺傳距離最近，在同一分支；與菜蛾盤絨繭蜂(microplitisdemolitor)等遺傳距離較遠(yuǎn)。

實(shí)施例3松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶基因的分布和表達(dá)

1、熒光定量pcr引物

根據(jù)獲得的完整松墨天牛谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶核苷酸序列，利用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物forward(正向)(5′-ttgtgatgagcgaagacagg-3′)和reverse(反向)(5′-cggccaacaccttaactttg-3′)，以及內(nèi)參基因引物β-actinforward(正向)(5′-ctctgctatgtagcccttgactt-3′)和β-actinreverse(反向)(5′-ggagttgtaggtggtttcgtg-3′)用于rt-qpcr。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

2、基因組dna的去除，反應(yīng)體系為10μl，包括2μl5×gdnaeraserbuffer，1μlgdnaeraser，1μltotalrna，6μlrnasefreedh2o。42℃反應(yīng)2min；后置于4℃保存。

3、按照primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser操作手冊進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將各樣品rna反轉(zhuǎn)錄為cdna模板?？偡磻?yīng)體系為20μl，包括有4μl5×primescriptbuffer2(forrealtime)，1μlprimescriptrtenzymemixi，1μlrtprimermix，10μl1)的反應(yīng)液，4μlrnasefreedh2o。

4、采用sybrpremixextaq^tm染料法，在羅氏lightcycler480熒光定量pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，反應(yīng)體系為20μl，依次加入10.0μlsybrpremixextaqtm(2×)，0.4μlmaqvps4-fprimer(10μm)，0.4μlmaqvps4-rprimer(10μm)，2.0μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(cdna溶液)，然后加dh2o至20μl。stage1：preamplification(預(yù)變性)95℃5min，1cycle；stage2：amplification(pcr反應(yīng))95℃10sec，60℃20sec，40cycles；stage3：cooling(冷卻)40℃30sec，1cycle。