本發(fā)明屬于中藥材鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種動(dòng)物角類藥材角質(zhì)層的dna提取方法。
背景技術(shù)：
：在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中，一些動(dòng)物角有顯著的臨床療效。如羚羊角具有平肝熄風(fēng)，清肝明目，散血解毒的功效；水牛角具有清熱涼血，解毒，定驚的功效。因角類動(dòng)物藥材資源有限，價(jià)格昂貴，易混品較多，傳統(tǒng)鑒定方法主要依賴經(jīng)驗(yàn)豐富的鑒定專家，一般中藥材質(zhì)量驗(yàn)收人員缺乏性狀鑒別經(jīng)驗(yàn)，難以確保用藥有效性。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)不受樣品狀態(tài)影響，可通過分析其遺傳物質(zhì)dna的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物物種的鑒定。存在于動(dòng)物線粒體的co1基因已在魚類、鳥類等分類中得到成功的運(yùn)用，能有效識(shí)別新物種，被認(rèn)為是全球動(dòng)物物種鑒定的通用條形碼，其片段序列可作為種內(nèi)多樣性和種間特異性的一種新的身份識(shí)別系統(tǒng)。目前，對(duì)于動(dòng)物藥及混偽品的鑒定多通過聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）技術(shù)擴(kuò)增線粒體上的co1基因，通過序列比對(duì)、計(jì)算遺傳距離、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等來分析正品及混偽品。該技術(shù)已用在多種動(dòng)物藥材的不同組織樣本如（肌肉、血液）的dna擴(kuò)增，并取得較好的研究結(jié)果。然而，對(duì)于角類部位的dna提取，已有文獻(xiàn)采用通用動(dòng)物組織（肌肉、血液）的dna提取方法，該方法對(duì)于像角類藥材這樣的堅(jiān)硬樣本存在角質(zhì)細(xì)胞裂解不徹底，提取出的dna模板濃度低，尤其是長(zhǎng)時(shí)間放置，dna降解嚴(yán)重的角類藥材無法進(jìn)一步pcr。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為了解決現(xiàn)有動(dòng)物角類藥材dna的提取方法存在角質(zhì)細(xì)胞裂解不徹底，提取的dna模板濃度低，dna降解嚴(yán)重的角類藥材無法進(jìn)行pcr的問題，提供了一種動(dòng)物角類藥材角質(zhì)層的dna提取方法。本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種動(dòng)物角類藥材角質(zhì)層的dna提取方法，包括樣品前處理、取樣、dna提取，具體步驟為：（1）樣品前處理：取收集到的動(dòng)物角類藥材樣品，所述動(dòng)物角類藥材樣品為個(gè)子樣品，其處理方法為：先將樣品用電鋸切割橫截面，將樣品切割成片狀，然后將片狀樣品用刀片刮去外層污染，取內(nèi)層，削成細(xì)薄片；所述動(dòng)物角類藥材樣品為塊狀樣品，其處理方法為：用刀片刮去外層污染后，取內(nèi)層，削成細(xì)薄片；所述動(dòng)物角類藥材樣品為絲狀樣品，其處理方法為：用75%乙醇清洗3次，雙蒸水沖洗至無醇味，紫外光下照射，晾干；消毒剪剪成碎片，備用；（2）取樣：稱取樣品25-70mg，加入dtt20-100μl，proteinasek40μl及裂解緩沖液ga200μl后，56℃金屬浴酶解3-4小時(shí)后提取dna；（3）dna提?。喊丛噭┖刑崛〔襟E提取dna，nanodrop2000測(cè)定dna的濃度及純度；（4）提取的dna樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增：擴(kuò)增引物為co1基因的通用引物，正向引物lco14905′-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3′反向引物hco21985′-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3′，25μl反應(yīng)體系，根據(jù)nanodrop2000測(cè)定dna的濃度，保證模板用量為150~180ng，低于150~180ng，模板取樣定為10μl；濃度為10mmol/l的正向、反向引物各1μl；2×easytagsupermix12.5μl；雙蒸水補(bǔ)足至25μl；pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃1min；94℃，1min，45℃，1.5min，72℃，1.5min，5個(gè)循環(huán)；94℃，1min，50℃，1.5min，72℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min；用含有g(shù)oldviewi型核酸染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣，dl2，000dnamarker為對(duì)照，樣品5μl與2μl6×loadingbuffer混合均勻點(diǎn)樣，tbe緩沖液中電泳，凝膠成像儀成像；割取750bp處的dna條帶，膠回收純化pcr產(chǎn)物，測(cè)序；（5）低濃度樣品進(jìn)行二次擴(kuò)增：樣品濃度為10~14ng/μl，過低不能測(cè)序時(shí)，進(jìn)行二次擴(kuò)增：提取的dna第一次擴(kuò)增后，紫外燈下割取750bp處的條帶，切成碎塊，100μl雙蒸水溶解，60℃溫育，模板用量5μl，進(jìn)行二次擴(kuò)增；濃度為10mmol/l的正向、反向引物各1μl；2×easytagsupermix12.5μl；雙蒸水補(bǔ)足至25μl；擴(kuò)增程序?yàn)?5℃1min，40℃，1min，72℃，1.5min，72℃，1.5min，35個(gè)循環(huán)模，72℃，保存7min；1.5%瓊脂糖點(diǎn)樣，tbe緩沖液電泳，凝膠成像儀成像，割取750bp處的dna條帶，膠回收純化pcr產(chǎn)物，測(cè)序。優(yōu)選，步驟（2）中稱取樣品量為25mg，加入dtt量為20μl。采用本發(fā)明所述方法對(duì)動(dòng)物角類藥材的角質(zhì)層部位提取動(dòng)物角中的dna，對(duì)于dna嚴(yán)重降解的樣本，通過減少溶解dna的溶劑用量，提高初始濃度，或切膠純化，進(jìn)行二次擴(kuò)增，最終使所有樣品的pcr反應(yīng)結(jié)果滿足測(cè)序要求，成功測(cè)出所有樣品的線粒體co1基因序列。在取材上，樣品由于堅(jiān)硬，手工用刀片刮粉、鋼銼銼粉或電動(dòng)研磨器磨粉，均存在效率低下的缺點(diǎn)，難以完成取樣，后改為電鋸切割橫截面，完成由樣品到片狀樣品取材，片狀樣品進(jìn)一步用刀片刮去外層，以防止外原微生物污染。建立角類動(dòng)物藥材的dna提取方法，使提取的dna質(zhì)量滿足常規(guī)pcr要求。建立的dna提取方法，提取dna完全，可標(biāo)準(zhǔn)化操作，可應(yīng)用于多種動(dòng)物角的提取。采用本發(fā)明所述方法可提取角類樣品角質(zhì)層的dna，有效改善常規(guī)試劑盒對(duì)于角質(zhì)層樣品裂解不透徹，常規(guī)方法即使延長(zhǎng)時(shí)間過夜裂解,也無法改善裂解效果，且提取出的dna濃度低，無法進(jìn)一步pcr和測(cè)序；本發(fā)明方法在確定取樣量的基礎(chǔ)上，加入適當(dāng)量的dtt,短時(shí)間內(nèi)（4小時(shí)內(nèi)），可使角質(zhì)層樣品完全裂解，保證了dna最大程度提出，也能滿足陳舊樣品的dna提取,無需加大取樣量，無需進(jìn)口痕量dna提取試劑盒，可滿足新鮮和陳舊的動(dòng)物角類樣品，同時(shí)避免取骨塞部位（牛角類和羊角類樣品含有骨塞）時(shí)，用edta脫鈣預(yù)處理，因脫鈣次數(shù)和時(shí)間不好掌握，造成dna的提取不完全或dna被破壞。本發(fā)明方法對(duì)于傳統(tǒng)鑒定方法無法確定市場(chǎng)上種類繁多的動(dòng)物角類，通過考察提取過程關(guān)鍵因素，如裂解透徹與否的關(guān)鍵因素dtt、低濃度樣品二次擴(kuò)增時(shí)濃度梯度的考察，樣品取樣量、dtt的加入量等關(guān)鍵因素，保證了所有樣品dna最大程度提取及成功進(jìn)行pcr反應(yīng)，通過測(cè)序、比對(duì)確定了動(dòng)物角的種類，解決了傳統(tǒng)方法無法鑒定的不完整樣品，保證作為中藥材使用的羚羊角、水牛角的正品來源，以防山羊角、黃羊角等羊角類充當(dāng)羚羊角使用，防止牦牛角、黃牛角等牛角類充當(dāng)水牛角使用。附圖說明圖1為收集的10種樣品原始照片圖；圖2為所有樣品的pcr圖；圖3為低濃度樣品二次擴(kuò)增pcr圖，圖中：1為綿羊角，pcr模板用量為5μl；2為山羊角，pcr模板用量為5μl；3為綿羊角，pcr模板用量為10μl；4為山羊角，pcr模板用量為10μl；5為綿羊角，pcr模板用量為5μl；6為山羊角，pcr模板用量為5μl；圖4、圖5為所有序列的測(cè)序結(jié)果圖；圖6為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例中所述的陳舊樣品分別采用常規(guī)試劑盒方法與本發(fā)明所述方法進(jìn)行pcr的對(duì)照?qǐng)D，圖中：1、2、3為采用常規(guī)試劑盒方法進(jìn)行pcr結(jié)果，其中樣品分別為羚羊角個(gè)子15年、羚羊角片13年、藏羚羊角個(gè)子12年；4、5、6為采用本發(fā)明所述方法進(jìn)行pcr結(jié)果，其中樣品分別為羚羊角個(gè)子15年、羚羊角片13年、藏羚羊角個(gè)子12年，m為dnamark2000。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：收集河北安國(guó)藥材市場(chǎng)和安徽亳州藥材市場(chǎng)所有角類動(dòng)物藥材及民間收藏的樣品（包括羊角類、牛角類），研究角類藥材（角質(zhì)層）的dna提取方法，使提取出的dna質(zhì)量可滿足常規(guī)pcr反應(yīng)要求。1.材料與儀器收集的樣品信息見表1。樣品照片圖見圖1。僅憑借圖1照片，采用傳統(tǒng)鑒定方法無法鑒定所述樣品的物種來源信息，而對(duì)于dna模板量較小的樣品，采用常規(guī)dna提取，難以滿足pcr測(cè)序的要求，因此也無法鑒別出樣品的物種來源，憑借主觀觀察易于混淆樣品物種，而發(fā)生誤判、錯(cuò)判，最終導(dǎo)致用藥錯(cuò)誤。表1：收集的樣品信息血液/細(xì)胞/組織基因組dna提取試劑盒（離心柱型），目錄號(hào)：dp304，天根生化科技有限公司；dl2,000dnamarker，6×loadingbuffer寶生物工程（大連）有限公司；2×easytagsupermix全式金；goldviewi型核酸染色劑、dtt（二硫蘇糖醇）、葡聚糖凝膠、tris、edtana2,，北京索來寶生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。bsa124s電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；chb-100a恒溫金屬浴，杭州博日科技有限公司；xw-80a旋渦混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；lx-200迷你離心機(jī)，海門市其林貝爾儀器；t960型pcr熱循環(huán)儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；dyy-6b型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠；zf-258全自動(dòng)凝膠成像儀，上海嘉鵬科技有限公司；nanodrop2000dna濃度測(cè)試儀。2.取材方法：取樣為：樣品取角質(zhì)層，個(gè)子樣品由電鋸切割橫截面，完成由貨物樣品到片狀樣品取材，塊狀樣品用刀片刮去外層，以防止外原微生物污染，然后刮取內(nèi)層樣品適量削成細(xì)薄片。絲狀樣品隨機(jī)取適量，75%乙醇清洗3次，雙蒸水沖洗至無醇味，紫外光下照射，晾干。消毒剪剪成碎片，稱取適量。3.羊角類和牛角類樣品角質(zhì)層dna的提取方法研究由于角蛋白含有較多的胱氨酸，故二硫鍵含量特別多，在蛋白質(zhì)肽鏈中起交聯(lián)作用，因此角蛋白化學(xué)性質(zhì)特別穩(wěn)定，有較高的機(jī)械強(qiáng)度。它們不易溶解和消化，常用的動(dòng)物細(xì)胞裂解液無法裂解，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，取適量角質(zhì)層樣品，在加入proteinasek及動(dòng)物組織裂解緩沖液ga后56℃過夜酶解，樣品幾乎無變化。ddt（二硫蘇糖醇）是一種很強(qiáng)的還原劑，常用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。加入proteinasek及動(dòng)物組織裂解緩沖液ga后56℃酶解3~4小時(shí)后，樣品裂解情況有較大改善，是影響dna提取完全的關(guān)鍵因素，樣品的取樣量也是影響dna質(zhì)量的關(guān)鍵因素。因此，對(duì)取樣量和dtt的用量進(jìn)行了單因素考察。3.1取樣量的考察稱取羚羊角薄片（樣品編號(hào)1）25mg、40mg、55mg、70mg，加入dtt100μl，proteinasek20μl及裂解緩沖液ga200μl后，56℃金屬浴酶解3小時(shí)后，按試劑盒提取步驟提取dna，nanodrop2000測(cè)定dna的濃度及純度，結(jié)果見表2。表2：取樣量考察由表2知，取樣量為25mg時(shí)，提取的dna純度較高，取樣量增大時(shí)，雖然提取濃度也增大，但a260/280值較低，提示有蛋白質(zhì)污染。進(jìn)一步pcr擴(kuò)增也顯示，蛋白污染的樣品擴(kuò)增出的條帶較暗，確定取樣量為25mg。3.2：dtt加入量的考察稱取刀片刮取的羚羊角粉（樣品編號(hào)1）25mg5份，分別加入20μl、40μl、60μl、80μl、100μl的dtt，加入40μl的proteinasek及裂解緩沖液ga400μl后，56℃金屬浴酶解，考察樣品在10小時(shí)內(nèi)的酶解情況。其結(jié)果見表3。表3dtt加入量考察為減少dtt用量，避免浪費(fèi)，確定dtt加入量為20μl，可使樣品在4小時(shí)內(nèi)完全裂解。將上述優(yōu)選的dna提取方法，取樣量25mg，dtt用量20μl，用于所收集的編號(hào)為1~10的樣品dna提取。提取的dna濃度及純度結(jié)果見表4。表4：編號(hào)為1~10的樣品dna提取結(jié)果3.3所有角類樣品的pcr擴(kuò)增上述所有提取的dna樣本（樣品編號(hào)1~10），用于pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為co1基因的通用引物，正向引物lco14905′-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3′，反向引物hco21985′-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3′，25μl反應(yīng)體系，模板用量為150~180ng，達(dá)不到150~180ng，模板取樣定為10-14ul；正向、反向引物各1μl（濃度為10mmol/l）；2×easytagsupermix12.5μl；雙蒸水補(bǔ)足至25μl。pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃1min；94℃，1min，45℃，1.5min，72℃，1.5min，5個(gè)循環(huán)；94℃，1min，50℃，1.5min，72℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min。用含有g(shù)oldviewi型核酸染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣，dl2，000dnamarker為對(duì)照，樣品5μl與2μl6×loadingbuffer混合均勻點(diǎn)樣，tbe緩沖液中電泳，凝膠成像儀成像。割取750bp處的dna條帶，膠回收純化pcr產(chǎn)物，上海桑尼生物公司測(cè)序。上述提取樣品的pcr結(jié)果見圖2（點(diǎn)樣順序?qū)?yīng)樣品編號(hào)）。3.4低濃度樣品的二次擴(kuò)增針對(duì)圖2中點(diǎn)樣序號(hào)為6、7的樣品（對(duì)應(yīng)樣品編號(hào)為6,7）存在濃度低，無法完成測(cè)序，為解決這一問題，重新提取dna，在最終溶解保存dna時(shí)，減少溶解dna的te用量，提升濃度。提取的dna第一次擴(kuò)增后，紫外燈下割取750bp處的條帶，切成碎塊，100μl雙蒸水溶解，60℃溫育，取適量，進(jìn)行二次擴(kuò)增。模板用量分別為2μl、5μl、10μl；正向、反向引物各1μl（濃度為10mmol/l）；2×easytagsupermix12.5μl；雙蒸水補(bǔ)足至25μl。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃1min，40℃，1min，72℃，1.5min，72℃，1.5min，35個(gè)循環(huán)模，72℃，保存7min。1.5%瓊脂糖點(diǎn)樣，tbe緩沖液電泳，凝膠成像儀成像，結(jié)果見圖3。由圖3知，二次擴(kuò)增時(shí)模板取樣量5μl時(shí)，效果最好，可用于測(cè)序；10μl模板抑制了pcr反應(yīng)；2μl模板條帶亮度適中。割取750bp處的dna條帶，膠回收純化pcr產(chǎn)物，上海桑尼生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果見圖4和圖5。序列經(jīng)過與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，相似度均為99%以上，確定了具體物種名稱，見表5。圖1中標(biāo)注出經(jīng)過與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后確定各樣品的物種名稱。采用本發(fā)明發(fā)法，在確定取樣量的基礎(chǔ)上，加入適當(dāng)量的dtt,短時(shí)間內(nèi)（4小時(shí)內(nèi)），可使角質(zhì)層樣品完全裂解，保證了dna最大程度提出，也能滿足陳舊樣品的dna提取,無需加大取樣量，無需進(jìn)口痕量dna提取試劑盒，成功測(cè)出所有樣品的co1序列，將序列與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)上的序列比對(duì)，可得出具體物種信息，從比對(duì)結(jié)果可知，收集的樣品除黃牛角比對(duì)結(jié)果為牦牛角外（可能依據(jù)性狀鑒定會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)），其余樣品與比對(duì)結(jié)果一致，說明收集樣品的物種信息是正確的，確定了傳統(tǒng)方法不能鑒定的羚羊角絲與羚羊角塊。因此本發(fā)明建立的dna提取方法，提取dna完全，使提取的dna質(zhì)量滿足常規(guī)pcr要求，可標(biāo)準(zhǔn)化操作，可應(yīng)用于多種動(dòng)物角的提取。可滿足新鮮和陳舊的動(dòng)物角類樣品，同時(shí)避免取骨塞部位（牛角類和羊角類樣品含有骨塞）時(shí)，用edta脫鈣預(yù)處理，因脫鈣次數(shù)和時(shí)間不好掌握，造成dna的提取不完全或dna被破壞。表5樣品比對(duì)結(jié)果表本發(fā)明所述方法對(duì)動(dòng)物角類藥材的角質(zhì)層部位提取動(dòng)物角中的dna，對(duì)于dna嚴(yán)重降解的樣本，通過減少溶解dna的溶劑用量，提高初始濃度，或切膠純化，進(jìn)行二次擴(kuò)增，最終使所有樣品的pcr反應(yīng)結(jié)果滿足測(cè)序要求，成功測(cè)出所有樣品的線粒體co1基因序列。在取材上，樣品由于堅(jiān)硬，手工用刀片刮粉、鋼銼銼粉或電動(dòng)研磨器磨粉，均存在效率低下的缺點(diǎn)，難以完成取樣，后改為電鋸切割橫截面，完成由樣品到片狀樣品取材，片狀樣品進(jìn)一步用刀片刮去外層，以防止外原微生物污染。實(shí)驗(yàn)例：采用保存10年以上陳舊羊角樣品，分別按常規(guī)試劑盒處理方法與本發(fā)明方法處理，常規(guī)試劑盒處理方法不包括第（3）步驟，本發(fā)明方法包括第（3）步驟，試劑盒采用天根生化科技有限公司的血液/細(xì)胞/組織基因組dna提取試劑盒（離心柱型），目錄號(hào)：dp304（包含proteinasek，緩沖液ga，緩沖液gb，緩沖液gd，漂洗液pw，吸附柱cb3）。樣品信息見表6。表6：存放10年以上的樣品信息編號(hào)樣品名稱樣品存放時(shí)間產(chǎn)地1羚羊角（個(gè)子）15年西伯利亞2羚羊角塊13年俄羅斯3藏羚羊角（個(gè)子）12年新疆具體步驟為：（1）樣品前處理：取表6的角類藥材樣品，先將樣品用電鋸切割橫截面，完成由個(gè)子樣品到片狀樣品取材；然后用刀片刮去外層，削取薄片適量，樣品編號(hào)為1、3，樣品編號(hào)2的處理：用刀片刮去外層，削取薄片適量；（2）取樣：稱取刮取的羚羊角薄片30mg于1.5mlep管中，（3）加入dtt30μl，加入proteinasek20μl及裂解緩沖液ga200μl后，56℃金屬浴酶解3-4小時(shí)，（4）按試劑盒提取步驟提取dna：加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，離心除管蓋內(nèi)壁水珠；加入200μl無水乙醇，充分震蕩混勻15秒，離心除去管蓋內(nèi)壁水珠；將所得溶液加入吸附柱cb3中，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中，向吸附柱cb3加入500μl緩沖液gd，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中，向吸附柱cb3加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中；重復(fù)加入200μl無水乙醇，充分震蕩混勻15秒，離心除去管蓋內(nèi)壁水珠；將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱cb3置室溫放置數(shù)分鐘，以晾干吸附材料中殘余的漂洗液，將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加80μl洗脫緩沖液te，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。（5）dna濃度測(cè)定：nanodrop2000測(cè)定dna的濃度及純度，結(jié)果見表7，由表7得知，常規(guī)方法對(duì)放置10年以上的樣品，提出的dna模板濃度低，本發(fā)明所述方法可明顯提高dna濃度。表7：常規(guī)方法與本發(fā)明方法提取dna的濃度結(jié)果常規(guī)方法本發(fā)明方法樣品名稱存放時(shí)間dna濃度（ng/μl）dna濃度（ng/μl）羚羊角（個(gè)子）15年3.518.3羚羊角塊13年2.720.2藏羚羊角（個(gè)子）12年5.423.5（6）pcr擴(kuò)增：提取的dna樣本（常規(guī)方法與本發(fā)明方法）進(jìn)行pcr擴(kuò)增：擴(kuò)增引物為co1基因的通用引物，正向引物lco14905′-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3′，反向引物hco21985′-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3′，25μl反應(yīng)體系，模板量為10μl；濃度為10mmol/l的正向、反向引物各1μl；2×easytagsupermix12.5μl；雙蒸水補(bǔ)足至25μl；pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃1min；94℃，1min，45℃，1.5min，72℃，1.5min，5個(gè)循環(huán)；94℃，1min，50℃，1.5min，72℃，1min，35個(gè)循環(huán)；72℃，5min；用含有g(shù)oldviewi型核酸染色劑的1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣，dl2，000dnamarker為對(duì)照，樣品5μl與2μl6×loadingbuffer混合均勻點(diǎn)樣，tbe緩沖液中電泳，凝膠成像儀成像；結(jié)果見圖5，由圖5知，在取同樣量的模板dna時(shí)，常規(guī)試劑盒方法在750bp處的擴(kuò)增條帶為陰性，而本發(fā)明方法擴(kuò)增出的dna條帶明顯。當(dāng)前第1頁12