本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及基于磁性納米粒子的革蘭氏陽(yáng)性病原菌分離方法。

背景技術(shù)：

敗血癥是嚴(yán)重的全身性感染疾病,病情復(fù)雜多變,病死率高。敗血癥患者血液中的病原菌主要包括革蘭氏陽(yáng)性病原菌和革蘭氏陰病原菌。在治療過(guò)程中，革蘭氏陽(yáng)性病原菌和革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差別較大,選用藥物也有一定差別。傳統(tǒng)的鑒別敗血癥患者血液中病原菌種類(lèi)的方法主要是血平板培養(yǎng)法，但該方法周期長(zhǎng)，大概需要5-7天，在這一過(guò)程中很可能會(huì)使病人的病情進(jìn)一步加重。另外，如若不對(duì)血液中病原菌進(jìn)行分類(lèi)，就只能使用廣譜的抗菌素。近年來(lái)，隨著人類(lèi)廣譜和超廣譜抗生素的大量生產(chǎn)和應(yīng)用，導(dǎo)致多重耐藥菌、條件病原菌引起的各類(lèi)感染增加，抗生素的選擇范圍縮小。目前全球細(xì)菌耐藥形勢(shì)空前嚴(yán)峻，細(xì)菌耐藥已被列為威脅人類(lèi)健康的三大難題之一。同時(shí)，廣譜和超廣譜抗菌素還會(huì)對(duì)腸道中的益生菌產(chǎn)生抑制作用，從而對(duì)健康產(chǎn)生一定的危害。因此，為了提高對(duì)敗血癥患者的治療效果,在治療前對(duì)患者血液中的病原菌種類(lèi)進(jìn)行鑒別，能夠指導(dǎo)臨床更加科學(xué)合理使用抗菌藥物。因此，建立一種高效、快速檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性病原菌的新方法顯得尤為迫切。鑒于需要建立一種高效，快速的檢測(cè)方法，基于功能化的磁性納米粒子的分離技術(shù)在病原菌監(jiān)測(cè)中得到了迅速發(fā)展。

磁分離技術(shù)是病原菌快速篩查技術(shù)的重要組成部分之一，該技術(shù)可高效捕獲、濃縮增菌液中目標(biāo)菌、提高病原菌檢測(cè)的靈敏度，縮短檢測(cè)時(shí)間。近年來(lái)，基于萬(wàn)古霉素修飾的磁性納米粒子分離法將萬(wàn)古霉素連接到磁性納米粒子上，然后將萬(wàn)古霉素修飾的磁性納米粒子投入樣品液中對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行捕獲、富集，分離。然而，目前該基于萬(wàn)古霉素偶聯(lián)磁性納米粒子磁分離技術(shù)存在諸多局限性：1)萬(wàn)古霉素是小分子，萬(wàn)古霉素直接修飾在磁性納米粒子表面不利于其與細(xì)菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子的結(jié)合；從而降低了捕獲效率；2)萬(wàn)古霉素直接偶聯(lián)于磁性納米粒子表面的方式，往往是將萬(wàn)古霉素直接偶聯(lián)于磁性納米粒子上，此過(guò)程常常會(huì)導(dǎo)致萬(wàn)古霉素的活性大大地降低并且導(dǎo)致萬(wàn)古霉素的空間方向發(fā)生改變?cè)龃罅巳f(wàn)古霉素分子的空間位阻效應(yīng)，從而降低了萬(wàn)古霉素的捕獲效率3)免疫分離方法中所用到的抗體特異性好，但價(jià)格昂貴，不易獲得和保存；4)磁性納米粒子偶聯(lián)萬(wàn)古霉素時(shí)，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的萬(wàn)古霉素偶聯(lián)在活化的磁性納米粒子表面。萬(wàn)古霉素與磁性納米粒子表面距離太近，導(dǎo)致萬(wàn)古霉素生物活性下降，降低磁捕獲效率。

臨床上應(yīng)用的傳統(tǒng)鑒別革蘭氏陽(yáng)性病原菌和革蘭氏陰性病原菌的方法，主要是血平板培養(yǎng)法。該方法不但周期長(zhǎng)，而且耗費(fèi)大量的人力物力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種低梯度磁場(chǎng)下，簡(jiǎn)便、快捷，高效的磁富集分離患者血液中的革蘭氏陽(yáng)性病原菌的方法。

革蘭氏陽(yáng)性病原菌的快速分離方法，包括以下步驟：(1)取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無(wú)菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無(wú)菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無(wú)菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁性納米粒子溶液中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無(wú)菌的pbs溶液中；(4)稱(chēng)取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml無(wú)菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性納米粒子溶液中，反應(yīng)3h，然后無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無(wú)菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子；(5)稱(chēng)取91.3mg萬(wàn)古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分別溶于無(wú)菌的pbs溶液中，然后混合通過(guò)碳化二亞胺法，活化萬(wàn)古霉素表面羧基，活化10min；(6)將活化后的萬(wàn)古霉素加入到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子中，孵育6h；(7)反應(yīng)完畢后，用無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml的萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集革蘭氏陽(yáng)性病原菌。(8)取10ml待測(cè)樣品溶液，加入1mg萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，置于培養(yǎng)箱上，以200rpm的轉(zhuǎn)速37℃孵育45min；插入磁力架分離6min；(9)磁分離后，無(wú)菌pbs溶液清洗后，用無(wú)菌的pbs緩沖液重懸即得富集有革蘭氏陽(yáng)性病原菌-萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物。

所述兩端氨基的聚乙二醇，其分子量為2000da。結(jié)構(gòu)如圖1。

所述納米磁性納米粒子粒徑為180nm，表面羧基。

萬(wàn)古霉素通過(guò)羧基與聚乙二醇的氨基相連，然后聚乙二醇的另一端氨基與磁性納米粒子表面的羧基相連，萬(wàn)古霉素通過(guò)五個(gè)氫鍵與革蘭氏陽(yáng)性病原菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連。

具體原理見(jiàn)圖2。

本方法適用于富集分離復(fù)雜復(fù)雜基質(zhì)中分離革蘭氏陽(yáng)性病原菌，如裂解血，血清，以及全血樣品。

采用本發(fā)明技術(shù)方案具有如下有益效果：

1、本發(fā)明采用的是180nm的磁性納米粒子，主要用于血液中目標(biāo)菌的快速富集，而采用30nm或者50nm納米磁珠結(jié)合樹(shù)狀分子的富集方法是用于磁信號(hào)的放大。

2、本發(fā)明采用的萬(wàn)古霉素是傳統(tǒng)的商業(yè)藥物，相比于抗體，具有穩(wěn)定好，成本低，質(zhì)量可控等優(yōu)點(diǎn)。基于上述優(yōu)點(diǎn)，在單次分離過(guò)程中，本發(fā)明構(gòu)建的分離萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物在成本上比免疫磁分離陳本降低了195倍；在材料保存方面比免疫磁珠保質(zhì)期也更長(zhǎng)。

3、在敗血癥患者血液中，是多種致病菌共存的環(huán)境。本發(fā)明采用的萬(wàn)古霉素是光譜的識(shí)別革蘭氏陽(yáng)性菌的分子識(shí)別劑，用于分離基質(zhì)中的革蘭氏陽(yáng)性菌是一種通用的分離策略，可以將基質(zhì)中的大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌都分離出來(lái)，然后通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或者選擇性培養(yǎng)進(jìn)行鑒別。相比之下，抗體因其只能專(zhuān)一的識(shí)別，從而分離出對(duì)應(yīng)的目標(biāo)菌，其他存在于血液中的致病菌無(wú)法鑒別。

4、本發(fā)明合成的萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物是先將聚乙二醇偶聯(lián)到磁性納米粒子的表面，然后再將萬(wàn)古霉素修飾到聚乙二醇-磁性納米粒子表面，相比于萬(wàn)古霉素先與聚乙二醇偶聯(lián)后，再與結(jié)合多聚賴(lài)氨酸(pll)修飾磁性納米粒子的方法，本發(fā)明的萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物不僅可以達(dá)更好的分離效率，而且在材料合成中耗時(shí)更短時(shí)間和成本更低。

5、本發(fā)明將聚乙二醇分子先偶聯(lián)在磁性納米粒子表面，然后再將萬(wàn)古霉素分子偶聯(lián)于聚乙二醇包被的磁性納米粒子上，避免了常規(guī)方法中將萬(wàn)古霉素分子偶聯(lián)于磁珠表面或者直接將萬(wàn)古霉素分子直接接在磁性納米粒子表面，導(dǎo)致萬(wàn)古霉素或者萬(wàn)古霉素分子活性降低和空間位阻大的缺點(diǎn)。同時(shí)聚乙二醇作為分子臂具有很好的靈活性，有利于萬(wàn)古霉素分子與單增李斯特菌表面的d-丙氨酰-d-丙氨酸(d-ala-d-ala)分子相連，提高了捕獲效率。相比于直接偶聯(lián)或者借助萬(wàn)古霉素分子中氨基作為反應(yīng)基團(tuán)的方法，該方法分離單增李斯特菌能力更強(qiáng)，特別適用于復(fù)雜樣品單增李斯特的分離，如食品樣品、全血樣品等。

6、磁性納米粒子偶聯(lián)萬(wàn)古霉素時(shí)，一般采用疏水吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式將具有活性的萬(wàn)古霉素聯(lián)接在磁性納米粒子表面。萬(wàn)古霉素與磁性納米粒子表面距離太近，磁性納米粒子本身性質(zhì)及其表面殘留的疏水或強(qiáng)親水基團(tuán)容易引起萬(wàn)古霉素空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致萬(wàn)古霉素生物活性下降。然而本實(shí)驗(yàn)方案在偶聯(lián)過(guò)程中引入聚乙二醇分子，其具有一定的空間長(zhǎng)度，從而使萬(wàn)古霉素分子遠(yuǎn)離磁性納米粒子和磁性納米粒子表面，避免了磁性納米粒子本身性質(zhì)及表面對(duì)萬(wàn)古霉素分子的影響。同時(shí)，引入聚乙二醇卻不會(huì)影響萬(wàn)古霉素分子的空間構(gòu)象，從而起到了保護(hù)萬(wàn)古霉素分子生物活性的作用。

7、本發(fā)明采用聚乙二醇分子，提高磁性納米粒子在溶液的穩(wěn)定性，避免發(fā)生沉淀，增加復(fù)合物的水溶性和生物相容性。

附圖說(shuō)明

圖1兩端修飾有氨基的聚乙二醇的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本發(fā)明所涉及的磁分離技術(shù)的操作流程圖；

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

磁性納米粒子(180nm)購(gòu)買(mǎi)于上海奧潤(rùn)有限公司。

兩端氨基的聚乙二醇2000da，購(gòu)自于威海晨源化工新材料有限公司。

萬(wàn)古霉素分子購(gòu)自于上海阿拉丁有限公司。

n-羥基丁二酰亞胺nhss,乙基3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽edc等均為常規(guī)試劑，不再贅述。

0.01mpbs配制方法：8.0gnacl、0.2gkcl、0.24gkh2po4、1.44gna2hpo4溶解于800ml蒸餾水中，用5mnaoh調(diào)整ph至7.4，再定容至1000ml即得0.01mpbs。

實(shí)施例1

1.萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物合成，按照如下步驟制備:

(1)取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無(wú)菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中；

(2)5.8mgedc，溶于290μl無(wú)菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無(wú)菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁性納米粒子溶液中，活化1h；

(3)將活化后磁性納米粒子用無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無(wú)菌的pbs溶液中；

(4)稱(chēng)取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml無(wú)菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性納米粒子溶液中，反應(yīng)3h，然后無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無(wú)菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子；

(5)稱(chēng)取91.3mg萬(wàn)古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分別溶于無(wú)菌的pbs溶液中，然后混合通過(guò)碳化二亞胺法，活化萬(wàn)古霉素表面羧基，活化10min；

(6)將活化后的萬(wàn)古霉素加入到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子中，孵育6h；

(7)反應(yīng)完畢后，用無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml的萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集革蘭氏陽(yáng)性病原菌。

2.富集捕獲：取待測(cè)樣品溶液10ml，加入1mg萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min形成革蘭氏陽(yáng)性病原菌-萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物；將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min；

3.去離子水輕輕清洗后，用pbs緩沖液重懸即得革蘭氏陽(yáng)性病原菌-萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物。

實(shí)施例2富集效果實(shí)驗(yàn)

(1)取1ml濃度為10⁵cfu/ml的革蘭氏陽(yáng)性病原菌于1.5ml無(wú)菌離心管中，12000rpm離心5min，棄上清，用等體積無(wú)菌pbs溶液重懸。

(2)富集捕獲：分別設(shè)置本發(fā)明技術(shù)方案組：聚乙二醇-磁性納米粒子組、萬(wàn)古霉素-磁性納米粒子、萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子組富集目的菌。

(3)磁分離后，將上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，而分離得到的革蘭氏陽(yáng)性病原菌的萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子則用pbs清洗兩次，混合均勻，并用1ml無(wú)菌pbs溶液重懸革蘭氏陽(yáng)性病原菌-萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物。

(4)捕獲率計(jì)算：將各組富集的革蘭氏陽(yáng)性病原菌重懸液進(jìn)行梯度稀釋后，用平板對(duì)每個(gè)梯度計(jì)數(shù)，通過(guò)捕獲效率公式計(jì)算革蘭氏陽(yáng)性病原菌的捕獲效率，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。各組捕獲效率的計(jì)算公式如下：[被富集吸附的菌落總數(shù)/(上清液中菌落總數(shù)+被富集吸附的菌落總數(shù))]×100％。

所述各組富集捕獲革蘭氏陽(yáng)性病原菌的方案如下：

a.本發(fā)明技術(shù)方案組(革蘭氏陽(yáng)性病原菌萬(wàn)古霉素和萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子組)富集捕獲革蘭氏陽(yáng)性病原菌方案如實(shí)施例1，具體如下：

將1mg萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物加入到含革蘭氏陽(yáng)性病原菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min。

b.萬(wàn)古霉素-磁性納米粒子組富集捕獲革蘭氏陽(yáng)性病原菌方案具體如下：

將1mg制備好的萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子加入到含革蘭氏陽(yáng)性病原菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。最后，將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min。

所述萬(wàn)古霉素修飾的磁性納米粒子制備：(1)取2ml磁性納米粒子(1)取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無(wú)菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無(wú)菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無(wú)菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁性納米粒子溶液中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無(wú)菌的pbs溶液中；(4)稱(chēng)取91.3mg萬(wàn)古霉素，48.3mgedc和54.8mgnhss,分別溶于無(wú)菌的pbs溶液中，然后混合通過(guò)碳化二亞胺法，活化萬(wàn)古霉素表面羧基，活化10min；(5)將活化后的萬(wàn)古霉素加入到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子中，孵育6h；(6)反應(yīng)完畢后，用無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中，得到濃度為2mg/ml萬(wàn)古霉素修飾的磁性納米粒子。

c.聚乙二醇-磁性納米粒子組

將1mg制備好的聚乙二醇-磁性納米粒子加入到含革蘭氏陽(yáng)性病原菌離心管中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。最后，將離心管插入常規(guī)磁力架分離6min。

所述萬(wàn)古霉素修飾的磁性納米粒子制備：取2ml的磁性納米粒子，加入到8mlph＝7.4的無(wú)菌的pbs溶液中，然后在外加磁場(chǎng)的作用下，對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行洗滌，重復(fù)3次，將洗滌好的磁性納米粒子重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中；(2)5.8mgedc，溶于290μl無(wú)菌的pbs中，6.5mgnhss，溶于325μl無(wú)菌的pbs中，然后將溶解后的edc和nhss加入到洗滌過(guò)的磁性納米粒子溶液中，活化1h；(3)將活化后磁性納米粒子用無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于8ml無(wú)菌的pbs溶液中；(4)稱(chēng)取聚乙二醇90mg，溶解于1.8ml無(wú)菌的pbs溶液中，然后加入到活化后的磁性納米粒子溶液中，反應(yīng)3h，然后無(wú)菌的pbs洗滌3次，重懸于10ml無(wú)菌的pbs溶液中，得到聚乙二醇修飾的磁性納米粒子，得到濃度為2mg/ml的聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物，用于富集革蘭氏陽(yáng)性病原菌。

各組捕獲率如下：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子組的捕獲革蘭氏陽(yáng)性病原菌效率明顯高于萬(wàn)古霉素修飾的磁性納米粒子組捕獲效率，這說(shuō)明聚乙二醇作為分子臂增加了萬(wàn)古霉素與革蘭氏陽(yáng)性病原菌的結(jié)合機(jī)會(huì)，使得革蘭氏陽(yáng)性病原菌的表面結(jié)合了更多的磁性納米粒子，因此，在短時(shí)間內(nèi)就能分離富集較多的革蘭氏陽(yáng)性病原菌。聚乙二醇-磁性納米粒子組的捕獲效率很低，說(shuō)明對(duì)革蘭氏陽(yáng)性病原菌基本無(wú)非特異性捕獲，表明用萬(wàn)古霉素分子來(lái)捕獲革蘭氏陽(yáng)性病原菌具有良好的效果。

實(shí)施例3

待測(cè)樣品為無(wú)菌裂解血，加入革蘭氏陽(yáng)性病原菌調(diào)節(jié)菌落濃度至10⁵cfu/ml備用。

將制備好萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子(1mg)分別加入到樣品溶液(10ml)中，置于混勻儀上，以200rpm的轉(zhuǎn)速室溫孵育45min。然后常規(guī)磁力架分離6min。磁分離后，將上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，而分離得到的革蘭氏陽(yáng)性病原菌-萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物則用無(wú)菌pbs清洗兩次，混合均勻，并用1ml無(wú)菌pbs溶液重懸革蘭氏陽(yáng)性病原菌-萬(wàn)古霉素-聚乙二醇-磁性納米粒子復(fù)合物。捕獲效率如實(shí)施例2方法獲得，其余同實(shí)施例2。結(jié)果見(jiàn)表1，表明本方案能高效富集分離樣品中的革蘭氏陽(yáng)性病原菌。

實(shí)施例4

待測(cè)樣品為無(wú)菌血清，加入革蘭氏陽(yáng)性病原菌調(diào)節(jié)菌落濃度至10⁵cfu/ml。其余同實(shí)施例3。

實(shí)施例5

待測(cè)樣品為無(wú)菌全血，加入革蘭氏陽(yáng)性病原菌調(diào)節(jié)菌落濃度至10⁵cfu/ml。其余同實(shí)施例3。

表1不同實(shí)際樣品中革蘭氏陽(yáng)性病原菌分離效果的比較

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。