本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種用于熒光定量pcr檢測(cè)的快速提取核酸方法，具體是指采用簡(jiǎn)便可靠的方法抽提臨床樣本dna，再采用熒光定量pcr方法對(duì)抽提的核酸進(jìn)行檢測(cè)。

背景技術(shù)：

核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。無(wú)論是進(jìn)行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要從復(fù)雜多樣的生物樣本中迅速有效地分離和提取所需要的基因組核酸，而且抽提后的核酸質(zhì)量及其完整性都會(huì)直接影響到隨后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前，提取核酸常用的傳統(tǒng)的基于溶液的抽提方法包括：堿抽提法、異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法和溴化十六烷基三甲胺(ctab)抽提法。

堿抽提方法是用堿和十二烷基磺酸鹽使細(xì)胞裂解，堿可以在保持共價(jià)閉合環(huán)狀dna雙鏈狀態(tài)的同時(shí)，使高分子量染色體dna變性，十二烷基磺酸鹽與細(xì)胞蛋白、破碎的細(xì)胞壁和變性的染色體dna形成復(fù)合物，離心后這些復(fù)合物沉淀，而質(zhì)粒dna存在于上清中。這種方法只適用于提取質(zhì)粒dna，具有局限性。

異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法是用異硫氰酸胍裂解細(xì)胞后，用酚使蛋白變性，同時(shí)抑制了dnase的降解作用，而蛋白分子溶于酚相，dna溶于水相。氯仿能夠去除核酸溶液中殘留的酚，加速有機(jī)相和液相分離。但這種方法中酚和氯仿對(duì)人體傷害較大。

ctab抽提法是用ctab溶解細(xì)胞膜,并結(jié)合核酸，使核酸便于分離，再用酚-氯仿去除蛋白質(zhì)和糖類。這種方法雖然提取的dna純度較高，但操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。

chelex-100對(duì)高價(jià)金屬離子有很高的親和力和螯合作用，能夠抑制核酸酶對(duì)dna的消化作用，防止了dna在煮沸過(guò)程中的降解,同時(shí)在高溫、低離子強(qiáng)度條件下還有催化dna釋放的作用，這樣的處理過(guò)程既達(dá)到了分離提取dna的目的，同時(shí)除去了一些對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)有抑制作用的因子(如重金屬離子)，提高了pcr擴(kuò)增的效率。該方法簡(jiǎn)便快速，提取過(guò)程始終在同一試管中進(jìn)行，可減少dna的損失。同時(shí)，由于操作步驟簡(jiǎn)單，減少了樣本之間交叉污染的機(jī)會(huì)。目前，該方法已廣泛應(yīng)用于微量血液、精斑、組織塊、牙齒、毛發(fā)和骨骼等材料dna的提取。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種快速提取核酸的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，所采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種快速提取核酸的方法，所述的方法包括以下步驟：

1.取少量生物樣本，所述生物樣本選自血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細(xì)胞樣本；

2.將樣本10000-13000rpm離心3-10min，棄上清；

3.加入1ml生理鹽水重懸沉淀，10000-13000rpm離心3-10min，棄上清；

4.在沉淀中加入50μl含5％chelex-100，0.5％-1％np40，0.5％-1％tritonx-100，1mmedta，ph＝9-12的核酸提取液，重懸沉淀；

5.80-90℃下加熱5-15min；

6.10000-13000rpm離心3-10min，收集上清為用于pcr反應(yīng)；

其中，本發(fā)明的第一優(yōu)先技術(shù)方案為，所述的核酸提取液中np40為0.5％-1％，優(yōu)選0.5％-0.7％；

本發(fā)明的第二優(yōu)先技術(shù)方案為，所述的核酸提取液中tritonx-100為0.5％-1％，優(yōu)選0.5％-0.7％。

本發(fā)明的第三優(yōu)先技術(shù)方案為，所述的核酸提取液的ph為9-12，優(yōu)選11-12。

本發(fā)明的第四優(yōu)先技術(shù)方案為，所述的加熱溫度為80-90℃，優(yōu)先80-85℃。

本發(fā)明的第五優(yōu)先技術(shù)方案為，所述的加熱時(shí)間為5-15min，優(yōu)選8-10min。

本發(fā)明的的第六優(yōu)選技術(shù)方案為，所述的離心轉(zhuǎn)速為10000-13000rpm，優(yōu)選11000-12000rpm。

本發(fā)明的第七優(yōu)先技術(shù)方案為，所述的離心時(shí)間為3-10min，優(yōu)先4-6min。

其中，本發(fā)明的生物樣本選自血斑精斑或精液樣本、組織液樣本、腦脊液樣本、尿液樣本、積液樣本、組織細(xì)胞樣本；

本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢(shì)為：

1.本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短。傳統(tǒng)方法中需用溶菌酶裂解細(xì)胞，蛋白酶k來(lái)去除樣本中的蛋白質(zhì)，這個(gè)過(guò)程需耗時(shí)1-2小時(shí)，再進(jìn)行柱純化dna，離心步驟多。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，采用高溫加熱來(lái)裂解樣本，使樣本中的蛋白質(zhì)變性，dna釋放出來(lái)，直接離心即可得到dna。裂解時(shí)間僅為10min，大大縮短了所需時(shí)間。

2.本發(fā)明80-90℃加熱溫度避免了離心管在加熱中崩蓋的現(xiàn)象。傳統(tǒng)熱裂解的溫度多為100℃，離心管很容易發(fā)生崩蓋現(xiàn)象，導(dǎo)致樣本之間的dna交叉污染。本發(fā)明中的加熱溫度為80-90℃，避免了離心管崩蓋導(dǎo)致的樣本dna之間的交叉污染，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.本發(fā)明使用chelex-100防止了dna在加熱過(guò)程中的降解，減少了dna的損失。

4.本發(fā)明np40和tritonx-100促進(jìn)了樣本的裂解，np40和tritonx-100都是pcr的增效劑，提高了pcr的擴(kuò)增效率。

附圖說(shuō)明

圖1為具體實(shí)施方式中兩種不同提取方法所提取dna的熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果。

附圖標(biāo)記：

1：1號(hào)樣本用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒提取的dna檢測(cè)結(jié)果；

2：1號(hào)樣本用本發(fā)明方法提取的dna檢測(cè)結(jié)果；

3：2號(hào)樣本用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒提取的dna檢測(cè)結(jié)果；

4：2號(hào)樣本用本發(fā)明方法提取的dna檢測(cè)結(jié)果；

5：3號(hào)樣本用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒提取的dna檢測(cè)結(jié)果；

6：3號(hào)樣本用本發(fā)明方法提取的dna檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

1.用兩種方法提取尿道分泌物中的dna，分別用這兩種抽提方法同時(shí)提取3個(gè)樣本，平行比較。

1.1用天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒(dp322)抽提尿道分泌物中的dna。

1.1.1取200μl含尿道管分泌物的細(xì)胞保存液，加入400μl緩沖液ga。

1.1.2加入20μlproteinasek溶液，旋渦10sec混勻，56℃放置60min，其間每15min渦旋混勻數(shù)次。

1.1.3加入400μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10min。此時(shí)溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。

1.1.4加200μl無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。

1.1.5將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱cr2中(吸附柱cr2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr2放回收集管中。

1.1.6向吸附柱cr2中加入已加入無(wú)水乙醇的500μl緩沖液gd，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr2放回收集管中。

1.1.7向吸附柱cr2中加入600μl已加入無(wú)水乙醇的漂洗液pw，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr2放回收集管。

1.1.8重復(fù)操作步驟7。

1.1.912,000rpm(～13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cr2室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

1.1.10將吸附柱cr2轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50μl洗脫緩沖液tb，室溫放置5min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min。

1.2用本發(fā)明的方法抽提尿道分泌物中的dna。

1.2.1取200μl含尿道管分泌物的細(xì)胞保存液，12000rpm離心5min，棄上清。

1.2.2加入1ml生理鹽水重懸沉淀，12000rpm離心5min，棄上清。

1.2.3在沉淀中加入50μl含5％chelex-100(sigma公司)，0.5％np40，0.5％tritonx-100，1mmedta，ph＝11核酸提取液，重懸沉淀。

1.2.485℃下加熱10min。

1.2.512000rpm離心5min，收集上清，取5μl用于pcr反應(yīng)。

2.dna鑒定方法

選擇人gapdh基因的taqman探針和引物，用熒光定量pcr方法檢測(cè)上述兩種不同提取方法所提取dna。引物和探針由primerexpress3.0軟件設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物探針信息如下：

用于檢測(cè)gapdh基因的上游引物為5-gcctcaagatcatcaggtgag-3’(seqidno:1)；

用于檢測(cè)gapdh基因的下游引物為5-agaaaggtgggagcctcagt-3’(seqidno:2)；

用于檢測(cè)gapdh基因的探針為5-fam-caccaccaactgcttagcacccctg-bhq1-3’(seqidno:3)。

2.1熒光定量pcr檢測(cè)

pcr擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)條件：37℃5min；95℃5min；95℃15s，60℃60s,40cycles。

3.結(jié)果分析

通過(guò)對(duì)提取產(chǎn)物dna的熒光pcr檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)，該方法提取產(chǎn)物的擴(kuò)增檢測(cè)ct值均小于天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒(dp322)提取產(chǎn)物dna的擴(kuò)增檢測(cè)ct值，而熒光信號(hào)值高于天根口腔拭子基因組dna提取試劑盒(dp322)提取產(chǎn)物dna的檢測(cè)熒光信號(hào)值。

在此說(shuō)明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。

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