相關申請本申請要求2014年12月19日提交的美國臨時申請流水號62/094,649的優(yōu)先權，其在此內(nèi)容通過提及并入。發(fā)明背景補體系統(tǒng)是先天免疫系統(tǒng)的一部分，其發(fā)揮功能以在從生物體中清除病原體中幫助或“補充”抗體和吞噬細胞。在系統(tǒng)激活后，發(fā)生一組催化性的反應和相互作用，導致靶向激活細胞、生物體或顆粒進行破壞。補體系統(tǒng)包含一組超過30種血漿和膜蛋白，其在調(diào)節(jié)的級聯(lián)系統(tǒng)中一起起作用以攻擊病原體(例如細菌)的胞外形式。補體系統(tǒng)包括兩種獨特的酶促激活級聯(lián)，即經(jīng)典和旁路途徑，其在稱為膜攻擊途徑的共同末端非酶促途徑中會聚。稱為經(jīng)典途徑的第一種酶促激活級聯(lián)包含若干組分，即c1、c4、c2、c3和c5(按路徑中的順序列出)。在免疫和非免疫激活劑結合和激活第一補體成分(c1)后發(fā)生補體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑的啟動。c1包含組分c1q、c1r和c1s的鈣依賴性復合物，并且經(jīng)由c1q組分的結合而激活。c1q含有六個相同的亞基，并且每個亞基包含三條鏈(a、b和c鏈)。每條鏈具有與膠原樣尾部連接的球形頭部區(qū)域。抗原-抗體復合物對c1q的結合和激活經(jīng)由c1q頭部基團區(qū)域發(fā)生。許多非抗體c1q激活劑(包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸)經(jīng)由膠原樣莖區(qū)上的獨特位點結合并且激活c1q。然后，c1qrs復合物催化補體成分c4和c2的激活，形成c4b2a復合物，其發(fā)揮c3轉(zhuǎn)化酶的功能。稱為旁路途徑的第二種酶促激活級聯(lián)是用于補體系統(tǒng)激活和放大的快速的不依賴于抗體的途徑。旁路途徑包括幾種組分，即c3、因子b和因子d(按途徑中的順序列出)。當c3b(c3的蛋白水解切割形式)與激活表面劑如細菌結合時，發(fā)生旁路途徑的激活。然后，因子b與c3b結合，并且被因子d切割以產(chǎn)生活性酶ba。然后，酶ba切割更多的c3以產(chǎn)生更多的c3b，在激活表面上產(chǎn)生c3b-ba復合物的廣泛沉積。因此，經(jīng)典和旁路補體途徑兩者都產(chǎn)生將c3因子分成c3a和c3b的c3轉(zhuǎn)化酶。在此時，這兩種c3轉(zhuǎn)化酶進一步組裝成c5轉(zhuǎn)化酶(c4b2a3b和c3b3bbb)。這些復合物隨后將補體成分c5切割成兩種成分：c5a多肽(9kda)和c5b多肽(170kda)。c5a多肽結合7跨膜g蛋白偶聯(lián)受體，其最初與白細胞相關，并且現(xiàn)在已知在多種組織(包括肝細胞和神經(jīng)元)上表達。c5a分子是人補體系統(tǒng)的主要趨化性成分，并且可以觸發(fā)多種生物應答，包括白細胞趨化性、平滑肌收縮、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑的激活、嗜中性粒細胞-內(nèi)皮粘附、細胞因子和脂質(zhì)介質(zhì)釋放和氧化劑形成。較大的c5b片段序貫結合補體級聯(lián)的后續(xù)組分，即c6、c7、c8和c9，以形成c5b-9膜攻擊復合物(“mac”)。親脂性c5b-9mac可直接溶解紅細胞，并且在更大量中，它對白細胞是溶解性的并且對組織如肌肉、上皮細胞和內(nèi)皮細胞是損傷性的。在亞溶解量中，c5b-9mac可刺激粘附分子的上調(diào)、胞內(nèi)鈣增加和細胞因子釋放。此外，在亞溶解濃度下，c5b-9mac可以刺激細胞如內(nèi)皮細胞和血小板而不引起細胞裂解。c5a和c5b-9mac的非溶解效應是相當且可互換的。雖然補體系統(tǒng)在維持健康方面具有重要的作用，但它具有引起或促成疾病的潛力。例如，研究已經(jīng)顯示了對補體級聯(lián)的抑制或補體成分的消減減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)變性性疾病中或?qū)嶒炐阅X損傷中的損害(參見例如feasby,t.e.等(1987)brainres.419:97-103；vriesendorp,f.j.等(1995)j.neuroimmunol.58:157-165；jung,s.等(1995)neurosci.lett.200:167-170；dailey,a.t.等(1998)j.neurosci.18:6713-6722；woodruff,t.m.等(2006)fasebj.20:1407-1417；leinhase,i.等(2006)bmsneurosci.14:7:55)。特別地，c6缺陷型并且因此不能形成膜攻擊復合物(mac)的大鼠既未表現(xiàn)出脫髓鞘也沒有軸突損傷，并且在與匹配的c6足夠的大鼠相比時顯著降低多發(fā)性硬化的抗體介導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型中的臨床評分(mead,r.j.等(2002)j.immunol.168:458-465)。然而，單核細胞浸潤水平與c6足夠的大鼠中看到的單核細胞浸潤水平相當。mead等(2002)推斷，脫髓鞘和軸突損傷在存在抗體的情況下發(fā)生，并且需要激活整個補體級聯(lián)，包括mac沉積，其可通過c6的消減抑制。因而，需要用于抑制c6的試劑，并且對于多種治療目的是理想的。發(fā)明概述本發(fā)明提供了抗c6抗體，其具有對治療目的期望的功能特性，包括有效抑制c6的功能活性，使得在體外和在體內(nèi)抑制膜攻擊復合物(mac)的形成的能力，以及非常低的kd(例如1x10-8m、1x10-9m、5x10-10m或更小)和非常長的半衰期(例如40小時或更多)。通過用純化的人c6蛋白免疫大鼠產(chǎn)生一組38種抗人c6抗體。在這38種中，2種顯示出抑制膜攻擊復合物(mac)形成。生成了一種具有這些期望的功能特性的特定大鼠抗人c6抗體(在本文中稱為7e5)，并且制備了保留7e5的cdr的一組人源化抗體，包括人源化單抗8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02。在所有81種可能的“混合和匹配”組合中表達這8種人源化單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)，以及人源化單抗7c02的重鏈可變區(qū)和人源化單抗7g08的輕鏈可變區(qū)，并且證明了所有81種配對有效抑制c6功能活性。此外，已經(jīng)在人c6內(nèi)定位7e5的表位。因而，在一方面，本發(fā)明涉及結合人c6的分離的抗體，其中所述抗體展現(xiàn)出以下特性的至少三種:(a)在溶血測定法中具有0.5μg/ml或更小的ic50；(b)具有1x10-8m或更小的kd，如通過表面等離振子共振確定；(c)具有40小時或更大的抗體-c6結合半衰期，如通過表面等離振子共振確定；和(d)與獼猴c6起交叉反應。涵蓋了至少三種上述特性的任何組合。在一個實施方案中，抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)和(c)。在另一個實施方案中，抗體表現(xiàn)出特性(a)、(b)、(c)和(d)。在其它實施方案中，抗體具有1x10-9m或更小或5x10-10m或更小的kd，如通過表面等離振子共振確定。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的抗體，其結合人c6中含有seqidno:52的殘基835-854的全部或部分的區(qū)域(即，抗體結合殘基835-854內(nèi)的一個或多個殘基)。在另一個實施方案中，抗體結合選自下組的氨基酸序列的全部或部分的表位：seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3(即，抗體結合seqidno.1、seqidno:2或seqidno:3內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基)。在某些實施方案中，表位是由抗體識別的不連續(xù)表位的部分。例如，在一個實施方案中，抗體結合包含選自下組的氨基酸序列的全部或部分的表位：seqidno:1、seqidno:2和seqidno:3，其中表位是不連續(xù)的。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了抗體，其與包含seqidno:5中顯示的重鏈可變區(qū)和seqidno:10中顯示的輕鏈可變區(qū)(即，單抗7e5的重鏈和輕鏈可變區(qū))的抗體交叉競爭對人c6的結合。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了與選自下組的單抗交叉競爭對人c6的結合的抗體：8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02。在多個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體、人源化抗體或嵌合的抗體。在多個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含分別在seqidno:6、7和8中顯示的重鏈cdr1、2和3序列，并且包含分別在seqidno:11、12和13中顯示的輕鏈cdr1、2和3序列。例如，抗體可為包含前述cdr的人源化抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供了結合人c6的分離的抗體，其中所述抗體包含seqidno:8中顯示的重鏈cdr3；和seqidno:13中顯示的輕鏈cdr3?？贵w可進一步包含seqidno:7中顯示的重鏈cdr2；和seqidno:12中顯示的輕鏈cdr2?？贵w可進一步包含seqidno:6中顯示的重鏈cdr1；和seqidno:11中顯示的輕鏈cdr1。包含前述cdr的抗體的代表性例子包括下列各項：(a)包含seqidno:30的重鏈可變區(qū)和seqidno:31的輕鏈可變區(qū)的抗體；(b)包含seqidno:32的重鏈可變區(qū)和seqidno:33的輕鏈可變區(qū)的抗體；(c)包含seqidno:34的重鏈可變區(qū)和seqidno:35的輕鏈可變區(qū)的抗體；(d)包含seqidno:36的重鏈可變區(qū)和seqidno:37的輕鏈可變區(qū)的抗體；(e)包含seqidno:38的重鏈可變區(qū)和seqidno:39的輕鏈可變區(qū)的抗體；(f)包含seqidno:40的重鏈可變區(qū)和seqidno:41的輕鏈可變區(qū)的抗體；(g)包含seqidno:42的重鏈可變區(qū)和seqidno:43的輕鏈可變區(qū)的抗體；和(h)包含seqidno:44的重鏈可變區(qū)和seqidno:45的輕鏈可變區(qū)的抗體。在又一個方面，本發(fā)明提供了結合人c6的分離的抗體，其包含：(a)重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno:30,32,34,36,38,40,42,44和46；和(b)輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含與選自下組的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列：seqidno:31,33,35,37,39,41,43,45和47。在其它實施方案中，重鏈和輕鏈可變區(qū)與前述氨基酸序列是95％、96％、97％、98％或99％相同的。在另一個實施方案中，分離的抗體是抗體，其中：(a)所述重鏈可變區(qū)包含選自下組的氨基酸序列：seqidno:30,32,34,36,38,40,42,44和46；和(b)所述輕鏈可變區(qū)包含選自下組的氨基酸序列：seqidno:31,33,35,37,39,41,43,45和47。本發(fā)明還涵蓋包含核苷酸序列的表達載體，及通過此類表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，和使用經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞重組表達抗體的方法，所述核苷酸序列編碼本發(fā)明的抗體的輕鏈、重鏈、或輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體以fab片段表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體以全長抗體表達，如igg4同種型抗體，如具有igg4(s228p)恒定區(qū)。還涵蓋包含本發(fā)明的抗體和藥學可接受載體的組合物，如包含本發(fā)明的抗體的藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明的抗體的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者中膜攻擊復合物(mac)形成或活性的方法，所述方法包括以有效抑制所述受試者中的mac形成或活性的量對所述受試者施用本發(fā)明的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療、預防受試者中由補體系統(tǒng)的不想要的活性介導的病癥或降低受試者中由補體系統(tǒng)的不想要的活性介導的病癥的癥狀的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了再生受試者中的神經(jīng)的方法，包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了促進受試者中受損傷或變性的神經(jīng)的恢復的方法，其包括對所述受試者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了降低或延遲受試者中的神經(jīng)變性的方法，其包括對所述受試者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。在一個實施方案中，所述受試者遭受神經(jīng)的物理損傷，如創(chuàng)傷性損傷(例如來自事故)、手術損傷或非創(chuàng)傷性損傷(例如神經(jīng)壓迫)。在一個實施方案中，損傷是對于周圍神經(jīng)系統(tǒng)(pns)的。在另一個實施方案中，損傷是對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的。在一個實施方案中，在損傷處或附近施用抗體。在另一個實施方案中，受試者患有免疫介導的炎性病癥或進行性神經(jīng)變性性病癥。在一個實施方案中，病癥是獲得性的。在另一個實施方案中，病癥是遺傳性的。在一個實施方案中，病癥是慢性脫髓鞘性神經(jīng)病，如多發(fā)性硬化(ms)。在另一個實施方案中，病癥是神經(jīng)變性性病癥，如重癥肌無力或肌萎縮側索硬化(als)。附圖簡述圖1a是柱狀圖，其顯示了使用來自用人c6免疫的兩只不同大鼠的38個雜交瘤的上清液的溶血測定法的結果，證明上清液11(其產(chǎn)生7e5單抗)具有最強的抑制效果。圖1b是柱狀圖，其顯示了使用來自用人c6免疫的兩只不同大鼠的38個雜交瘤的上清液的甘露聚糖激活的補體elisa的結果，證明了上清液11(其產(chǎn)生7e5單抗)具有最強的抑制效果。圖2是顯示重組大鼠7e5與人c6結合的biacore動力學的圖。圖3a-d的圖顯示了27b1單抗和7e5單抗之間的表位交叉阻斷實驗的結果，指示7e5占據(jù)與27b1不同的表位。圖4a是人c6部分氨基酸序列(seqidno:50)和大鼠c6部分氨基酸序列(seqidno:51)的比對，顯示了肽418的位置。圖4b是顯示肽418位置的人c6蛋白的示意圖。圖5的柱狀圖顯示了7e5在補充有人c6的c6缺陷型大鼠中體內(nèi)阻斷c6，如通過溶血測定法測量。大鼠接受指定量的人c6和抗體7e5。在y軸上繪制補體活性，其中o.d.1.0指示致敏紅細胞的最大溶解，而o.d.0指示溶解的缺乏。圖6a是大鼠抗c57e5單抗(seqidno:5)和人vh3_1種系(seqidno:48)的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的比對，其中標示差異。在比對下方標示了靶向用于人源化的氨基酸交換。圖6b是大鼠抗c57e5單抗(seqidno:10)和人vk2_5種系(seqidno:49)的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的比對，其中標示差異。在比對下方標示了靶向用于人源化的氨基酸交換。圖7a是顯示溶血測定法的結果的柱狀圖，其證明了9種人源化7e5變體vh鏈和9種人源化7e5變體vl鏈的所有81種可能組合的抑制活性(分別示于圖7a和7b中)。圖7b是顯示macelisa測定法的結果的柱狀圖，其證明了9種人源化7e5變體vh鏈和9種人源化7e5變體vl鏈的所有81種可能的組合的抑制活性(分別示于圖7a和7b中)。圖8a是7e5重鏈可變區(qū)(seqidno:5)的氨基酸序列與人源化7e5變體7c02(seqidno:46),7e11(seqidno:42),7e12(seqidno:32),7f02(seqidno:44),7f06(seqidno:38),7f11(seqidno:40),7g09(seqidno:34),8f07(seqidno:36)和8g09(seqidno:30)的重鏈氨基酸序列的比對。標示了保守的cdr1、2和3區(qū)。圖8b是7e5輕鏈可變區(qū)(seqidno:10)的氨基酸序列與人源化7e5變體7e11(seqidno:43),7e12(seqidno:33),7f02(seqidno:45),7f06(seqidno:39),7f11(seqidno:41),7g08(seqidno:47),7g09(seqidno:35),8f07(seqidno:37)和8g09(seqidno:31)的輕鏈氨基酸序列的比對。標示了保守的cdr1、2和3區(qū)。圖9顯示了與野生型7e5大鼠f’ab的親和力相比，8種人源化f’ab對人c6的親和力(biacore)。圖10顯示了體內(nèi)神經(jīng)擠壓實驗的結果。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了表現(xiàn)出有益功能特性的抗c6抗體。這些功能特征包括例如：(a)在溶血測定法中0.5μg/ml或更小的ic50；(b)5x10-10m或更小的kd，如通過表面等離振子共振確定；(c)40小時或更大的抗體-c6結合半衰期，如通過表面等離振子共振確定；和/或(d)與獼猴c6的交叉反應。在其它實施方案中，抗體包含特定的重鏈和輕鏈可變區(qū)和/或cdr序列。例如，提供9種人源化重鏈和9種人源化輕鏈可變區(qū)，其在鏈的所有81種可能的“混合和匹配”組合中表現(xiàn)出有效的c6抑制活性。在其它實施方案中，抗c6抗體與本文中公開的特定抗c6抗體如7e5,8g09,7e12,7g09,8f07,7f06,7f11,7e11或7f02結合相同的表位，或競爭結合c6。為了可以更容易理解本發(fā)明，首先定義某些術語。在整個詳細描述中闡述了其它定義。術語“c6”(也稱為“補體c6”或“補體組分c6”)是指與組分c5b、c7、c8和c9結合以形成c5b-c9膜攻擊復合物(mac)的補體級聯(lián)組分。術語“c6”包括天然表達的c6的任何變體或同種型。本發(fā)明的抗體可對人cd6是特異性的，并且可不表現(xiàn)出與其它物種的任何交叉反應性。或者，本發(fā)明的抗體可與來自除人以外的物種，如獼猴的c6起交叉反應。或者，本發(fā)明的抗體可與來自靈長類，如獼猴的c6起交叉反應，但不與非靈長類c6，如小鼠或大鼠c6起交叉反應。c6或其任何變體和同種型可從天然表達它們的細胞或組織分離或使用本領域公知的技術重組產(chǎn)生。(登錄號np_00110860.3)報告如下的人c6的氨基酸序列(seqidno:52)：1marrsvlyfillnalinkgqacfcdhyawtqwtscsktcnsgtqsrhrqivvdkyyqenf61ceqicskqetrecnwqrcpincllgdfgpwsdcdpciekqskvrsvlrpsqfggqpctap121lvafqpcipsklckieeadcknkfrcdsgrciarklecngendcgdnsderdcgrtkavc181trkynpipsvqlmgngfhflageprgevldnsftggicktvkssrtsnpyrvpanlenvg241fevqtaeddlktdfykdltslghnenqqgsfssqggssfsvpifysskrseninhnsafk301qaiqashkkdssfirihkvmkvlnfttkakdlhlsdvflkalnhlpleynsalysrifdd361fgthyftsgslggvydllyqfsseelknsglteeeakhcvrietkkrvlfakktkvehrc421ttnklsekhegsfiqgaeksislirggrseygaalawekgssgleektfsewlesvkenp481avidfelapivdlvrnipcavtkrnnlrkalqeyaakfdpcqcapcpnngrptlsgtecl541cvcqsgtygencekqspdyksnavdgqwgcwsswstcdatykrsrtrecnnpapqrggkr601cegekrqeedctfsimenngqpcinddeemkevdlpeieadsgcpqpvppengfirnekq661lylvgedveiscltgfetvgyqyfrclpdgtwrqgdvecqrtecikpvvqevltitpfqr721lyrigesieltcpkgfvvagpsrytcqgnswtppisnsltcekdtltklkghcqlgqkqs781gsecicmspeedcshhsedlcvfdtdsndyftspackflaekclnnqqlhflhigscqdg841rqlewglertrlssnstkkescgydtcydwekcsastskcvcllppqcfkggnqlycvkm901gsstsektlnicevgtircanrkmeilhpgkcla如本文中提及，術語“抗體”包括全抗體和其任何抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或單鏈。在一個優(yōu)選的實施方案中，“抗體”是指包含通過二硫鍵相互連接的至少兩個重(h)鏈和兩個輕(l)鏈的糖蛋白或其抗原結合部分。每個重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個域ch1、ch2和ch3組成。每個輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個域cl組成。vh和vl區(qū)可進一步細分為高變性區(qū)域，稱作互補決定區(qū)(cdr)，穿插有更保守的區(qū)域，稱作框架區(qū)(fr)。每個vh和vl由以如下順序從氨基末端到羧基末端排列的三個cdr和四個fr組成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應細胞))和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(clq)的結合。如本文中使用，術語抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保留特異性結合抗原(例如人c6)的能力的一種或多種抗體片段。此類“片段”的長度為例如約8至約1500個氨基酸，合適地長度為約8至約745個氨基酸，合適地長度為約8至約300個，例如約8至約200個氨基酸，或約10至約50或100個氨基酸。已經(jīng)顯示抗體的抗原結合功能可通過全長抗體的片段進行。在術語抗體的“抗原結合部分”內(nèi)涵蓋的結合片段的實例包括(i)fab片段，即由vl、vh、cl和ch1域組成的單價片段；(ii)f(ab’)2片段，即包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋連接的兩個fab片段的二價片段；(iii)由vh和ch1域組成的fd片段；(iv)由抗體單臂的vl和vh域組成的fv片段，(v)由vh域組成的dab片段(ward等,(1989)nature341:544-546)；和(vi)分離的互補決定區(qū)(cdr)或(vii)可以任選地通過合成接頭連接的兩個或更多個分離的cdr的組合。此外，盡管fv片段兩個域vl和vh由不同的基因編碼，但是它們可以通過合成接頭使用重組方法連接，所述合成接頭使它們能夠以單個蛋白質(zhì)鏈生成，其中vl和vh區(qū)配對以形成單價分子(稱為單鏈fv(scfv))；參見例如bird等(1988)science242:423-426；以及huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意圖涵蓋在術語抗體的“抗原結合部分”內(nèi)。使用本領域技術人員已知的常規(guī)技術獲得這些抗體片段，并以與完整抗體相同的方式篩選片段的效用?？梢酝ㄟ^重組dna技術或?qū)ν暾拿庖咔虻鞍椎拿复倩蚧瘜W切割產(chǎn)生抗原結合部分。“雙特異性”或“雙功能抗體”是具有兩個不同重/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜合抗體?？赏ㄟ^多種方法產(chǎn)生雙特異性抗體，所述方法包括雜交瘤的融合或fab’片段的連接。參見例如songsivilai&lachmann,clin.exp.immunol.79:315-321(1990)；kostelny等,j.immunol.148,1547-1553(1992)。如本文中使用，術語“單克隆抗體”是指對特定表位展示單一結合特異性和親和力的抗體。因而，術語“人單克隆抗體”是指展示單一結合特異性并且具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和任選恒定區(qū)的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體由包含與永生化細胞融合的從轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的b細胞的雜交瘤產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因非人動物具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。如本文中使用，術語“重組抗體”包括通過重組手段制備、表達、創(chuàng)建或分離的所有嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，如(a)從動物(例如小鼠)或自其制備的雜交瘤分離的抗體，所述動物對于人免疫球蛋白基因是轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的，(b)從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達抗體的宿主細胞，例如從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，(c)從重組組合人或人源化抗體文庫分離的抗體，和(d)通過牽涉將人免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列的任何其它手段制備、表達、創(chuàng)建或分離的抗體。術語“人源化抗體”是指具有來自人種系序列的框架區(qū)和來自非人物種(例如，小鼠、大鼠、兔)的cdr的抗體，并且包括例如其中的人框架區(qū)和/或cdr已進行特異性位點定向誘變以優(yōu)化結合。實施例8中描述了人源化抗c6抗體的制備的示例性描述。術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)(如果存在的話)的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或體內(nèi)體細胞突變引入的突變)(參見lonberg,n.等(1994)nature368(6474):856-859)；lonberg,n.(1994)handbookofexperimentalpharmacology113:49-101；lonberg,n.和huszar,d.(1995)intern.rev.immunol.vol.13:65-93,以及harding,f.和lonberg,n.(1995)ann.n.y.acad.sci764:536-546)。然而，術語“人抗體”不包括其中源自另一種哺乳動物物種，如小鼠的種系的cdr序列已經(jīng)被嫁接到人框架序列上的抗體(即人源化抗體)。如本文中使用，“分離的抗體”是指基本上不含具有不同抗原性特異性的其它抗體的抗體(例如，特異性結合人c6的分離的抗體基本上不含特異性結合與人c6不同的抗原的抗體)。然而，特異性結合表位的分離的抗體可與來自不同物種的其它c6蛋白具有交叉反應性。然而，抗體優(yōu)選總是結合人c6。另外，分離的抗體通?；旧喜缓渌毎牧虾?或化學物質(zhì)。在本發(fā)明的一個實施方案中，將具有不同c6特異性的“分離的”抗體的組合組合成明確定義的組合物。術語“表位”或“抗原決定簇”是指免疫球蛋白或抗體特異性結合的抗原上的位點?？蓮倪B續(xù)的氨基酸或通過蛋白質(zhì)的三級折疊并置的不連續(xù)氨基酸形成表位。從連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性溶劑時保留，而通過三級折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時喪失。表位通常包含獨特的空間構象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸。用于確定何種表位被給定抗體結合的方法(即，表位定位)是本領域中公知的的，且包括例如免疫印跡和免疫沉淀測定法，其中測試來自c6的重疊或連續(xù)肽與給定抗c6抗體的反應性。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文中所述的技術，例如，x射線晶體學和二維核磁共振(參見例如epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,第66卷,g.e.morris編(1996))。術語“不連續(xù)表位”是指由不連續(xù)氨基酸構成的表位。例如，表位可以包括來自人c6的多個區(qū)域的殘基，其在構象折疊時被帶到一起(接近)，使得抗體結合每個區(qū)域內(nèi)的一個或多個殘基。術語“表位定位”是指鑒定抗體-抗原識別的分子決定簇的過程。術語“結合相同表位”在提及兩種或更多種抗體的情況下意指抗體競爭與抗原的結合并且結合相同、重疊或涵蓋的連續(xù)或不連續(xù)的氨基酸區(qū)段。本領域技術人員理解，短語“結合相同表位”并不一定意味著抗體結合完全相同的氨基酸。抗體結合的精確氨基酸可以不同。例如，第一抗體可以結合由第二抗體結合的氨基酸區(qū)段完全涵蓋的氨基酸區(qū)段。在另一個實例中，第一抗體結合與由第二抗體結合的一個或多個區(qū)段顯著重疊的一個或多個氨基酸區(qū)段。為了本文的目的，認為是此類抗體“結合相同的表位”。如本文中使用，術語“特異性結合”和“選擇性結合”是指結合預定抗原上的表位的抗體。通常，使用重組人c6作為分析物和抗體作為配體，在通過biacore2000儀中的表面等離振子共振(spr)技術確定時，抗體以約小于10-7m，如約小于10-8m、10-9m或10-10m或甚至更低的平衡解離常數(shù)(kd)結合，并且以下述親和力結合預先確定的抗原，所述親和力是其對除預先確定的抗原或緊密相關抗原之外的非特異性抗原(例如bsa，酪蛋白)的結合親和力的至少2倍。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異性的抗體”在本文中與“特異性結合抗原的抗體”可互換使用。如本文中使用，術語“kd”意圖指特定的抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。通常，使用重組人c6作為分析物和抗體作為配體，在通過biacore2000儀中的表面等離振子共振(spr)技術確定時，本發(fā)明的抗體以約小于10-8m、10-9m或10-10m或甚至更低的平衡解離常數(shù)(kd)結合c6。如本文中使用，術語“kd”意圖指抗體與抗體/抗原復合物解離的解離速率常數(shù)。如本文中使用，術語“ka”意圖指抗體與抗原結合的結合速率常數(shù)。如本文中使用，術語“ic50”是指在體外或體內(nèi)測定法中將給定的生物應答抑制一半需要的抗體或其抗原結合部分的濃度。也就是說，它是抗體或其抗原結合部分的半最小(50％)抑制濃度(ic)。如本文中使用，“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類(例如igm或igg1)。在一個實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體是igg1同種型的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體是igg2同種型的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體是igg4同種型的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體是igg4(s228p)同種型的(即，在氨基酸位置228處具有野生型絲氨酸殘基的脯氨酸取代的igg4同種型)。術語“結合固定化的c6”是指本發(fā)明的人抗體結合例如在細胞表面上表達或附著到固體支持物的c6的能力。如本文中使用，術語“起交叉反應”是指本發(fā)明的抗體結合來自不同物種的c6的能力。例如，結合人c6的本發(fā)明的抗體也可結合另一種c6，如獼猴。如本文中使用，通過檢測結合測定法(例如spr，elisa)中與純化的抗原的特異性反應性或與生理性表達c6的細胞的結合或以其它方式功能性相互作用測量交叉反應性。用于測定交叉反應性的方法包括如本文中所述的標準結合測定法，例如通過使用biacoretm2000spr儀(biacoreab,uppsala,sweden)的biacoretm表面等離振子共振(spr)分析或流式細胞技術。如本文中使用，“糖基化模式”定義為共價附著到蛋白質(zhì)，更具體地免疫球蛋白蛋白質(zhì)的糖單元的模式。當本領域普通技術人員會將異源抗體的糖基化模式識別為比衍生轉(zhuǎn)基因的ch基因的物種更類似于非人轉(zhuǎn)基因動物物種中的所述糖基化模式時，可將異源抗體的糖基化模式表征為基本上類似于在由非人轉(zhuǎn)基因動物物種產(chǎn)生的抗體上天然存在的糖基化模式。如本文中使用，術語“天然存在”在應用于對象時是指在自然界中可以找到對象的事實。例如，存在于生物體(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的，其可從天然來源分離并且尚未在實驗室中人為有意修飾。如本文中使用，術語“重排”是指重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的構造，其中v區(qū)段緊鄰分別編碼基本上完整的vh或vl域的構造中的d-j或j區(qū)段定位?？赏ㄟ^與種系dna比較來鑒定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座會具有至少一個重組七聚體/九聚體同源性元件。如本文中使用，術語“未重排”或“種系構造”在提及v區(qū)段時是指其中未重組v區(qū)段以便緊鄰d或j區(qū)段的構型。如本文中使用，術語“核酸分子”意圖包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈dna。如本文中使用，術語“分離的核酸分子”在提及編碼結合c6的抗體或抗體部分(例如vh、vl、cdr3)的核酸時意圖指下述核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼結合除c6以外的抗原的抗體或抗體部分的其它核苷酸序列，所述其它序列在人基因組dna中可天然地在所述核酸側翼。例如，seqidno:14、16、18、20、22、24、26和28分別對應于編碼抗c6單克隆抗體8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02的重鏈(vh)可變區(qū)的核苷酸序列。seqidno:15、17、19、21、23、25、27和29分別對應于編碼抗c6單克隆抗體8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02的輕鏈(vh)可變區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明還涵蓋seqidno:4-47中列出的序列的“保守序列修飾”，即不消除由核苷酸序列編碼或含有氨基酸序列的抗體對抗原的結合的核苷酸和氨基酸序列修飾。此類保守序列修飾包括保守核苷酸和氨基酸取代，以及核苷酸和氨基酸的添加和缺失。例如，可以通過本領域已知的標準技術(如定點誘變和pcr介導的誘變)將修飾引入到seqidno:4-47中。保守氨基酸取代包括氨基酸殘基用具有相似側鏈的氨基酸殘基替換的取代。已經(jīng)在本領域中定義具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸，谷氨酸)、不帶電極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支鏈側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，人抗c6抗體中預測的非必需氨基酸殘基優(yōu)選用來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替換。鑒定不消除抗原結合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本領域中公知的(參見例如brummell等,biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等proteineng.12(10):879-884(1999)；以及burks等proc.natl.acad.sci.usa94:412-417(1997))?；蛘?，在另一個實施方案中，可如通過飽和誘變沿著整個或部分抗-c6抗體編碼序列隨機引入突變，并且可篩選所得的修飾的抗c6抗體的結合活性。對于核酸，術語“實質(zhì)性同源性”指兩個核酸或其指定序列當在最佳比對和比較時在適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔У那闆r下在至少約80％的核苷酸，通常至少約90％至95％，更優(yōu)選至少約98％至99.5％的核苷酸中是相同的。或者，當區(qū)段在選擇性雜交條件下與鏈的互補物雜交時存在實質(zhì)性同源性。兩個序列之間的百分比同一性是由序列共享的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同源性＝相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)x100)，當需要引入以實現(xiàn)兩個序列的最佳比對時考慮缺口的數(shù)目和每個缺口的長度。可使用如下面非限制性實例中所述的數(shù)學算法來完成序列的比較和兩個序列之間的百分比同一性的測定?？墒褂胓cg軟件包(在http://www.gcg.com可獲得)中的gap程序使用nwsgapdna.cmp矩陣和缺口權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6確定兩個核苷酸序列之間的百分比同一性?？墒褂靡呀?jīng)并入align程序(第2.0版)中的e.meyers和w.miller(cabios,4:11-17(1989))的算法，使用pam120權重殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4確定兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性。另外，可使用已經(jīng)并入gcg軟件包(在http://www.gcg.com可獲得)中的gap程序中的needleman和wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法，使用blossum62矩陣或pam250矩陣，以及缺口權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6確定兩個氨基酸序列之間的百分比同一性。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列還可用作“查詢序列”以對公共數(shù)據(jù)庫進行搜索，以例如鑒定相關序列。可使用altschul,等(1990)j.mol.biol.215:403-10的nblast和xblast程序(第2.0版)進行此類搜索?？捎胣blast程序，得分＝100，字長＝12進行blast核苷酸搜索以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？捎脁blast程序，得分＝50，字長＝3進行blast蛋白質(zhì)搜索以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對，可如altschul等,(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402所述利用缺口blast。當利用blast和缺口blast程序時，可使用相應程序(例如，xblast和nblast)的默認參數(shù)。見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)可存在于全細胞、細胞裂解物中或以部分純化或基本上純的形式存在。當通過標準技術(包括堿/sds處理、cscl分帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領域公知的其它技術)從其它細胞組分或其它污染物(例如其它細胞核酸或蛋白質(zhì))純化時，核酸或蛋白質(zhì)是“分離的”或“變得基本上純”。參見f.ausubel等編currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishing和wileyinterscience,newyork(1987)?？筛鶕?jù)標準技術突變來自cdna、基因組或其混合物的本發(fā)明的核酸組合物(雖然經(jīng)常為天然序列(除了經(jīng)修飾的限制性位點等外))以提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可根據(jù)需要影響氨基酸序列。特別地，涵蓋與本文中所述的天然v、d、j、恒定、轉(zhuǎn)換和其它此類序列基本上同源或從它們衍生的dna序列(其中“衍生”指示序列與另一序列相同或從另一序列修飾)。當將核酸與另一種核酸序列置于功能關系中時，它是“可操作連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列可操作連接。就轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列而言，可操作連接意味著連接的dna序列是連續(xù)的，并且在必需連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時是連續(xù)的且符合讀碼框。對于轉(zhuǎn)換序列，可操作連接指示序列能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)換重組。如本文中使用，術語“載體”意圖指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一核酸的核酸分子。一類載體是“質(zhì)粒”，其是指可以連接另外的dna區(qū)段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。另一類載體是病毒載體，其中可以將另外的dna區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加體哺乳動物載體)?？稍趯胨拗骷毎泻髮⑵渌d體(例如非附加體哺乳動物載體)整合到宿主細胞的基因組中，并由此與宿主基因組一起復制。而且，某些載體能夠指導與它們可操作連接的基因的表達。此類載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。通常，在重組dna技術中效用的表達載體通常為質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括表達載體的此類其它形式，例如發(fā)揮等同功能的病毒載體(例如復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。如本文中使用，術語“重組宿主細胞”(或簡稱“宿主細胞”)意圖指已經(jīng)導入有重組表達載體的細胞。應當理解，此類術語不僅意圖指特定的受試細胞，而是指此類細胞的后代。由于某些修飾可以由于突變或環(huán)境影響而在后代中發(fā)生，此類后代實際上可以不與親本細胞相同，但仍包括在如本文中使用的術語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。如本文中使用，術語“連接”是指兩個或更多個分子的結合。連接可以是共價或非共價的。連接也可以是遺傳的(即重組融合的)?？墒褂脴O其多種公認的技術，如化學綴合和重組蛋白質(zhì)生成來實現(xiàn)此類連接。如本文中使用，術語“抑制”或“阻斷”(例如，指通過抗c6抗體抑制/阻斷mac形成)可互換使用，并且涵蓋部分和完全抑制/阻斷。c6的抑制/阻斷優(yōu)選降低或改變當c6不被阻斷或抑制時發(fā)生的正常活性水平或類型。抑制和阻斷也意圖包括與未與抗c6抗體接觸的c6相比，與抗c6抗體接觸時c6的結合或活性的任何可測量的降低，例如將c6的結合或活性抑制至少約10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％。在一個實施方案中，抗c6抗體將c6的結合或活性抑制至少約70％。在另一個實施方案中，抗c6抗體將c6的結合或活性抑制至少80％。如本文中使用，術語“治療”和“處理”是指本文所述的治療或預防措施。“治療”的方法采用對需要此類治療，本發(fā)明的抗體的受試者施用，例如需要此類治療的受試者。術語“有效劑量”或“有效劑”定義為足以實現(xiàn)或至少部分實現(xiàn)期望效果的量。術語“治療有效劑量”定義為足以治愈或至少部分阻止已經(jīng)患有該疾病的患者中的疾病及其并發(fā)癥的量。對此用途有效的量將取決于所治療的病癥的嚴重性和患者自身的免疫系統(tǒng)的一般狀態(tài)。術語“患者”包括接受預防性或治療性處理的人和其它哺乳動物受試者。如本文中使用，術語“受試者”包括任何人或非人動物。例如，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療患有免疫病癥的受試者。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類、羊、狗、牛、雞、兩棲類、爬行類等。將在以下小節(jié)中進一步詳細描述本發(fā)明的各個方面。i.針對c6的抗體的生成本發(fā)明涵蓋結合c6，例如人c6的抗體，例如人源化抗體。結合c6的示例性單克隆抗體包括7e5、8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02，其重鏈可變區(qū)分別在seqidno:5、30、32、34、36、38、40、42和44中顯示，并且其輕鏈可變區(qū)分別在seqidno:10、31、33、35、37、39、41、43和45中顯示。這些抗體的重鏈cdr1、2和3分別在seqidno:6、7和8中顯示，而這些抗體的輕鏈cdr1、2和3分別在seqidno:11、12和13中顯示?？墒褂枚喾N已知技術，如由kohler和milstein,nature256:495(1975)描述的標準體細胞雜交技術制備本發(fā)明的單克隆抗體。盡管體細胞雜交程序是優(yōu)選的，但是原則上也可以采用用于生成單克隆抗體的其它技術，例如b淋巴細胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化、使用人抗體基因文庫的噬菌體展示技術和人源化技術，如實施例6中描述的技術。因而，在一個實施方案中，雜交瘤方法用于產(chǎn)生結合人c6的抗體。在此方法中，可用合適的抗原免疫大鼠、小鼠或其它合適的宿主動物，以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生將特異性結合用于免疫的抗原的抗體的淋巴細胞。如實施例1中所述，特別適合于生成抗人c6抗體的宿主動物是c6缺陷型大鼠(c6-/-大鼠)，使得認為用人c6的免疫是完全“外來的”?？稍诤线m的測定法中測試來自經(jīng)免疫的宿主動物的上清液以檢測抗c6活性，如實施例1中詳細描述的溶血測定法或macelisa，以鑒定表達具有c6抑制活性的抗體的宿主動物。然后，使用合適的融合劑(如聚乙二醇)將來自所選擇的宿主動物的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞(goding,monoclonalantibodies:principles和practice,第59-103頁(academicpress,1986))。示例性融合配偶體是y3-ag1.2.3細胞，盡管本領域中已知的其它骨髓瘤細胞，如sp2/0-ag8.653細胞(atcc，crl1580)也是合適的。對雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生，如用溶血測定法和/或macelisa。在鑒定產(chǎn)生期望特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細胞之后，通過有限稀釋程序?qū)⒖寺喛寺〔⑼ㄟ^標準方法(goding,monoclonalantibodies:principles和practice,pp.59-103(academicpress,1986))培養(yǎng)。用于此目的的合適的培養(yǎng)基包括例如d-mem或rpmi-1640培養(yǎng)基。另外，可在動物中在體內(nèi)以腹水腫瘤培養(yǎng)雜交瘤細胞?？赏ㄟ^常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，如例如蛋白a-sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離由亞克隆分泌的單克隆抗體。在實施例1中詳細描述了分泌抗c6抗體的雜交瘤的制備的示例性非限制性實例?？墒褂帽绢I域中已知的方法將非人單克隆抗體，如大鼠或小鼠抗體進行人源化。例如，如實施例6中詳細描述，可使用hwang,w.y等(2205)methods36:35-42中描述的方法對大鼠抗人c6單抗進行人源化。此方法基于以下原則：如果非人和人抗體具有相似結構的cdr，則人框架也將支持非人cdr，親和力得到良好保留。因此，在此方法中，基于人cdr與待人源化的抗體的cdr的結構相似性(相同chothia規(guī)范結構)，從人種系基因的組選擇人框架序列。產(chǎn)生含有偏離的fr殘基的fab變體序列的噬菌體展示文庫。在親和力驅(qū)動的選擇之后，篩選單個克隆的結合和解離速率，并且確定序列人同一性和同源性。本領域中完善建立的用于cdr嫁接和人源化的其它辦法和方法也可用于產(chǎn)生本發(fā)明的人源化抗c6抗體。在另一個實施方案中，可從使用例如mccafferty等,nature,348:552-554(1990).clackson等,nature,352:624-628(1991),marks等,j.mol.biol.,222:581-597(1991)和hoet等(2005)naturebiotechnology23,344-348；ladner等的美國專利號5,223,409；5,403,484；和5,571,698；dower等的美國專利號5,427,908和5,580,717；mccafferty等的美國專利號5,969,108和6,172,197；以及griffiths等的美國專利號5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081中所述的技術產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫分離結合人c6的抗體和抗體部分。另外，也可使用通過鏈改組(marks等,bio/technology,10:779-783(1992))生成高親和力(nm范圍)人抗體，以及組合感染和體內(nèi)重組作為用于構建非常大的噬菌體文庫的策略(waterhouse等,nuc.acids.res.,21:2265-2266(1993))。在一個實施方案中，使用由hoet等，同上所述的噬菌體展示技術產(chǎn)生結合人c6的抗體。此技術牽涉產(chǎn)生人fab文庫，其具有從人供體分離的免疫球蛋白序列的獨特組合并且在重鏈cdr中具有合成多樣性。然后，對文庫篩選結合人c6的fab。在一個實施方案中，使用攜帶人免疫系統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)的部分的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生針對c6的抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明采用轉(zhuǎn)基因小鼠，本文稱為“humab小鼠”，其含有編碼未重排的人重(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座，以及使內(nèi)源性μ和κ鏈基因座失活的靶向突變(lonberg,n.等(1994)nature368(6474):856-859)。因而，小鼠表現(xiàn)出降低的小鼠igm或κ表達，并且響應免疫，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細胞突變以產(chǎn)生高親和力的人iggκ1單克隆抗體(lonberg,n.等(1994),同上；綜述于lonberg,n.(1994)handbookofexperimentalpharmacology113:49-101；lonberg,n.和huszar,d.(1995)intern.rev.immunol.第13卷:65-93,和harding,f.和lonberg,n.(1995)ann.n.y.acad.sci764:536-546)。humab小鼠的制備記載于taylor,l.等(1992)nucleicacidsresearch20:6287-6295；chen,j.等(1993)internationalimmunology5:647-656；tuaillon等(1993)proc.natl.acad.sciusa90:3720-3724；choi等(1993)naturegenetics4:117-123；chen,j.等(1993)emboj.12:821-830；tuaillon等(1994)j.immunol.152:2912-2920；lonberg等,(1994)nature368(6474):856-859；lonberg,n.(1994)handbookofexperimentalpharmacology113:49-101；taylor,l.等(1994)internationalimmunology6:579-591；lonberg,n.和huszar,d.(1995)intern.rev.immunol.vol.13:65-93；harding,f.和lonberg,n.(1995)ann.n.y.acad.sci764:536-546；fishwild,d.等(1996)naturebiotechnology14:845-851。進一步參見美國專利號5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；均屬lonberg和kay，以及genpharminternational；surani等的美國專利號5,545,807；1998年6月11日公布的國際公開號wo98/24884；1994年11月10日公布的wo94/25585；1993年6月24日公布的wo93/1227；1992年12月23日公布的wo92/22645；1992年3月19日公布的wo92/03918。在另一個實施方案中，可使用在轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠(如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠)生成本發(fā)明的人抗體。在ishida等的pct公開文本wo02/43478中詳細描述了本領域中稱為“km小鼠”的此類小鼠。此外，表達人免疫球蛋白基因的備選轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)是本領域中可用的，并且可用于生成本發(fā)明的抗c6抗體。例如，可使用稱為xenomouse(abgenix,inc.)的備選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；此類小鼠記載于例如kucherlapati等的美國專利號5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963。此外，表達人免疫球蛋白基因的備選轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)是本領域中可用的，并且可用于生成本發(fā)明的抗c6抗體。例如，可使用攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，在本領域中稱為“tc小鼠”；此類小鼠記載于tomizuka等(2000)proc.natl.acad.sci.usa97:722-727。此外，本領域中已經(jīng)描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的牛(kuroiwa等(2002)naturebiotechnology20:889-894)，并且可用于生成本發(fā)明的抗c6抗體。也可應用用于生成人抗體的本領域中描述的另外的小鼠系統(tǒng)以生成本發(fā)明的抗c6抗體，包括但不限于(i)小鼠(regeneronpharmaceuticals,inc.)，其中已經(jīng)經(jīng)由同源重組用可操作連接到內(nèi)源小鼠恒定區(qū)的人重鏈和輕鏈可變區(qū)替換內(nèi)源性小鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)，使得在小鼠中生成嵌合抗體(人v/小鼠c)，然后隨后使用標準重組dna技術轉(zhuǎn)化為完全人抗體；和(ii)小鼠(merusbiopharmaceuticals,inc.)，其中小鼠含有未重排的人重鏈可變區(qū)，但是單個重排的人共同輕鏈可變區(qū)。此類小鼠及其生成抗體的用途記載于例如wo2009/15777,us2010/0069614,wo2011/072204,wo2011/097603,wo2011/163311,wo2011/163314,wo2012/148873,us2012/0070861和us2012/0073004。也可使用scid小鼠制備本發(fā)明的人單克隆抗體，已經(jīng)對所述scid小鼠中重建人免疫細胞，使得可在免疫后產(chǎn)生人抗體應答。此類小鼠記載于例如wilson等的美國專利號5,476,996和5,698,767。生成針對c6的單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的產(chǎn)生也可使用例如本領域中公知的重組dna技術和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(morrison,s.(1985)science229:1202)在宿主細胞轉(zhuǎn)染瘤中生成本發(fā)明的抗體。在實施例5(其中在hek-293宿主細胞中使用pmqr表達載體)、實施例6(在大腸桿菌宿主細胞中使用pcb4表達載體表達fab)和實施例7(cho細胞表達)中進一步描述了用于重組表達抗c6抗體的示例性實施方案。此外，在一個實施方案中，可將感興趣的基因(例如，抗體基因)連接到表達載體如真核表達質(zhì)粒中，如wo87/04462，wo89/01036和ep338841中公開的gs基因表達系統(tǒng)或本領域中公知的其它表達系統(tǒng)使用的。可以在真核宿主細胞如cho細胞或nso細胞或者備選其它真核細胞，如植物衍生的細胞、真菌或酵母細胞中導入具有克隆的抗體基因的純化質(zhì)粒。用于導入這些基因的方法可為本領域中描述的方法，如電穿孔、lipofectine、lipofectamine等。在宿主細胞中導入這些抗體基因后，可鑒定和選擇表達抗體的細胞。這些細胞代表轉(zhuǎn)染瘤，然后可擴增所述轉(zhuǎn)染瘤實現(xiàn)其表達水平并放大以產(chǎn)生抗體。可從這些培養(yǎng)上清液和/或細胞中分離和純化重組抗體。或者，這些克隆的抗體基因可在其它表達系統(tǒng)如大腸桿菌中或在完整的生物體中表達，或可合成表達。交叉競爭和相同表位結合抗體如實施例3中詳細描述，已經(jīng)通過丙氨酸掃描誘變將7e5抗體結合的表位定位到對應于seqidno:52(人c6)的氨基酸835-854的人c6的區(qū)域內(nèi)的殘基。還顯示了seqidno:1、2和3中所示的特定肽含有形成7e5結合的表位部分的殘基。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了結合人c6的表位的抗體，所述表位包含seqidno:52的殘基835-854的全部或部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了結合人c6的表位的抗體，所述表位包含seqidno:52的殘基835-854的全部或部分，其中所述表位是不連續(xù)的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了結合人c6表位的抗體，所述表位包含選自seqidno:1、2和3的氨基酸序列的全部或部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了結合人c6表位的抗體，所述表位包括選自seqidno:1、2和3的氨基酸序列的全部或部分，其中所述表位是不連續(xù)的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了與包含seqidno:5中顯示的重鏈可變區(qū)和seqidno:10中顯示的輕鏈可變區(qū)(7e5的vh和vl序列)的抗體交叉競爭對人c6的結合的抗體。在其它實施方案中，本發(fā)明的抗體與本文中所述的其它抗c6抗體如8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11或7f02交叉競爭對c6的結合。此類競爭性抗體可基于其在標準c6結合測定法中競爭性抑制單抗7e5、8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11、7f02中的一種或多種結合c6的能力來鑒定。用于檢查交叉競爭對c6的結合的示例性測定法是實施例3中詳細描述的表位夾心elisa。此外，可使用其它常規(guī)技術鑒定識別相同表位或競爭結合的抗體。此類技術包括例如免疫測定法，其顯示一種抗體阻斷另一抗體與靶抗原的結合的能力，即競爭性結合測定法。在測定法中測定競爭性結合，其中所測試的免疫球蛋白抑制參照抗體對共同抗原如c6的特異性結合。許多類型的競爭性結合測定法是已知的，例如：固相直接或間接放射免疫測定法(ria)、固相直接或間接酶免疫測定法(eia)、夾心競爭測定法(參見stahli等,methodsinenzymology9:242(1983))；固相直接生物素-親合素eia(參見kirkland等,j.immunol.137:3614(1986))；固相直接標記測定法、固相直接標記夾心測定法(參見antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborpress(1988))；使用i-125標記物的固相直接標記物ria(參見morel等,mol.immunol.25(1):7(1988))；固相直接生物素-親合素eia(cheung等,virology176:546(1990))；和直接標記的ria(moldenhauer等,scand.j.immunol.32:77(1990))。通常，此類測定法牽涉使用與固體表面結合的純化抗原或攜帶這些之任一種，即未標記的測試免疫球蛋白和經(jīng)標記的參照免疫球蛋白的細胞。通過測定在存在測試免疫球蛋白的情況下與固體表面或細胞結合的標記物的量來測量競爭性抑制。通常測試免疫球蛋白過量存在。通常，當競爭性抗體過量存在時，它將抑制參照抗體與共同抗原的特異性結合達至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更多。因而，本發(fā)明還涵蓋與c6上的表位結合的抗體，所述表位包含由本文所述的特定抗體識別的表位的全部或部分(例如，相同或重疊區(qū)域或區(qū)域之間或跨越區(qū)域的區(qū)域)。在一個實施方案中，競爭對c6的結合和/或結合人c6上的相同表位的抗體是人源化抗體。可制備和分離此類人源化單克隆抗體，例如，如實施例6中所述。用于測定抗體結合的表位的其它技術包括例如表位定位方法，如提供表位的原子分辨率的抗原:抗體復合物晶體的x射線分析。其它方法監(jiān)測抗體與抗原片段或抗原的突變變異的結合，其中由于抗原序列內(nèi)的氨基酸殘基的修飾導致的結合喪失通常認為是表位成分的指示。另外，還可使用用于表位定位的計算組合方法。這些方法依賴于感興趣的抗體從組合噬菌體展示肽文庫親和分離特異性短肽的能力。然后，將肽視為用于限定與用于篩選肽文庫的抗體對應的表位的前導物。對于表位定位，還已經(jīng)開發(fā)出已經(jīng)顯示定位構象不連續(xù)表位的計算算法。一旦已經(jīng)分離出具有本文中所述的期望特性的單一原型抗c6單抗，直接的是通過使用本領域已知的方法產(chǎn)生具有相似性質(zhì)，例如具有相同表位的其它單抗。例如，可用如本文中所述的c6免疫小鼠或大鼠，產(chǎn)生雜交瘤，并且對所得的單抗篩選與原型單抗競爭結合c6的能力。也可用含有原型單抗結合的表位的c6的較小片段免疫大鼠或小鼠。可通過例如篩選與一系列跨越c6的重疊肽的結合來定位表位?；蛘?，jespers等,biotechnology12:899,1994的方法可用于引導與原型單抗具有相同表位并且因此具有相似特性的單抗的選擇。使用噬菌體展示，首先將原型抗體的重鏈與(優(yōu)選人)輕鏈的全集配對以選擇c6結合性單抗，然后將新的輕鏈與(優(yōu)選人)重鏈的全集配對以選擇具有與原型單抗具有相同表位的(優(yōu)選人)c6結合性單抗?；蛘?，通過誘變編碼抗體的重鏈和輕鏈的cdna可獲得原型單抗的變體?？蛇M行表位定位(例如，如champe等(1995)j.biol.chem.270:1388-1394描述)以確定抗體是否結合感興趣的表位。如由cunningham和wells(1989)science244:1081-1085所述的“丙氨酸掃描誘變”，或人c6中氨基酸殘基的點誘變的某些其它形式也可用于確定本發(fā)明的抗c6抗體的功能性表位。然而，誘變研究也可揭示對c6的總體三維結構至關重要，但不直接參與抗體-抗原接觸的氨基酸殘基，因此其它方法可以是必需的以確認使用此方法確定的功能性表位。也可通過評估抗體與包含人c6片段的肽的結合而確定由特異性抗體結合的表位。可合成涵蓋c6序列的一系列重疊肽并篩選結合，例如在直接elisa、競爭性elisa(其中對肽評估其防止抗體結合到與微量滴定板的孔結合的c6的能力)中或在芯片上。此類肽篩選方法可以不能檢測一些不連續(xù)的功能性表位，即牽涉沿著c6多肽鏈的一級序列不連續(xù)的氨基酸殘基的功能性表位。也可通過結構方法測定由本發(fā)明的抗體結合的表位，如x射線晶體結構測定(例如，wo2005/044853)、分子建模和核磁共振(nmr)光譜學，包括當游離時和當在復合物中與感興趣的抗體結合時c6中的不穩(wěn)定酰胺氫的h-d交換速率的nmr測定(zinn-justin等(1992)biochemistry31,11335-11347；zinn-justin等(1993)biochemistry32,6884-6891)。就x射線晶體學而言，可使用本領域中任何已知的方法完成結晶(例如，giege等(1994)actacrystallogr.d50:339-350；mcpherson(1990)eur.j.biochem.189:1-23)，包括微批次(microbatch)(例如chayen(1997)structure5:1269-1274)、懸滴蒸氣擴散(例如mcpherson(1976)j.biol.chem.251:6300-6303)、接晶種和透析。期望使用具有濃度至少約1mg/ml，優(yōu)選約10mg/ml至約20mg/ml的蛋白質(zhì)制備物。結晶可在含有聚乙二醇1000-20,000(peg；范圍為約1000至約20,000da的平均分子量)，優(yōu)選約5000至約7000da，更優(yōu)選約6000da的沉淀劑溶液中最佳地實現(xiàn)，濃度范圍為約10％至約30％(w/v)。還可期望包含蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如，濃度范圍為約0.5％至約20％的甘油。在沉淀劑溶液中，合適的鹽，如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉也可為期望的，優(yōu)選地濃度范圍為約1mm至約1000mm。沉淀劑優(yōu)選緩沖至約3.0至約5.0，優(yōu)選約4.0的ph。可用于沉淀劑溶液的特定緩沖液可變化，并且是本領域中公知的(scopes,proteinpurification:principles和practice,第三版,(1994)springer-verlag,newyork)。有用的緩沖劑的實例包括但不限于hepes、tris、mes和乙酸鹽。晶體可在寬的溫度范圍生長，包括2℃、4℃、8℃和26℃?？墒褂霉膞射線衍射技術研究抗體:抗原晶體，并且可使用計算機軟件如x-plor(yaleuniversity,1992,由molecularsimulations,inc.銷售；參見例如blundell&johnson(1985)meth.enzymol.114&115,h.w.wyckoff等編,academicpress；美國專利申請公開文本no.2004/0014194)，以及buster(bricogne(1993)actacryst.d49:37-60；bricogne(1997)meth.enzymol.276a:361-423,carter&sweet編；roversi等(2000)actacryst.d56:1313-1323)精細化(refine)，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。使用部分抗體序列表達完整的抗體在某些實施方案中，本發(fā)明的抗c6抗體包含seqidno:8中顯示的重鏈cdr3；和seqidno:13中顯示的輕鏈cdr3?？贵w可進一步包含seqidno:7中顯示的重鏈cdr2；和seqidno:12中顯示的輕鏈cdr2?？贵w還可進一步包含seqidno:6中顯示的重鏈cdr1；和seqidno:11中顯示的輕鏈cdr1。利用前述cdr的本發(fā)明的示例性抗體包括以下各項：(a)包含seqidno:30的重鏈可變區(qū)和seqidno:31的輕鏈可變區(qū)的抗體；(b)包含seqidno:32的重鏈可變區(qū)和seqidno:33的輕鏈可變區(qū)的抗體；(c)包含seqidno:34的重鏈可變區(qū)和seqidno:35的輕鏈可變區(qū)的抗體；(d)包含seqidno:36的重鏈可變區(qū)和seqidno:37的輕鏈可變區(qū)的抗體；(e)包含seqidno:38的重鏈可變區(qū)和seqidno:39的輕鏈可變區(qū)的抗體；(f)包含seqidno:40的重鏈可變區(qū)和seqidno:41的輕鏈可變區(qū)的抗體；(g)包含seqidno:42的重鏈可變區(qū)和seqidno:43的輕鏈可變區(qū)的抗體；和(h)包含seqidno:44的重鏈可變區(qū)和seqidno:45的輕鏈可變區(qū)的抗體。抗體主要通過位于6個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(cdr)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。出于此原因，cdr內(nèi)的氨基酸序列比cdr外部的序列在個別的抗體之間更加多樣。由于cdr序列負責大多數(shù)抗體-抗原相互作用，有可能通過構建表達載體來表達模擬特定天然存在的抗體的特性的重組抗體，所述表達載體包含嫁接到來自具有不同特性的不同抗體的框架序列上的來自特定天然存在的抗體的cdr序列(參見例如riechmann,l.等,1998,nature332:323-327；jones,p.等,1986,nature321:522-525；以及queen,c.等,1989,proc.natl.acad.see.u.s.a.86:10029-10033)。此類框架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共dna數(shù)據(jù)庫獲得。這些種系序列將不同于成熟抗體基因序列，因為它們將不包括由b細胞成熟期間的v(d)j連接形成的完全組裝的可變基因。種系基因序列也將不同于個別均勻地在可變區(qū)間的高親和力二級全集抗體的序列。例如，體細胞突變在框架區(qū)的氨基末端部分中相對不頻繁。例如，體細胞突變在框架區(qū)1的氨基末端部分和框架區(qū)4的羧基末端部分中相對不頻繁。此外，許多體細胞突變不顯著改變抗體的結合特性。出于此原因，不必需獲得特定抗體的整個dna序列以再創(chuàng)建具有與初始抗體的結合特性相似的結合特性的完整重組抗體(參見pct/us99/05535)。跨越cdr區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列通常足以用于此目的。使用部分序列確定哪些種系變異和連接基因區(qū)段促成重組抗體可變基因。然后，使用種系序列填充可變區(qū)的缺少部分。在蛋白質(zhì)成熟期間切割重鏈和輕鏈前導序列，并且不促成最終抗體的特性。為了添加缺少的序列，可通過連接或pcr擴增將克隆的cdna序列與合成的寡核苷酸組合。或者，整個可變區(qū)可作為一組短的、重疊的寡核苷酸合成，并通過pcr擴增組合以創(chuàng)建完全合成的可變區(qū)克隆。該方法具有某些優(yōu)點，如消除或納入特定的限制性位點，或優(yōu)化特定的密碼子。使用來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列設計重疊的合成寡核苷酸組，以創(chuàng)建具有與天然序列相同的氨基酸編碼能力的合成v序列。合成的重鏈和κ鏈序列可以以三種方式與天然序列不同：中斷重復核苷酸堿基串以促進寡核苷酸合成和pcr擴增；根據(jù)kozak的規(guī)則(kozak,1991,j.biol.chem.266:19867-19870)摻入最佳翻譯起始位點；和在翻譯起始位點的上游工程化改造hindiii位點。對于重鏈和輕鏈可變區(qū)兩者，將優(yōu)化的編碼和相應的非編碼鏈序列分解成30-50個核苷酸，大致在相應的非編碼寡核苷酸的中點。因此，對于每個鏈，可以將寡核苷酸組裝成跨越150-400個核苷酸的區(qū)段的重疊雙鏈組。然后，使用合并物作為模板以產(chǎn)生150-400個核苷酸的pcr擴增產(chǎn)物。通常，會將單個可變區(qū)寡核苷酸組分解成兩個合并物，其分開擴增以產(chǎn)生兩個重疊的pcr產(chǎn)物。然后，通過pcr擴增將這些重疊產(chǎn)物組合以形成完整的可變區(qū)。還可以期望在pcr擴增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)(包括κ輕鏈的bbsi位點，或者若γ重鏈，則為agei位點)的重疊片段，以產(chǎn)生可容易地克隆到表達載體構建體中的片段。然后，將重建的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆啟動子、前導序列、翻譯起始、前導序列、恒定區(qū)、3’非翻譯、多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列組合以形成表達載體構建體?？蓪⒅劓満洼p鏈表達構建體組合成單個載體，共轉(zhuǎn)染，連續(xù)轉(zhuǎn)染，或分別轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，然后將其融合以形成表達這兩條鏈的宿主細胞。用于表達載體構建的質(zhì)粒構建為使得pcr擴增的v重和vκ輕鏈cdna序列可用于重構建完整的重鏈和輕鏈微型基因。這些質(zhì)?？捎糜诒磉_完全人igg1κ或igg4κ抗體。本發(fā)明的完全人和嵌合抗體還包括igg2、igg3、ige、iga、igm和igd抗體?？蓸嫿愃频馁|(zhì)粒用于表達其它重鏈同種型，或用于表達包含λ輕鏈的抗體。因此，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的抗c6抗體的結構特征用于創(chuàng)建保留本發(fā)明抗體的至少一個功能特性的結構相關的抗c6抗體，如例如，(a)與本發(fā)明的抗c6抗體，如7e5、8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11或7f02結合相同的表位；(b)在溶血測定法中具有0.5μg/ml或更小的ic50；(c)具有1x10-8m或更小(或備選5x10-8m或更小、1x10-9m或更小、5x10-9m或更小或5x10-10m或更小)的kd，如通過表面等離振子共振確定；(d)具有40小時或更大的抗體c6結合半衰期，如通過表面等離振子共振確定；或者(e)與獼猴c6起交叉反應。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的一個或多個cdr區(qū)可以與已知的框架區(qū)和cdr重組組合以創(chuàng)建本發(fā)明的另外的、重組工程化的抗c6抗體。重鏈和輕鏈可變框架區(qū)可以源自相同或不同的抗體序列?？贵w序列可以是天然存在的抗體的序列，或者可以是幾種抗體的共有序列。參見kettleborough等,proteinengineering4:773(1991)；kolbinger等,proteinengineering6:971(1993)和carter等,wo92/22653。因而，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備抗c6抗體的方法，包括：制備抗體，其包括(1)重鏈框架區(qū)和重鏈cdr，其中至少一個重鏈cdr包含選自下組的氨基酸序列：seqidno:6、7和8中所示的cdr的氨基酸序列；和(2)輕鏈框架區(qū)和輕鏈cdr，其中至少一個輕鏈cdr包含選自下組的氨基酸序列：seqidno:11、12和13中所示的cdr的氨基酸序列；其中抗體保留結合c6的能力。可使用標準結合和/或功能測定法(如實施例中闡述的那些)來確定抗體結合c6的能力。優(yōu)選地，抗體表現(xiàn)出上文以(a)到(e)中列出的至少一種、或至少兩種或至少三種或至少四種或全部五種功能特性。如本文中公開，此類抗體的實例包括7e5、8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02的抗體(如實施例6中所述)。在本領域中公知的是，抗體重鏈和輕鏈cdr3域在抗體對抗原的結合特異性/親和力中起特別重要的作用(參見hall等,j.imunol.,149:1605-1612(1992)；polymenis等,j.immunol.,152:5318-5329(1994)；jahn等,immunobiol.,193:400-419(1995)；klimka等,brit.j.cancer,83:252-260(2000)；beiboer等,j.mol.biol,296:833-849(2000)；rader等,proc.natl.acad.sci.usa,95:8910-8915(1998)；barbas等,j.am.chem.soc.,116:2161-2162(1994)；ditzel等,j.immunol.,157:739-749(1996))，因而，如上闡述的那樣制備的本發(fā)明的重組抗體優(yōu)選包含7e5抗體的重鏈和/或輕鏈cdr3，如分別在seqidno:8和13中列出。如本文中公開，此類抗體的實例包括7e5、8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02抗體(如實施例6中所述)。此外，在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供抗c6抗體，其包含：(1)重鏈框架區(qū)、重鏈cdr1區(qū)、重鏈cdr2區(qū)和重鏈cdr3區(qū)，其中重鏈cdr3區(qū)包含seqidno:8的序列和(2)輕鏈框架區(qū)、輕鏈cdr1區(qū)、輕鏈cdr2區(qū)和輕鏈cdr3區(qū)，其中輕鏈cdr3區(qū)包含seqidno:13的序列，其中所述抗體結合c6?？贵w可進一步包括7e5抗體的重鏈cdr2和/或輕鏈cdr2，如分別在seqidno:7和12中列出?？贵w可進一步包含7e5抗體的重鏈cdr1和/或輕鏈cdr1，如分別在seqidno:6和11中列出。如本文中公開，此類抗體的實例包括7e5、8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02抗體(如實施例6中所述)。產(chǎn)生具有經(jīng)修飾的序列的抗體在另一個實施方案中，修飾本發(fā)明的抗c6抗體的可變區(qū)序列或其部分，以創(chuàng)建結構相關的抗c6抗體，其保留結合(即，與未修飾的抗體結合相同的表位)，因此在功能上等同。用于鑒定可以在不除去抗原結合的情況下修飾的殘基的方法是本領域中公知的(參見例如marks等(biotechnology(1992)10(7):779-83(通過改組輕鏈可變區(qū)，然后是具有固定cdr3序列變化的重鏈可變區(qū)的單克隆抗體多樣化)，jespers等(1994)biotechnology12(9):899-903(從針對抗體的單一表位的噬菌體展示全集選擇人抗體)，sharon等(1986)pnasusa83(8):2628-31(在抗體的可變多樣性區(qū)段連接處的不變氨基酸殘基的定點誘變)；casson等(1995)j.immunol.155(12):5647-54(源自抗體重鏈可變區(qū)的隨機誘變的特異性的喪失和變化的演變)。因而，在本發(fā)明的一個方面，上文描述的工程化抗體的cdr1、2和/或3區(qū)可包含如seqidno:6-7和11-13中所示的確切的氨基酸序列(7e5cdr)，如本文中公開。然而，在本發(fā)明的其它方面，抗體包括來自7e5的確切的cdr序列的衍生物，但仍然保留有效結合c6的能力。此類序列修飾可包括一個或多個氨基酸添加、缺失或取代，例如如上文所述的保守序列修飾。序列修飾也可基于上文關于7e5抗體的特定cdr1、cdr2和cdr3序列所述的共有序列。因而，在另一個實施方案中，工程化抗體可由一個或多個cdr組成，所述cdr與7e5抗體的一個或多個cdr(seqidno:6-8和11-13中顯示)為例如90％、95％、98％或99.5％相同的。本發(fā)明也意圖涵蓋上文敘述的數(shù)值中間的范圍，例如與一個或多個上述序列90-95％、95-98％或98-100％相同同一性的cdr。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了結合人c6的分離的抗體，其包含(a)重鏈可變區(qū)，其包含與選自下組的氨基酸序列至少90％(或90-95％、95％-98％、98％-100％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列：seqidno:30、32、34、36、38、40、42、44和46；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含與選自下組的氨基酸序列至少90％(或90-95％、95％-98％、98％-100％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列：seqidno:31、33、35、37、39、41、43、45和47。在另一個實施方案中，分離的抗體是下述抗體，其中(a)重鏈可變區(qū)包含選自seqidno:30、32、34、36、38、40、42、44和46的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)包含選自seqidno:31、33、35、37、39、41、43、45和47的氨基酸序列。實施例7詳細描述了“混合和匹配”實驗，其中這些重鏈和輕鏈可變區(qū)中的每一個在所有81種可能的組合中彼此配對，并且證明了所有81種組合在抑制c6活性中的功能活性。此外，在另一個實施方案中，可以改變cdr的一個或多個殘基以修飾結合，從而實現(xiàn)結合的更有利的結合速率、結合的更有利的解離速率或兩者，使得實現(xiàn)理想化的結合常數(shù)。使用該策略，可實現(xiàn)具有例如1010m-1或更多的超高結合親和力的抗體。本領域中公知的親和力成熟技術和本文所述的親和成熟技術可用于改變cdr區(qū)，隨后對所得的結合分子篩選期望的結合變化。因而，由于改變cdr，可監(jiān)測結合親和力以及免疫原性的變化并且評分，使得實現(xiàn)針對最佳組合結合和低免疫原性優(yōu)化的抗體。因此，對于vh和/或vlcdr1、cdr2和/或cdr3區(qū)內(nèi)的可變區(qū)修飾，可進行定點誘變或pcr介導的誘變以引入突變和對抗體結合的影響或，或者可以在如本文中所述并且在實施例中提供的體外或體內(nèi)測定法中評估感興趣的其它功能特性。優(yōu)選地，引入了保守的修飾(如本文所討論的)。突變可為氨基酸取代、添加或缺失，但優(yōu)選是取代。此外，通常改變cdr區(qū)內(nèi)不超過1、2、3、4或5個殘基。因而，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗c6單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)vhcdr1區(qū)，其包含seqidno:6中顯示的氨基酸序列或與seqidno:6相比具有1、2、3、4或5個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)vhcdr2區(qū)，其包含seqidno:7中顯示的氨基酸序列或與seqidno:7相比具有1、2、3、4或5個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)vhcdr3區(qū)，其包含seqidno:8中顯示的氨基酸序列或與seqidno:8相比具有1、2、3、4或5個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)vlcdr1區(qū)，其包含seqidno:11中顯示的氨基酸序列或與seqidno:11相比具有1、2、3、4或5個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)vlcdr2區(qū)，其包含seqidno:12中顯示的氨基酸序列或與seqidno:12相比具有1、2、3、4或5個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)vlcdr3區(qū)，其包含seqidno:13中顯示的氨基酸序列或與seqidno:13相比具有1、2、3、4或5個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗c6單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)重鏈可變區(qū)，其包含選自seqidno:30、32、34、36、38、40、42、44和46的氨基酸序列或與seqidno:30、32、34、36、38、40、42、44和46相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、8或10個氨基酸取代，缺失或添加的氨基酸序列；和(b)輕鏈可變區(qū)，其包含選自seqidno:31、33、35、37、39、41、43、45和47的氨基酸序列或與seqidno:31、33、35、37、39、41、43、45和47相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、8或10個氨基酸取代，缺失或添加的氨基酸序列。在cdr內(nèi)的修飾外或代替cdr內(nèi)的修飾，還可在抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)fr1、fr2、fr3和fr4的一個或多個內(nèi)進行修飾，只要這些修飾不消除抗體的結合親和力。例如，本發(fā)明的抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)中的一個或多個非種系氨基酸殘基用種系氨基酸殘基，即在重鏈或輕鏈可變區(qū)的人種系序列(抗體與該序列具有顯著的序列同一性)中的相應的氨基酸殘基取代。例如，可將抗體鏈與種系抗體鏈比對，它與所述種系抗體鏈共享顯著的序列同一性，并且在抗體框架序列和種系鏈框架之間不匹配的氨基酸殘基可用來自種系序列的相應的殘基取代。當氨基酸在抗體可變框架區(qū)和等同的人種系序列可變框架區(qū)之間不同時，若合理預期氨基酸落入以下分類之一內(nèi)，則抗體框架氨基酸通常應當被等同的人種系序列氨基酸取代：(1)直接非共價結合抗原的氨基酸殘基，(2)與cdr區(qū)相鄰的氨基酸殘基，(3)以其它方式與cdr區(qū)相互作用的氨基酸殘基(例如在cdr區(qū)的約3-6范圍內(nèi)，如通過計算機建模確定)，或(4)參與vl-vh界面的氨基酸殘基?！爸苯臃枪矁r結合抗原”的殘基包括在框架區(qū)中的位置中的氨基酸，其根據(jù)建立的化學力(例如通過氫鍵鍵合、范德華力、疏水相互作用，等等)具有直接與抗原上的氨基酸直接相互作用的良好可能性。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的框架區(qū)中的氨基酸殘基用直接非共價結合抗原的相應的種系氨基酸殘基取代?！芭ccdr區(qū)相鄰”的殘基包括在抗體的一級序列中與一個或多個cdr緊鄰的位置中的氨基酸殘基，例如與如由kabat限定的cdr，或如由chothia限定的cdr(參見例如chothia和leskj.mol.biol.196:901(1987))緊鄰的位置中。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的框架區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基用與cdr區(qū)相鄰的相應種系氨基酸殘基取代。“以其它方式與cdr區(qū)相互作用”的殘基包括通過二級結構分析確定為足以影響cdr區(qū)的空間取向的那些殘基。此類氨基酸通常會具有在cdr中的一些原子的約3埃單位內(nèi)的側鏈原子，并且必須含有可以根據(jù)建立的化學力(如上文列出的那些)與cdr原子相互作用的原子。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的框架區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基用以其它方式與cdr區(qū)相互作用的相應的種系氨基酸殘基取代。已知框架中幾個位置處的氨基酸對于確定許多抗體中的cdr構象(例如，能夠與cdr相互作用)是重要的(chothia和lesk,同上,chothia等,同上和tramontano等,j.mol.biol.215:175(1990)，它們?nèi)客ㄟ^引用并入本文)。這些作者通過分析幾種已知抗體的結構來鑒定對cdr構象重要的保守框架殘基?；赾dr的構象，所分析的抗體落入有限數(shù)目的結構或“規(guī)范”類別中。規(guī)范類別的成員內(nèi)的保守框架殘基稱為“規(guī)范”殘基。標準殘基包括輕鏈的殘基2,25,29,30,33,48,64,71,90,94和95和重鏈的殘基24,26,29,34,54,55,71和94?？筛鶕?jù)martin和thorton(1996)j.mol.biol.263:800的方法鑒定別的殘基(例如，cdr結構決定殘基)。值得注意的是，已知輕鏈的2、48、64和71位和重鏈的26-30、71和94位(根據(jù)kabat編號)的氨基酸能夠與許多抗體中的cdr相互作用。輕鏈中35位和重鏈中的93和103位的氨基酸也可能與cdr相互作用?？筛鶕?jù)foote和winter(1992)j.mol.biol.224:487的方法來鑒定可實現(xiàn)cdr構象的其它殘基。此類殘基稱作“游標”殘基，并且是在框架區(qū)中緊密地在cdr下面(即形成cdr下的“平臺”)的那些殘基。“參與vl-vh界面”的殘基或“包裝殘基”包括vl和vh之間界面處的那些殘基，如例如novotny和haber,proc.natl.acad.sci.usa,82:4592-66(1985)或chothia等,同上限定。有時，特定的氨基酸是否落入上文提及的一個或多個類別內(nèi)有些含糊不清。在此類情況下，產(chǎn)生備選的變體抗體，其中之一具有所述特定取代，其中另一種不然。可在本文所述的任何測定法中測試如此產(chǎn)生的備選變體抗體的期望活性，并且選擇優(yōu)選的抗體?？蚣軈^(qū)內(nèi)取代的其它候選者是在該位置處對于抗體而言不常見或“罕見”的氨基酸。這些氨基酸可以用來自人種系序列的等同位置或來自更典型的抗體的等同位置的氨基酸取代。例如，當抗體的框架區(qū)中的氨基酸對于該位置是罕見的并且種系序列中相應的氨基酸對免疫球蛋白序列中該位置是常見的時；或者當抗體中的氨基酸對于該位置是罕見的，并且相對于其它序列，種系序列中的相應氨基酸也是罕見的，取代可以是期望的。涵蓋了通過用來自碰巧對于抗體典型的種系序列的氨基酸替換不常見的氨基酸，可以使抗體具有較小的免疫原性。如本文中使用，術語“罕見”指在序列的代表性樣品中在小于約20％，優(yōu)選小于約10％，更優(yōu)選小于約5％，甚至更優(yōu)選小于約3％，甚至更優(yōu)選小于約2％，甚至更優(yōu)選小于約1％的序列中存在于上所述位置處的氨基酸。并且如本文中使用，術語“常見”指在代表性樣品中在超過約25％但通常超過約50％的序列中存在的氨基酸。例如，所有輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別分組成彼此特別同源且在某些關鍵位置具有相同氨基酸的序列的“亞組”(kabat等，同上)。當確定抗體序列中的氨基酸是否在序列間是“罕見的”還是“常見的”時，經(jīng)常會優(yōu)選僅考慮與抗體序列在相同的亞組中的那些序列。通常，抗體的框架區(qū)通常是基本相同的，更通常地與衍生它們的人種系序列的框架區(qū)相同。當然，框架區(qū)中的許多氨基酸對抗體的特異性或親和力幾乎沒有或沒有直接的貢獻。因此，可以容許框架殘基的許多個別的保守取代，而沒有所得免疫球蛋白的特異性或親和力的明顯變化。因此，在一個實施方案中，抗體的可變框架區(qū)與人種系可變框架區(qū)序列或此類序列的共有區(qū)共享至少85％序列同一性。在另一個實施方案中，抗體的可變框架區(qū)與人種系可變框架區(qū)序列或此類序列的共有區(qū)共享至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。還可以進行框架修飾以降低抗體的免疫原性或減少或除去其中駐留的t細胞表位，如例如carr等在us2003/0153043中所述。本發(fā)明的工程抗體包括下述抗體，其中已經(jīng)對vh和/或vl內(nèi)的框架殘基做出修飾，例如以改善抗體的特性。通常，做出此類框架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個框架殘基“回復突變”成相應的種系序列。更具體地，已經(jīng)經(jīng)歷體細胞突變的抗體可以含有不同于衍生抗體的種系序列的框架殘基。可通過將抗體框架序列與衍生抗體的種系序列進行比較來鑒定此類殘基?？蚣苄揎椀牧硪环N類型涉及突變框架區(qū)內(nèi)或甚至一個或多個cdr區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基以除去t細胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。這種方法也稱為“去免疫化”，并且在美國專利公開文本號20030153043中更詳細描述。除了僅結合c6外，可對抗體選擇其對本發(fā)明抗體的其它功能特性的保留，如例如：(a)與本發(fā)明的抗c6抗體，如7e5、8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11或7f02結合相同的表位；(b)在溶血測定法中具有0.5μg/ml或更小的ic50；(c)具有5x10-10m或更小的kd，如通過表面等離振子共振確定；(d)具有40小時或更大的抗體-c6結合半衰期，如通過表面等離振子共振確定；或(e)與獼猴c6起交叉反應。其他的抗體修飾本公開的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)中含有一個或多個糖基化位點。此類糖基化位點可以由于改變的抗原結合而導致抗體的增加的免疫原性或抗體的pk變化(marshall等(1972)annurevbiochem41:673-702；gala和morrison(2004)jimmunol172:5489-94；wallick等(1988)jexpmed168:1099-109；spiro(2002)glycobiology12:43r-56r；parekh等(1985)nature316:452-7；mimura等(2000)molimmunol37:697-706)。已知糖基化在含有n-x-s/t序列的基序處發(fā)生。在一些情況下，優(yōu)選具有不含可變區(qū)糖基化的抗c6抗體。這可以通過選擇不含可變區(qū)中的糖基化基序的抗體或通過突變糖基化區(qū)域內(nèi)的殘基來實現(xiàn)。例如，在一個實施方案中，修飾抗體的糖基化，例如改變可變區(qū)以消除駐留在可變區(qū)中的一個或多個糖基化位點。更具體地，期望在本抗體的序列中消除易于糖基化的位點。這通過改變在親本可變區(qū)中存在的一個或多個n-x-(s/t)(其中x是任何氨基酸殘基)序列的出現(xiàn)，特別是通過取代n殘基和/或s或t殘基實現(xiàn)。在一個實施方案中，將t95突變?yōu)閗95。在另一個實施方案中，將n47突變?yōu)閞47。例如，可以生成無糖基化抗體(即，其缺少糖基化)。可以改變糖基化，例如以增加抗體對抗原的親和力。此類碳水化合物修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)的一個或多個糖基化位點來實現(xiàn)。例如，可以進行一個或多個氨基酸取代，其導致消除一個或多個可變區(qū)框架糖基化位點，從而消除該位點處的糖基化。此類無糖基化可增加抗體對抗原的親和力。參見例如美國專利號5,714,350和6,350,861。另外/或者，抗體可以具有改變的糖基化類型，如具有減少量的巖藻糖基殘基的低巖藻糖基化抗體或具有增加的二分型glcnac結構的抗體。已經(jīng)證明此類改變的糖基化模式增加抗體的adcc能力。此類碳水化合物修飾可通過例如在具有改變的糖基化機制的宿主細胞中表達抗體來實現(xiàn)。具有改變的糖基化機制的細胞已經(jīng)在本領域中描述，并且可以用作宿主細胞，其中表達本發(fā)明的重組抗體，從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，細胞系ms704、ms705和ms709缺乏巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因fut8(α(1,6)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)，使得在ms704、ms705和ms709細胞系中表達的抗體在其碳水化合物上缺乏巖藻糖。通過使用兩個替換載體在cho/dg44細胞中靶向破壞fut8基因創(chuàng)建ms704、ms705和ms709fut8-/-細胞系(參見美國專利公開文本號20040110704和yamane-ohnuki等(2004)biotechnolbioeng87:614-22)。作為另一個實例，ep1,176,195描述了具有功能性破壞的fut8基因的細胞系，其編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使得在此類細胞系中表達的抗體通過減少或消除α-1,6鍵相關酶表現(xiàn)出低巖藻糖基化。ep1,176,195還描述了具有用于將巖藻糖添加到n-乙酰葡糖胺的低酶活性的細胞系，其結合抗體的fc區(qū)或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤細胞系yb2/0(atcccrl1662)。pct公開文本wo03/035835描述了變體cho細胞系lec13細胞，其具有降低的將巖藻糖附著至asn(297)連接的碳水化合物的能力，還導致在該宿主細胞中表達的抗體的低巖藻糖基化(也參見shields等(2002)j.biol.chem.277:26733-26740)。也可在雞蛋中產(chǎn)生具有修飾的糖基化概貌的抗體，如pct公開文本wo06/089231中所述。或者，可在植物細胞如浮萍(lemna)中產(chǎn)生具有修飾的糖基化概貌的抗體。用于在植物系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體的方法公開于對應于2006年8月11日提交的alston&birdllp代理人檔案號040989/314911的美國專利申請中。pct公開文本wo99/54342描述了細胞系，其工程化改造以表達糖蛋白修飾性糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，β(1,4)-n-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶iii(gntiii))，使得在工程化細胞系中表達的抗體表現(xiàn)出增加的二分型glcnac結構，其導致抗體的adcc活性增加(還參見umana等(1999)nat.biotech.17:176-180)。或者，可使用巖藻糖苷酶切割抗體的巖藻糖殘基；例如，巖藻糖苷酶α-l-巖藻糖苷酶從抗體中除去巖藻糖基殘基(tarentino等(1975)biochem.14:5516-23)。可在可變區(qū)中改變本發(fā)明的抗體以消除一個或多個糖基化位點，和/或改善抗體的物理穩(wěn)定性。例如，在一個實施方案中，可通過用脯氨酸殘基取代可變區(qū)的第228位的絲氨酸(即抗體具有包含s228p突變的可變區(qū))改善抗體的物理穩(wěn)定性。s228p改變顯著穩(wěn)定抗體結構，防止鏈內(nèi)二硫鍵的形成。在一個實施方案中，本發(fā)明的全長抗體是具有s228p改變的igg4同種型(igg4s228p)。在另一個實施方案中，改變可變區(qū)以消除駐留在可變區(qū)中的一個或多個糖基化位點。更具體地，在本抗體的序列中期望消除易于糖基化的位點。如上所述，這可以通過改變在親本可變區(qū)中存在的一個或多個n-x-(s/t)(其中x是任何氨基酸殘基)序列的出現(xiàn)，特別是通過取代n殘基和/或s或t殘基來實現(xiàn)。在一個實施方案中，t95突變?yōu)閗95。在另一個實施方案中，n47突變?yōu)閞47。除了在框架或cdr區(qū)內(nèi)做出的修飾之外或者作為在框架或cdr區(qū)內(nèi)做出的修飾的備選，本發(fā)明的抗體可以工程化改造為包含fc區(qū)內(nèi)的修飾，通常改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，如血清半衰期、補體結合、fc受體結合和/或抗原依賴性細胞性細胞毒性?？贵w也可以經(jīng)化學修飾(例如，可以將一個或多個化學部分附著到抗體)或修飾為改變其糖基化，再次改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)。在下文更為詳細描述了這些實施方案的每種。fc區(qū)中殘基的編號是kabat的eu索引的編號。在某些實施方案中，本發(fā)明涵蓋擁有一些但非全部效應器功能的抗體變體，這使得其成為下述應用的期望候選物，其中抗體的體內(nèi)半衰期是重要的，但某些效應器功能(如補體和adcc)是不必要的或有害的?？梢赃M行體外和/或體內(nèi)細胞毒性測定法以確認cdc和/或adcc活性的減少/消減。例如，可以進行fc受體(fcr)結合測定法以確?？贵w缺乏fcgr結合(因此可能缺乏adcc活性)，但保留fcrn結合能力。用于介導adcc的原代細胞nk細胞僅表達fcgriii，而單核細胞表達fcgri、fcgrii和fcgriii。ravetch,j.v.和kinet,j.p.,annurev.immunol.9(1991)457-492的第464頁的表3中總結了造血細胞上的fcr表達。用于評估感興趣分子的adcc活性的體外測定法的非限制性實例記載于美國專利號5,500,362(參見例如hellstrom,i.等,proc.natl.acad.sci.usa83(1986)7059-7063；以及hellstrom,i.等,proc.natl.acad.sci.usa82(1985)1499-1502)；美國專利號5,821,337(參見bruggemann,m.等,j.exp.med.166(1987)1351-1361)?；蛘?，可采用非放射性測定方法(參見例如用于流式細胞術的acti.tm.非放射性細胞毒性測定法(celltechnology,inc.mountainview,calif.；和cytotox96.rtm.非放射性細胞毒性測定法(promega,madison,wis.)。用于此類測定法的有用的效應細胞包括外周血單核細胞(pbmc)和天然殺傷(nk)細胞?；蛘?另外，可以在體內(nèi)評估感興趣的分子的adcc活性，例如，在動物模型，如clynes,r.等,proc.natl.acad.sci.usa95(1998)652-656中所公開的動物模型中。還可以進行c1q結合測定法以確認抗體不能結合c1q并因此缺乏cdc活性。參見例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c結合elisa。為了評估補體激活，可以進行cdc測定法(參見例如gazzano-santoro,h.等,j.immunol.methods202(1996)163-171；cragg,m.s.等,blood101(2003)1045-1052；以及cragg,m.s,和m.j.glennie,blood103(2004)2738-2743)。也可使用本領域中已知的方法進行fcrn結合和體內(nèi)清除/半衰期測定(參見例如petkova,s.b.等,int.immunol.18(2006)1759-1769)。在一個具體實施方案中，抗體包含經(jīng)突變以改善抗體的物理穩(wěn)定性的可變區(qū)。在一個實施方案中，抗體是在對應于重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)中位置228的位置處包含絲氨酸至脯氨酸突變(s228p；eu指數(shù))的igg4同種型抗體。已經(jīng)報道了此突變消除鉸鏈區(qū)域中重鏈間二硫橋的異質(zhì)性(angal等，同上；位置241基于kabat編號系統(tǒng))。例如，在各種實施方案中，本發(fā)明的抗c6抗體可以包含與人igg4恒定區(qū)連接的本文所述的任何抗體的重鏈可變區(qū)，其中如angal等，同上中所述的對應于位置241的位置處的絲氨酸已經(jīng)突變?yōu)楦彼?。因此，對于與人igg4恒定區(qū)連接的重鏈可變區(qū)，此突變對應于eu索引的s228p突變。在另一個實施方案中，ch1的鉸鏈區(qū)修飾為使得改變(例如增加或減少)鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目。在美國專利號5,677,425中進一步描述了這種方法。ch1鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)目改變?yōu)槔绱龠M輕鏈和重鏈的組裝或增加或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一個實施方案中，抗體的fc鉸鏈區(qū)經(jīng)突變以降低抗體的生物半衰期。更具體地，將一個或多個氨基酸突變引入到fc-鉸鏈片段的ch2-ch3域界面區(qū)中，使得相對于天然fc-鉸鏈域spa結合，抗體具有受損的葡萄球菌蛋白a(spa)結合。在美國專利no.6,165,745中更詳細描述了此方法。在另一個實施方案中，修飾抗體以增加其生物半衰期。各種方法是可能的。例如，如美國專利號6,277,375中所述，可引入以下一個或多個突變：t252l、t254s、t256f。或者，為了增加生物半衰期，可在ch1或cl區(qū)內(nèi)改變抗體以含有取自iggfc區(qū)的ch2域的兩個環(huán)的補救受體結合表位，如美國專利號5,869,046和6,121,022中所述。在另一種方法中，通過引入兩個突變，一個在434位的絲氨酸處和選自下組的第二個突變來修飾抗體以增加其生物半衰期：第311位的異亮氨酸、311位的纈氨酸、第436位的異亮氨酸和第436位的纈氨酸。此方法記載于美國專利公開文本號2012/6128663中。在其它實施方案中，通過用不同的氨基酸殘基替換至少一個氨基酸殘基改變fc區(qū)，以改變抗體的效應器功能。例如，可以用不同的氨基酸殘基替換選自氨基酸殘基234,235,236,237,297,318,320和322的一個或多個氨基酸，使得抗體對效應配體具有改變的親和力，但是保留親本抗體的抗原結合能力。改變親和力的效應配體可以是例如fc受體或補體的c1組分。在美國專利號5,624,821和5,648,260中更詳細描述了此方法。在另一個實施方案中，可以用不同的氨基酸殘基替換選自氨基酸殘基329、331和322的一個或多個氨基酸，使得抗體具有改變的c1q結合和/或減少或消除的補體依賴性細胞毒性(cdc)。在美國專利號6,194,551中更詳細描述了此方法。在另一個實施方案中，改變氨基酸位置231和239內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。在pct公開文本wo94/29351中進一步描述了此方法。在另一個實施方案中，通過在修飾下列位置處一個或多個氨基酸來修飾fc區(qū)以增加抗體介導抗體依賴性細胞性細胞毒性(adcc)的能力和/或增加抗體對fcγ受體的親和力：238,239,248,249,252,254,255,256,258,265,267,268,269,270,272,276,278,280,283,285,286,289,290,292,293,294,295,296,298,301,303,305,307,309,312,315,320,322,324,326,327,329,330,331,333,334,335,337,338,340,360,373,376,378,382,388,389,398,414,416,419,430,434,435,437,438或439。在pct公開文本wo00/42072中進一步描述了此方法。此外，已定位了針對fcγr1、fcγrii、fcγriii和fcrn的人igg1上的結合位點，并且已經(jīng)描述了具有改善的結合的變體(參見shields等(2001)j.biol.chem.276:6591-6604)。顯示了在第256,290,298,333,334和339位的特定突變改善對fcγriii的結合。另外，顯示以下組合突變體改善fcγriii結合：t256a/s298a,s298a/e333a,s298a/k224a和s298a/e333a/k334a。在另一個實施方案中，通過引入在位置pro329處的氨基酸取代和至少一個另外的氨基酸取代，優(yōu)選選自s228p、e233p、l234a、l235a、l235e、n297a、n297d和p331s修飾fc區(qū)以降低抗體介導抗體依賴性細胞性細胞毒性(adcc)的能力和/或而降低抗體對fcγ受體的親和力。在美國專利公開文本no.2002/2551531中描述了此方法。具有降低的效應器功能的抗體包括具有fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和329中一個或多個的取代的抗體(美國專利號6,737,056)。此類fc突變體包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的兩個或更多個處具有取代的fc突變體，包括具有殘基265和297取代為丙氨酸的所謂“dana”fc突變體(美國專利號7,332,581)。描述了改善或降低的對fcr的結合的某些抗體變體。(參見例如美國專利號6,737,056；wo2004/056312，以及shields,r.l.等,j.biol.chem.276(2001)6591-6604)。在某些實施方案中，抗體變體包含具有改善adcc的一個或多個氨基酸取代的fc區(qū)，例如fc區(qū)的第298、333和/或334位的取代(殘基的eu編號)。在一些實施方案中，在fc區(qū)中做出改變，其導致改變(即，改善或降低)的c1q結合和/或補體依賴性細胞毒性(cdc)，例如，如記載于美國專利號6,194,551,wo99/51642，以及idusogie,e.e.等,j.immunol.164(2000)4178-4184。具有增加的半衰期和改善的對新生兒fc受體(fcrn)(其負責將母體igg轉(zhuǎn)移到胎兒(guyer,r.l.等,j.immunol.117(1976)587-593,和kim,j.k.等,j.immunol.24(1994)2429-2434))的結合的抗體記載于us2005/0014934中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代的fc區(qū)，其改善fc區(qū)與fcrn的結合。此類fc變體包括在下述fc區(qū)殘基中的一個或多個處具有取代的：238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434，例如，fc區(qū)殘基434的取代(美國專利號7,371,826)。還參見duncan,a.r.和winter,g.,nature322(1988)738-740；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；及wo94/29351，其關注fc區(qū)變體的其它實例。另外，抗體可以是peg化的，例如以增加抗體的生物學(例如血清)半衰期。為了使抗體進行peg化，抗體或其片段通常在一個或多個peg基團被附接于抗體或抗體片段的條件下與聚乙二醇(peg)，如peg的反應性酯或醛衍生物起反應。優(yōu)選地，通過與反應性peg分子(或類似的反應性水溶性聚合物)的?；磻蛲榛磻M行peg化。如本文中使用，術語“聚乙二醇”意圖涵蓋已經(jīng)用于衍生其它蛋白質(zhì)的任何形式的peg，例如單(c1-c10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方案中，待peg化的抗體是無糖基化抗體。用于使蛋白質(zhì)peg化的方法是本領域已知的，并且可應用于本發(fā)明的抗體。參見例如ep0154316和ep0401384。c6單克隆抗體的表征可使用多種已知技術對本發(fā)明的單克隆抗體表征對c6的結合和/或?qū)6的功能抑制。通常，最初通過elisa來表征抗體與其靶抗原的結合。簡言之，可以用pbs中的純化的c6包覆微量滴定板，然后用無關蛋白質(zhì)(如在pbs中稀釋的牛血清白蛋白(bsa))封閉。將來自c6免疫小鼠的血漿稀釋液添加到每個孔中，并且在37℃溫育1-2小時。用pbs/tween20清洗板，然后在37℃與綴合于堿性磷酸酶的山羊抗人iggfc特異性多克隆試劑溫育1小時。清洗后，將板用abts底物顯影，并在od405分析。優(yōu)選地，使用形成表現(xiàn)出最高結合和/或功能抑制活性的抗體的最高滴度的小鼠用于融合?？墒褂萌缟纤龅膃lisa測定法篩選抗體，從而篩選產(chǎn)生與c6免疫原顯示陽性反應性的抗體的雜交瘤?？梢詫?yōu)選以高親和力結合c6的雜交瘤亞克隆并進一步表征。然后，可以選擇保留親代細胞反應性(通過elisa)的每個雜交瘤的一個克隆，用于制備細胞庫，并進行抗體純化。另外/或者，確定抗體抑制或阻斷c6活性的能力的功能測定法可用于篩選和選擇感興趣的抗體。合適的體外功能測定法包括溶血測定法和macelisa測定，如實施例1中詳細描述的。在實施例4中詳細描述了用于測定體內(nèi)功能活性的合適的測定法。為了純化抗c6抗體，可以在滾瓶、2升旋轉(zhuǎn)瓶或其它培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)選擇的雜交瘤?？梢栽谟玫鞍譨-sepharose(pharmacia，piscataway，nj)進行親和層析之前過濾和濃縮上清液以純化蛋白質(zhì)。與pbs進行緩沖液交換后，可以通過od280使用1.43消光系數(shù)或優(yōu)選通過濁度分析確定濃度?？梢酝ㄟ^凝膠電泳和抗原特異性方法檢測igg。為了確定所選擇的抗c6單克隆抗體是否結合獨特的表位，可使用市售試劑(pierce，rockford，il)將每種抗體生物素化。可以用鏈霉親合素標記的探針檢測生物素化的mab結合。為了確定純化抗體的同種型，可使用本領域公認的技術進行同種型elisa。例如，微孔板的孔可以在10℃用10μg/ml抗ig在4℃包覆過夜。用5％bsa封閉后，平板與10μg/ml單克隆抗體或純化的同種型對照在環(huán)境溫度反應2小時。然后可以將孔與igg1或其它同種型特異性綴合的探針起反應。如上所述顯現(xiàn)和分析板。用于分析各種抗c6抗體的結合親和力、交叉反應性和結合動力學的方法包括本領域已知的標準測定法，例如使用biacoretm2000spr儀(biacoreab,uppsala,sweden)的biacoretm表面等離振子共振(spr)，如本文中實施例2中所述。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以5x10-8m或更小的kd結合c6，以2x10-8m或更小的kd結合c6，以5x10-9或更小的kd結合c6，以4x10-9或更小的kd結合c6，以3x10-9m或更小的kd結合c6，以2x10-9m或更小的kd結合c6，以1x10-9m或更小的kd結合c6，以5x10-10m或更小的kd結合c6，或以2.5x10-10m或更小的kd結合c6。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體具有至少24小時、或至少30小時、或至少36小時、或至少40小時或至少45小時的t1/2(如通過表面等離振子共振確定)?？贵w物理性質(zhì)本公開的抗體可通過其各種物理性質(zhì)表征，以檢測和/或區(qū)分其不同類別。在優(yōu)選的實施方案中，本公開的抗體不含有天冬酰胺異構位點。天冬酰胺的脫酰胺可以發(fā)生在n-g或d-g序列上，并導致創(chuàng)建異天冬氨酸殘基，其引入了多肽鏈中的扭結并降低其穩(wěn)定性(異天冬氨酸效應)。每個抗體將具有獨特的等電點(pi)，其通常落在6-9.5的ph范圍內(nèi)。igg1抗體的pi通常落在7-9.5的ph范圍內(nèi)，并且igg4抗體的pi通常落在6-8的ph范圍內(nèi)。推測在體內(nèi)條件下，pi在正常范圍外的抗體可以具有一些解折疊和不穩(wěn)定性。因此，優(yōu)選具有含有落在正常范圍內(nèi)的pi值的抗c6抗體。這可以通過選擇具有正常范圍內(nèi)的pi的抗體或通過使帶電表面殘基突變來實現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方案中，選擇不快速降解的抗體?？墒褂妹毠茈娪?ce)和maldi-ms(alexanderaj和hughesde(1995)analchem67:3626-32)測量抗體的降解。在另一個優(yōu)選的實施方案中，選擇具有最小聚集效應的抗體，其可導致不想要的免疫應答的觸發(fā)和/或改變或不利的藥代動力學性質(zhì)。通常，抗體在25％以下，優(yōu)選為20％以下，甚至更優(yōu)選為15％以下，甚至更優(yōu)選為10％以下，甚至更優(yōu)選為5％以下的凝集的情況下可接受?？梢酝ㄟ^幾種技術測量，包括大小排阻柱(sec)、高效液相層析(hplc)和光散射測量聚集。每個抗體將具有特征的熔解溫度，較高的熔解溫度指示較好的體內(nèi)總體穩(wěn)定性(krishnamurthyr和manningmc(2002)currpharmbiotechnol3:361-71)。通常，優(yōu)選tm1(初始展開的溫度)大于60℃，優(yōu)選大于65℃，甚至更優(yōu)選大于70℃。可使用差示掃描量熱法(chen等(2003)pharmres20:1952-60；ghirlando等(1999)immunollett68:47-52)或圓二色性(murray等(2002)j.chromatogrsci40:343-9)測量抗體的熔點。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體具有高熔解溫度。在一個實施方案中，抗體具有至少65℃，更優(yōu)選至少66℃，甚至更優(yōu)選至少67℃，甚至更優(yōu)選至少68℃的熔點。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體具有在67℃至72℃，更優(yōu)選68°至72℃，或69℃至72℃，或70℃至72℃或69℃至71.43℃的范圍內(nèi)的熔點。ii.免疫毒素、免疫綴合物和抗體衍生物在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體與治療性部分，如細胞毒素、藥物或放射性同位素連接。當與細胞毒素綴合時，這些抗體綴合物稱為“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺死細胞)的任何藥劑。例如紫杉醇、松胞菌素b、短桿菌肽d、溴化乙啶、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽環(huán)二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素d、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同系物。治療劑包括但不限于抗代謝物(例如，甲氨喋呤、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化劑(例如，氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素c和順式二氯二胺鉑(ii)(ddp)順鉑)、蒽環(huán)類(如柔紅霉素(以前為道諾霉素)和多柔比星))、抗生素(更生霉素(以前為放線菌素)、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(amc))和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春堿)。本發(fā)明的抗體可與放射性同位素(例如放射性碘)綴合以產(chǎn)生細胞毒性放射性藥物。本發(fā)明的抗體綴合物可用于改變給定的生物學應答，并且藥物部分不應解釋為限于經(jīng)典的化療劑。例如，藥物部分可以是具有期望生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。此類蛋白質(zhì)可包括例如酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白a、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應修飾劑，如例如淋巴因子、白細胞介素-1(“il-1”)、白細胞介素-2(“il-2”)、白細胞介素-6(“il-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒細胞集落刺激因子(“g-csf”)或其它生長因子。將此類治療部分與抗體綴合的技術是公知的，參見例如arnon等,"monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy",于monoclonalantibodies和cancertherapy,reisfeld等(編),第243-56頁(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等,"antibodiesfordrugdelivery",于controlleddrugdelivery(第2版),robinson等(編),第623-53頁(marceldekker,inc.1987)；thorpe,"antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview",于monoclonalantibodies'84:biological和clinicalapplications,pinchera等(編),第475-506頁(1985)；"analysis,results,和futureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy",于monoclonalantibodiesforcancerdetection和therapy,baldwin等(編),第303-16頁(academicpress1985),以及thorpe等,"thepreparation和cytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates",immunol.rev.,62:119-58(1982)。抗體和細胞毒素的綴合物可使用各種雙官能蛋白偶聯(lián)劑如n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯、亞氨基硫烷、亞氨酸酯的雙官能衍生物如二甲基己二亞酰胺化物hcl、活性酯如二琥珀酰亞胺辛二酸酯、醛如戊二醛、雙疊氮基化合物如雙(對重氮基苯甲?；?-乙二胺、二異氰酸酯如甲苯2,6-二異氰酸酯、和雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。c14-標記的1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是適合于將放射性核素與抗體綴合的螯合劑。免疫毒素的毒素組分可以是例如化療劑、毒素如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段，或小分子毒素或放射性同位素，如212bi、131i、131in、111in、90y和186re?？捎糜诋a(chǎn)生此類免疫綴合物的化療劑包括美登木素生物堿，包括dm-1和dm-4，奧利他汀類(auristatins)、阿霉素、多柔比星、表柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(“ara-c”)、環(huán)磷酰胺、噻替派、白消安、細胞毒素、紫杉烷類如帕里他賽和多西他賽、泰索帝、甲氨喋呤、順鉑、美法侖、長春堿、博來霉素、依托泊苷、異環(huán)酰胺、絲裂霉素c、米托蒽醌、長春新堿、長春瑞濱、卡鉑、替尼泊苷、道諾霉素、洋紅霉素、氨基喋呤、更生霉素、絲裂霉素、埃斯波霉素、5-fu、6-硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、放線菌素d、vp-16、苯丁酸氮芥、美法侖和其它相關氮芥。還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的激素劑，如他莫昔芬和奧那司酮(onapristone)。可使用的毒素及其片段包括白喉a鏈、白喉毒素的非結合活性片段、霍亂毒素、肉毒毒素、外毒素a鏈(來自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白a鏈、相思豆毒蛋白a鏈、蒴蓮根毒素a鏈、α-帚曲毒蛋白(α-sarcin)、油桐(aleuritesfordii)蛋白質(zhì)、石竹素蛋白、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii、pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹毒素、皂草素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothcenes)。小分子毒素包括例如加利車霉素、美登木素生物堿，?？舅睾蚦c1065?？膳c抗體綴合以形成免疫毒素的其它治療劑包括抗代謝物、烷化劑，dna小溝結合劑、dna嵌入劑、dna交聯(lián)劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、核輸出抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶i或ii抑制劑、熱休克蛋白抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、抗生素和抗有絲分裂劑。在綴合物中，抗體和治療劑優(yōu)選通過可切割的接頭如肽基、二硫化物或腙接頭綴合。更優(yōu)選地，接頭是肽基接頭如val-cit,ala-val,val-ala-val,lys-lys,pro-val-gly-val-val(seqidno:15),ala-asn-val,val-leu-lys,ala-ala-asn,cit-cit,val-lys,lys,cit,ser,或glu?？扇缑绹鴮＠?,087,600；6,989,452；和7,129,261；pctpublicationswo02/096910；wo07/038658；wo07/051081；wo07/059404；wo08/083312；和wo08/103693；美國專利公開文本20060024317；20060004081；和20060247295(其公開內(nèi)容通過引用并入本文)所述的那樣制備綴合物。本發(fā)明的抗體也可以用于診斷目的，包括樣品測試和體內(nèi)成像，并且為此目的，抗體(或其結合片段)可以與適當?shù)目蓹z測劑綴合以形成免疫綴合物。為了診斷目的，合適的試劑是可檢測的標記物，其包括用于全身成像的放射性同位素、放射性同位素、酶、熒光標記物和用于樣品測試的其它合適的抗體標簽。對于c6檢測，可檢測標記物可以是目前在體外診斷領域中使用的各種類型中的任何一種，包括顆粒標記物，包括金屬溶膠如膠體金，同位素如i125或tc99，例如呈現(xiàn)有n2s2、n3s或n4型的肽螯合劑，生色團，包括熒光標志物、發(fā)光標志物、磷光標志物等，以及將給定底物轉(zhuǎn)化為可檢測標志物的酶標記物，以及如通過聚合酶鏈式反應擴增后揭示的多聚核苷酸標簽。合適的酶標記物包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等。例如，標記物可為酶堿性磷酸酶，其通過測量轉(zhuǎn)化1,2-二氧雜環(huán)丁烷(1,2dioxetane)底物如金剛烷基甲氧基磷酰氧基苯基二氧雜環(huán)丁烷(amppd)、3-(4-(甲氧基螺[{1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2'-(5'-氯)三環(huán){3.3.1.13,7}癸}-4-基)苯基磷酸二鈉(cspd)，以及cdp和或本領域技術人員公知的其它發(fā)光底物，例如合適的鑭系元素如鋱(iii)和銪(iii)的螯合物后化學發(fā)光的存在或形成檢測。檢測手段由所選擇的標記物確定?？墒褂萌庋?在標記物是顆粒并且以合適的水平積累的情況下)，或者使用儀器，如分光光度計、發(fā)光計、熒光計等實現(xiàn)標記物或其反應產(chǎn)物的出現(xiàn)，均根據(jù)標準實踐。在某些實施方案中，本文提供的抗體可以進一步修飾以含有本領域已知并且易于獲得的其它非蛋白質(zhì)部分。適用于抗體衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限于聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環(huán)、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或無規(guī)共聚物)和右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的穩(wěn)定性而具有制造優(yōu)點。聚合物可以是任何分子量，并且可以是支鏈或非支鏈的。附著到抗體上的聚合物的數(shù)目可以變化，并且如果附著多于一個聚合物，則它們可為相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型可以基于包括但不限于待改進的抗體的特定性質(zhì)或功能，抗體衍生物是否將用于限定條件下的療法等的考慮來確定。在另一個實施方案中，提供可通過暴露于輻射而選擇性加熱的抗體和非蛋白質(zhì)性部分的綴合物。在一個實施方案中，非蛋白質(zhì)性部分是碳納米管(kam,n.w.等,proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。輻射可以是任何波長，并且包括但不限于不損害普通細胞但是將非蛋白質(zhì)性部分加熱到抗體非蛋白質(zhì)性部分附近的細胞被殺死的溫度的波長。導致基本(或幾乎)非免疫原性的連接的綴合方法是特別適合的。因此，肽-(即酰胺-)、硫化物-、(空間位阻)、二硫化物、腙或醚連接是特別合適的。這些連接基本上是非免疫原性的并且在血清中顯示合理的穩(wěn)定性(參見例如senter,p.d.,curr.opin.chem.biol.13(2009)235-244；wo2009/059278；wo95/17886)。根據(jù)部分和抗體的生物化學性質(zhì)，不同的綴合策略在手。在部分是50至500個氨基酸的天然存在或重組的部分的情況下，在描述蛋白質(zhì)綴合物的合成化學的教科書中有標準程序，其是本領域技術人員可以容易遵循的(參見例如hackenberger,c.p.r.,和schwarzer,d.,angew.chem.int.ed.engl.47(2008)10030-10074)。在一個實施方案中，使用馬來酰亞氨基部分與抗體或部分內(nèi)的半胱氨酸殘基的反應。這在例如使用抗體的fab或fab’片段的情況下是特別適合的偶聯(lián)化學?；蛘?，在一個實施方案中，進行與抗體或部分的c末端的偶聯(lián)。例如，可以進行蛋白質(zhì)(例如fab片段)的c末端修飾，如描述(sunbul,m.和yin,j.,org.biomol.chem.7(2009)3361-3371)。通常，位點特異性反應和共價偶聯(lián)是基于將天然氨基酸轉(zhuǎn)化成具有與存在的其它官能團的反應性正交的反應性的氨基酸。例如，可以在醛中酶促轉(zhuǎn)化罕見序列背景內(nèi)的特定半胱氨酸(參見frese,m.a.,和dierks,t.,chembiochem.10(2009)425-427)。也有可能通過利用在給定的序列背景中具有天然氨基酸的某些酶的特異性酶反應性來獲得期望的氨基酸修飾(參見，例如，taki,m.等,prot.eng.des.sel.17(2004)119-126；gautier,a.等chem.biol.15(2008)128-136；和protease-catalyzedformationofc--nbondsisusedbybordusa,f.,highlightsinbioorganicchemistry(2004)389-403)。位點特異性反應和共價偶聯(lián)也可通過末端氨基酸與合適的修飾試劑的選擇性反應來實現(xiàn)。n-末端半胱氨酸與苯基氰的反應性(參見ren,h.等,angew.chem.int.ed.engl.48(2009)9658-9662)可以用于實現(xiàn)位點特異性共價偶聯(lián)。天然化學連接也可依賴于c-末端半胱氨酸殘基(taylor,e.vogel；imperiali,b,nucleicacids和molecularbiology(2009),22(proteinengineering),65-96)。ep1074563描述了一種綴合方法，其基于在帶負電荷的氨基酸的區(qū)段內(nèi)的半胱氨酸與位于帶正電荷的氨基酸的區(qū)段中的半胱氨酸的更快的反應。部分也可以是合成肽或肽模擬物。在化學合成多肽的情況下，可以在此類合成期間引入具有正交化學反應性的氨基酸(參見例如，degraaf,a.j.等,bioconjug.chem.20(2009)1281-1295)。由于極其多種正交官能團受到威脅并且可被引入到合成肽中，此類肽與接頭的綴合是標準化學。為了獲得單標記的多肽，可以通過層析從其它綴合副產(chǎn)物分離具有1:1化學計量的綴合物?？梢酝ㄟ^使用染料標記的結合對成員和帶電荷的接頭促進該程序。通過使用這種標記的且高度帶負電荷的結合對成員，由于電荷和分子量的差異可以用于分離，單綴合的多肽容易與未標記的多肽和攜帶多于一個接頭的多肽分離。熒光染料可用于從未結合的組分，如標記的一價結合劑純化復合物。在一個實施方案中，效應部分選自結合部分、標記部分和生物活性部分iii.組合物在另一個實施方案中，本發(fā)明提供組合物，例如組合物，其含有與載體(例如藥學上可接受的載體)一起配制的本發(fā)明的單克隆抗體之一或組合。還提供了含有包含本發(fā)明抗體的雙特異性分子的組合物。在一個實施方案中，組合物包括本發(fā)明的多個(例如，兩個或更多個)分離的抗體的組合。優(yōu)選地，組合物的每種抗體結合到c6的不同的預先選擇的表位。本發(fā)明的藥物組合物也可以在聯(lián)合療法中施用，即與其它藥物組合施用。例如，聯(lián)合療法可以包括本發(fā)明的組合物與至少一種或多種另外的治療劑，如抗炎劑、dmard(疾病緩解性抗風濕性藥物)、免疫抑制劑和化療劑。本發(fā)明的藥物組合物也可以與放射治療一起施用。本發(fā)明也涵蓋與其它抗體的共施用。如本文中使用，術語“載體”和“藥學上可接受的載體”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層材料、抗細菌和抗真菌劑、等張和吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如通過注射或輸注)。取決于給藥途徑，活性化合物，即抗體、雙特異性和多特異性分子可以在材料中包覆以保護化合物免受可使化合物失活的酸和其它天然條件的作用。可與本發(fā)明的抗體和構建體一起使用的佐劑的實例包括：弗氏不完全佐劑和完全佐劑(difcolaboratories,detroit,mich.)；merck佐劑65(merck和company,inc.,rahway,n.j.)；as-2(smithklinebeecham,philadelphia,pa.)；鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅的鹽；酰化酪氨酸的不溶性懸浮液；?；牵魂栯x子或陰離子衍生的多糖；聚磷腈(polyphosphazenes)；可生物降解微球；細胞因子，如gm-csf，白細胞介素-2，-7，-12和其它類似因子；3d-mpl；cpg寡核苷酸；和單磷酰脂質(zhì)a，例如3-脫-o-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)a。mpl佐劑可從corixacorporation(seattle,wash；參見例如美國專利號4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)獲得。含有cpg的寡核苷酸(其中cpg二核苷酸是未甲基化的)是公知的，并且記載于例如wo96/02555、wo99/33488和美國專利號6,008,200和5,856,462。免疫刺激性dna序列也例如由sato等,science273:352,1996描述。另外的替代佐劑包括例如皂苷，如quila或其衍生物，包括qs21和qs7(aquilabiopharmaceuticalsinc.,framingham,mass.)；七葉素；洋地黃皂苷；或石頭花(gypsophila)或昆諾阿藜(chenopodiumquinoa)皂苷；montanideisa720(seppic，france)；saf(chiron,california,unitedstates)；iscoms(csl),mf-59(chiron)；sbas系列佐劑(例如sbas-2或sbas-4，可得自smithklinebeecham,rixensart,belgium)；detox(enhanzyntm)(corixa,hamilton,mont.)；rc-529(corixa,hamilton,mont.)和其它氨基烷基葡糖胺-4-磷酸酯(agp)；聚氧乙烯醚佐劑，如在wo99/52549a1中描述的那些；合成咪唑并喹啉如咪喹莫德(imiquimod)[s-26308，r-837]，(harrison,等,vaccine19:1820-1826,2001；和瑞喹莫德(resiquimod)[s-28463,r-848](vasilakos,等,cellularimmunology204:64-74,2000；在抗原呈遞細胞和t細胞表面上組成型表達的羰基和胺的希夫堿，如妥卡雷瑣(tucaresol)(rhodes,j.等,nature377:71-75,1995)；作為蛋白質(zhì)或肽的細胞因子、趨化因子和共刺激分子，包括例如促炎性細胞因子如干擾素、gm-csf、il-1α、il-1β、tgf-α和tgf-β、th1誘導物如干擾素γ、il-2、il-12、il-15、il-18和il-21，th2誘導劑如il-4、il-5、il-6、il-10和il-13和其它趨化因子和共刺激基因如mcp-1、mip-1α、mip-1β、rantes、tca-3、cd80、cd86和cd40l；靶向配體的免疫刺激劑，如ctla-4和l-選擇蛋白，凋亡刺激蛋白質(zhì)和肽，如fas；基于合成脂質(zhì)的佐劑，如vaxfectin,(reyes等,vaccine19:3778-3786,2001)角鯊烯，α-生育酚，聚山梨醇酯80，dopc和膽固醇；內(nèi)毒素，[lps]，(beutler,b.,currentopinioninmicrobiology3:23-30,2000)；觸發(fā)toll受體產(chǎn)生th1誘導細胞因子的配體，如合成分枝桿菌脂蛋白、分枝桿菌蛋白p19、肽聚糖、磷壁酸和脂質(zhì)a；和ct(霍亂毒素，亞基a和b)和lt(來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定腸毒素，亞基a和b)、熱休克蛋白家族(hsp)和llo(李斯特菌溶血素o；wo01/72329)。這些和各種其它toll樣受體(tlr)激動劑記載于例如kanzler等,naturemedicine,may2007,vol13,no5?！八帉W上可接受的鹽”是指保留母體化合物的期望生物活性并且不賦予任何不期望的毒理作用的鹽(參見例如berge,s.m.,等(1977)j.pharm.sci.66:1-19)。這些鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括源自無毒無機酸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等的那些，以及源自無毒性有機酸如脂肪族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸，芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等的那些。堿加成鹽包括源自堿土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等的那些，以及源自無毒性有機胺如n,n'-二芐基乙二胺、n-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺，普魯卡因等的那些?？赏ㄟ^本領域已知的多種方法來施用本發(fā)明的組合物。如熟練技術人員將理解，施用途徑和/或模式將根據(jù)期望的結果而變化?；钚曰衔锟梢杂帽Ｗo化合物免受快速釋放的載體制備，如控制釋放制劑，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備此類制劑的許多方法是有專利的或者本領域技術人員通常已知的。參見例如sustained和controlledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson編,marceldekker,inc.,newyork,1978。為了通過某些施用途徑施用本發(fā)明的化合物，可以必需用材料包覆化合物或者共施用化合物與材料以防止其失活。例如，可以在合適的載體例如脂質(zhì)體或稀釋劑中將化合物施用于受試者?？山邮艿南♂寗┌}水和水性緩沖溶液。脂質(zhì)體包括水包油包水cgf乳劑以及常規(guī)脂質(zhì)體(strejan等(1984)j.neuroimmunol.7:27)。載體包括無菌水溶液或分散體和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。使用此類介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)是本領域已知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容之外，涵蓋其在本發(fā)明的藥物組合物中的用途。補充的活性化合物也可以并入組合物中。治療組合物通常在制造和貯存條件下必須是無菌和穩(wěn)定的。該組合物可以配制成適合高藥物濃度的溶液、微乳液、脂質(zhì)體或其它有序結構。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的溶劑或分散介質(zhì)及其合適的混合物。例如，可以通過使用諸如卵磷脂的涂層，通過在分散體的情況下維持所需的粒度和通過使用表面活性劑維持合適的流動性。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠來實現(xiàn)可注射組合物的延長吸收?？梢酝ㄟ^在根據(jù)需要具有上文例舉的成分之一或組合的適當?shù)娜軇┲袚饺胨枇康幕钚曰衔?，接著滅菌微過濾來制備無菌可注射溶液。通常，通過將活性化合物摻入含有基本分散介質(zhì)和來自上面列舉的成分的所需的其它成分的無菌載體來制備分散體。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其從其預先無菌過濾的溶液中產(chǎn)生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。調(diào)整劑量方案以提供最佳期望的應答(例如治療應答)。例如，可以施用單次推注，可以隨著時間施用幾個分開的劑量，或者劑量可按比例減少或增加，如治療情況的緊急程度所指示。例如，本發(fā)明的抗體可以通過皮下或肌內(nèi)注射每周施用一次或兩次，或通過皮下或肌內(nèi)注射每月一次或兩次。以劑量單位形式配制腸胃外組合物以便于施用和劑量一致性是特別有利的。如本文中所用的劑量單位形式是指適合于待治療受試者的單位劑量的物理上離散的單位；每個單位含有計算為與所需藥物載體結合產(chǎn)生期望的治療效果的預定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)則由下列各項規(guī)定并且直接依賴于下列各項：(a)活性化合物的獨特特征和要實現(xiàn)的特定治療效果，和(b)復合此類化合物用于治療個體中敏感性的本領域中固有的局限。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(bha)、丁基化羥基甲苯(bht)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸，磷酸等。對于治療組合物，本發(fā)明的制劑包括適用于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服、鼻、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外施用的那些。制劑可方便地以單位劑量形式呈現(xiàn)，并且可通過藥學領域中已知的任何方法制備?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將根據(jù)所治療的受試者和具體的施用方式而變化?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量通常是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一般地，在100％中，此量的范圍會為約0.001％至約90％活性成分，優(yōu)選約0.005％至約70％，最優(yōu)選約0.01％至約30％。適用于陰道施用的本發(fā)明的制劑還包括含有如本領域中已知為合適的載體的子宮套、棉塞、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑。用于本發(fā)明組合物的局部或透皮施用的劑型包括粉末、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏、洗劑、凝膠劑、溶液、貼劑和吸入劑。活性化合物可以在無菌條件下與藥學上可接受的載體，并且與任何可能需要的防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。如本文中使用，短語“腸胃外施用”和“腸胃外施用的”是指通常通過注射的除了腸和局部施用以外的施用模式，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注。可用于本發(fā)明的藥物組合物中的合適的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物、植物油如橄欖油，和可注射的有機酯，如油酸乙酯。可以例如通過使用涂層材料，如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒度，以及通過使用表面活性劑保持適當?shù)牧鲃有浴＿@些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^滅菌程序，同上和通過包括各種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸等來確保防止微生物的存在。還可以期望將等張劑，如糖、氯化鈉等納入組合物中。此外，可注射藥物形式的延長吸收可以通過包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。當以藥物對人和動物施用本發(fā)明的化合物時，可以單獨或作為藥物組合物給予它們，所述藥物組合物含有例如0.001至90％(更優(yōu)選為0.005至70％，如0.01至30％)與藥學上可接受的載體組合的活性成分。不管選擇的施用途徑，可以以適合的水合形式使用的本發(fā)明化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法配制成藥學上可接受的劑型?？筛淖儽景l(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平，以獲得一定量的活性成分，其對于特定患者、組合物和施用模式有效實現(xiàn)期望的治療應答，而對患者無毒。所選擇的劑量水平將取決于多種藥代動力學因素，包括所采用的本發(fā)明的特定組合物，或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時間、采用的具體化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時間、與所采用的具體組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、所治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康和先前病史以及醫(yī)學領域中公知的類似因素。具有本領域普通技術的內(nèi)科醫(yī)生或獸醫(yī)可以容易地確定和規(guī)定所需藥物組合物的有效量。例如，內(nèi)科醫(yī)生或獸醫(yī)可以以比為實現(xiàn)期望治療效果而要求的水平低的水平開始藥物組合物中使用的本發(fā)明化合物的劑量，并逐漸增加劑量直到實現(xiàn)期望的效果。通常，本發(fā)明的組合物的合適的日劑量將是有效產(chǎn)生治療效果的最低劑量的化合物的量。此類有效劑量通常將取決于上文描述的因素。優(yōu)選施用是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，優(yōu)選在目標部位附近施用。如果想要的話，治療組合物的有效日劑量可以以在貫穿整天的合適間隔分開施用(任選以單位劑型)的2、3、4、5、6或更多個亞劑量施用。盡管有可能單獨施用本發(fā)明的化合物，但是優(yōu)選以藥物制劑(組合物)施用化合物。可以用本領域中已知的醫(yī)學裝置施用治療組合物。例如，在優(yōu)選的實施方案中，可以用無針刺的皮下注射裝置施用本發(fā)明的治療組合物，例如美國專利號5,399,163,5,383,851,5,312,335,5,064,413,4,941,880,4,790,824或4,596,556中公開的裝置。用于本發(fā)明的公知的植入物和模塊的實例包括：美國專利no.4,487,603，其公開了一種用于以受控速率分配藥物的可植入微輸注泵；美國專利號4.,486,194，其公開了一種用于通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國專利號4,447,233，其公開了一種用于以精確的輸液速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國專利號4,447,224，其公開了一種用于連續(xù)藥物遞送的可變流動可植入輸注裝置；美國專利號4,439,196，其公開了一種具有多腔區(qū)室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；和美國專利號4,475,196，其公開了滲透藥物遞送系統(tǒng)。許多其它此類植入物、遞送系統(tǒng)和模塊是本領域技術人員已知的。在某些實施方案中，可以配制本發(fā)明的抗體以確保在體內(nèi)適當分布。例如，血腦屏障(bbb)排除許多高親水性化合物。為了確保本發(fā)明的治療化合物穿過bbb(如果想要的話)，它們可以在例如脂質(zhì)體中配制。關于制備脂質(zhì)體的方法，參見例如美國專利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂質(zhì)體可包含一個或多個選擇性轉(zhuǎn)運到特定細胞或器官中的部分，從而增強靶向藥物遞送(參見例如v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括葉酸或生物素(參見例如low等的美國專利5,416,016)；甘露糖苷(umezawa等,(1988)biochem.biophys.res.commun.153:1038)；抗體(p.g.bloeman等(1995)febslett.357:140；m.owais等(1995)antimicrob.agentschemother.39:180)；表面活性蛋白a受體(briscoe等(1995)am.j.physiol.1233:134)，其不同種類可以包含本發(fā)明的制劑以及本發(fā)明分子的組分；p120(schreier等(1994)j.biol.chem.269:9090)；還可見k.keinanen；m.l.laukkanen(1994)febslett.346:123；j.j.killion；i.j.fidler(1994)immunomethods4:273。在本發(fā)明的一個實施方案中，在脂質(zhì)體中配制本發(fā)明的治療化合物；在更優(yōu)選的實施方案中，脂質(zhì)體包含靶向部分。組合物必須是流體，以至于存在易于注射的程度。它在制造和儲存的條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須防止諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。組合物必須是無菌的并且是流體的，以至于可通過注射器遞送組合物。除了水之外，載體可以是等張緩沖鹽溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，可以通過使用諸如卵磷脂的涂層材料，在分散體的情況下通過維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑保持適當?shù)牧鲃有?。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等張劑，例如糖、多元醇如甘露糖醇或山梨糖醇、和氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長期吸收可以通過在組合物中包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁或明膠來實現(xiàn)。當適當保護活性化合物時，如上所述，化合物可以例如用惰性稀釋劑或可同化的可食用載體口服施用。iv.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的抗c6抗體能夠在體外和體內(nèi)功能上抑制c6，使得需要c6的膜攻擊復合物的形成受到抑制。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及在受試者中抑制膜攻擊復合物(mac)形成或活性的方法，所述方法包括以有效抑制受試者中的mac形成或活性的量對受試者施用本發(fā)明的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療、預防或減少由受試者中補體系統(tǒng)的不期望活性介導的病癥癥狀的方法，所述方法包括對受試者施用有效量的本發(fā)明的抗體。在下面進一步描述這種疾病的實例。如美國專利8,703,136(其全部內(nèi)容通過引用明確并入本文)中詳細描述，已經(jīng)建立了可以通過抑制補體系統(tǒng)來增強軸突再生。因此，抗c6抗體用于抑制補體系統(tǒng)，特別是抑制mac形成的用途可用于治療需要軸突再生的狀況，例如，在受到中央或周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病影響的哺乳動物中?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明治療的需要軸突再生的狀況包括身體損傷以及周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)變性疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體促進軸突再生。如本文中使用，術語“促進軸突再生”或“促進神經(jīng)再生”與減少或預防軸突或神經(jīng)變性區(qū)分。軸突或神經(jīng)再生的促成(或促進)在本文中理解為意味著與未治療的受試者相比，治療的受試者中的軸突或神經(jīng)的再生得到改善。優(yōu)選地，改善的軸突再生是與未治療的受試者相比在治療的受試者中在較早的時間點(在軸突或神經(jīng)損傷之后或治療開始之后)發(fā)生的再生。改善的軸突或神經(jīng)再生還可以包括與未治療的受試者相比在治療的受試者中以較高的速率和/或更大的程度發(fā)生的再生。因此，根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選產(chǎn)生感覺或運動功能的增益。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中再生神經(jīng)的方法，包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在受試者中促進受損傷或變性的神經(jīng)的恢復的方法，包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供減少或延緩受試者中的神經(jīng)變性的方法，包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體。受試者可以患有神經(jīng)的身體損傷，如周圍神經(jīng)系統(tǒng)(pns)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的損傷，例如來自身體損傷的神經(jīng)創(chuàng)傷(下文進一步討論)。身體損傷可以是例如創(chuàng)傷性損傷(例如事故)、手術損傷或非創(chuàng)傷性損傷(例如神經(jīng)壓迫)。在一個實施方案中，在損傷部位處或附近施用抗體?；蛘?，受試者可患有可為獲得性和/或遺傳性的疾病，如免疫介導的炎性病癥和/或進行性神經(jīng)變性性病癥，如慢性脫髓鞘性神經(jīng)病，如多發(fā)性硬化癥(ms)或其它神經(jīng)變性性病癥，如重癥肌無力或肌萎縮側索硬化(als)(下文進一步討論)。軸突再生的改善優(yōu)選通過在人受試者中相對容易進行的功能測試來確定，例如，感覺或運動功能的恢復優(yōu)選如在本領域可用的標準化測試中確定(參見例如k.h等(2006)scand.j.plast.reconstr.surg.handsurg.40:219-224；jerosch-herold(2005)handsurg.30:252-264。合適的測試優(yōu)選是定量的，標準化的，并且更優(yōu)選地對其心理測量特性進行評估和量化。此類測試包括例如weinstein增強感覺測試(west)或semmes-weinstein單絲測試(swmt)和用于觸覺感知的形狀紋理鑒定(sti)測試。可以在測試動物中通過用于恢復感覺或運動功能的功能測試憑實驗測定改進的軸突再生，如由hare,g.m.t等(1992)plastic和reconstr.surg.89:251-258和dekoning,p.等(1986)j.neurol.sci.74:237-246描述?？贵w優(yōu)選產(chǎn)生感覺或運動功能的增益，如可以在例如上文指定的測試中測定。實施例8詳細描述了可用于測試本發(fā)明的抗c6抗體對感覺功能的影響的動物模型。這種神經(jīng)擠壓模型(坐骨神經(jīng)擠壓)用于測試抗人c6單克隆抗體對補充有人c6的c6敲除大鼠(pvc)中的感覺功能的恢復的影響。神經(jīng)擠壓是周圍神經(jīng)損傷的一種模型。參見wo2010/005310(pct/nl2009/050418)；以及dejonge等(2004)hummolgenet.13(3):295-302。改善的軸突再生也可以通過組織學檢查在測試動物中憑實驗測定，例如可以通過比較經(jīng)處理的動物與未處理動物中的軸突周圍的髓鞘測量來確定改善的再髓鞘形成，由此較厚的髓鞘指示改善的再髓鞘形成。與未處理的動物中的較小軸突的簇相比，可將更有效的軸突再生確定為處理的動物中單一、大直徑軸突芽的產(chǎn)生?？贵w的合適劑量是有效促進軸突再生的量，如通過如上所述的感覺或運動功能的改善可以看出的。“有效量”、“治療量”或“有效劑量”是指足以引起期望藥理學或治療效果，因此導致對損傷或病癥的有效治療的量。為了最小化神經(jīng)損傷和/或盡可能促進軸突再生，在本發(fā)明的方法中，抗體優(yōu)選在神經(jīng)損傷發(fā)生后不久施用，即在發(fā)生神經(jīng)損傷后24、12、6、3、2或1小時內(nèi)，更優(yōu)選在45、30、20或10分鐘內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以在具有神經(jīng)損傷的風險的手術(見下文)前施用抗體(例如作為預防措施)，以便最小化神經(jīng)損傷和/或在神經(jīng)的手術損傷后立即促進軸突再生?？梢杂帽景l(fā)明的抗體治療需要軸突再生的多種狀況。狀況包括pns的損傷以及cns的損傷。此類狀況包括由于身體損傷所致或源自疾病的神經(jīng)創(chuàng)傷。此類疾病包括免疫介導的炎性病癥或損傷和/或可以是獲得性和/或遺傳性的進行性神經(jīng)變性性病癥。pns和cns的身體損傷可以是創(chuàng)傷性損傷，包括手術損傷或非創(chuàng)傷性損傷?？捎帽景l(fā)明的方法和/或藥物治療的創(chuàng)傷性pns和cns損傷包括脊髓損傷，以及對周圍神經(jīng)的創(chuàng)傷性傷口，包括來自碰撞、電動車輛事故、槍傷、骨折、脫位、撕裂或穿透性創(chuàng)傷的一些其它形式的損傷。經(jīng)由可以治療的創(chuàng)傷損傷的外周神經(jīng)包括指神經(jīng)、正中神經(jīng)、尺骨神經(jīng)、橈骨神經(jīng)、面神經(jīng)、脊髓副神經(jīng)和臂叢神經(jīng)。本文中將手術pns損傷理解為當它對于在手術程序期間除去或解剖神經(jīng)變得臨床必需時出現(xiàn)的對外周神經(jīng)的損傷。這發(fā)生在每年數(shù)以千計的外科程序中?？捎帽景l(fā)明的方法和/或藥物治療的手術損傷的外周神經(jīng)的一個實例包括例如支持勃起功能和膀胱控制的海綿狀神經(jīng)；這些神經(jīng)在手術除去前列腺腫瘤及其周圍的組織期間經(jīng)常受損?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明治療的手術損傷的外周神經(jīng)的另一個例子是冠狀動脈旁路移植術(cabg)后的膈神經(jīng)。可用本發(fā)明的抗體治療的非創(chuàng)傷性物理pns損傷包括外周神經(jīng)的壓迫和/或粘附，也稱為陷夾綜合征。最常見的陷夾綜合征是腕管綜合征。此外，可用本發(fā)明的抗體治療免疫介導的炎性病癥或損傷。這些包括中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病，其被認為具有自身免疫基礎，并且由于直接對少突膠質(zhì)細胞或髓磷脂引起的損傷而導致神經(jīng)脫髓鞘。此類脫髓鞘疾病包括例如格-巴二氏綜合征(gbs；也稱為炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、急性特發(fā)性多神經(jīng)根神經(jīng)炎、急性特發(fā)性多神經(jīng)炎、法國小兒麻痹和蘭德里上行性麻痹)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體應用于促進gbs中的急性期后的軸突再生。類似地，認為是gbs的慢性對應物的慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(cidp)可用本發(fā)明的抗體治療。多發(fā)性硬化癥(ms)是可用本發(fā)明的抗體治療的另一種脫髓鞘疾病。具有可用本發(fā)明抗體治療的遺傳成分的進一步的神經(jīng)變性性cns和/或pns病癥包括肌萎縮側索硬化癥(als，有時稱為lougehrig氏病)、夏科-馬里-圖思病(遺傳性運動和感覺神經(jīng)病，hmsn)和亨廷頓病(hd)。通過以下實施例進一步說明本發(fā)明，這些實施例不應解釋為進一步限制。貫穿本申請引用的序列表、數(shù)字和所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內(nèi)容通過引用明確并入本文。實施例實施例1：產(chǎn)生大鼠抗人c6單克隆抗體通過用人c6蛋白免疫5只pvgc6-/-株大鼠產(chǎn)生大鼠抗人c6單克隆抗體。選擇c6缺陷型大鼠，因為根據(jù)目前在該領域中的理解，在正常嚙齒類中產(chǎn)生功能性c6抗體是非常困難的。假設由于人和嚙齒類之間c6蛋白的高度同源性，針對c6的免疫在野生型動物中不是有效的。c6缺陷型動物中的抗體應答是更穩(wěn)健的，因為這些動物在循環(huán)中沒有功能性c6蛋白，因此可能認為c6是完全“外來的”。使用與sepharose(gehealthcarecatno.17-0717-01)偶聯(lián)的23d1小鼠單克隆抗體23d1(詳細記載于l.clayton(2005)博士論文,cardiffuniversity)通過親和層析從全人血清純化人c6?？乖兔庖撸好庖咔耙恢?，通過從尾靜脈收集100μl血液對大鼠進行免疫前出血。在免疫的第1天，在四個位置處給大鼠皮下(s.c.)注射每次注射的體積250μl中在完全弗氏佐劑(cfa)中的100μgc6抗原。再次在四個s.c.位置處用每次注射的體積250μl中在不完全弗氏佐劑(cfa)中的50μgc6抗原在第14天和第21天進行加強注射。在第36天通過從尾靜脈收集100μl血液進行測試出血，用于體外測試。在c6elisa、c6western印跡和溶血測定法(下文進一步描述)中分析這些測試出血，其顯示所有五只大鼠對人c6具有陽性免疫應答：所有五只大鼠具有在溶血測定法中阻斷溶血的抗體并且所有五只大鼠均具有識別western印跡(變性條件)上純化的c6的抗體。在第62天通過腹膜內(nèi)注射250μlpbs中的100μg抗原進行融合前加強。最后，在第64天通過靜脈內(nèi)(尾靜脈)注射250μlpbs中的100μg抗原進行融合前加強。在第66天收獲來自兩只大鼠的脾臟(其它三只大鼠作為備用)，并且使用分離的脾細胞制備雜交瘤。雜交瘤制備：使用標準聚乙二醇(peg)介導的融合基本上如luk,j.m.等(1990)j.immunol.methods129:243-250中所述，通過將來自人c6免疫的大鼠的脾細胞與y3-ag1.2.3融合伴侶細胞融合來制備雜交瘤。收獲上清液，并且用于使用用人c6抗原包覆的96孔板經(jīng)由elisa初步篩選抗人c6抗體。選擇陽性克隆并進行亞克隆。選擇38個陽性克隆進行進一步分析。溶血測定法：使用人血清作為補體來源，以1:50稀釋度在溶血測定法中進一步測試這38種上清液和對照上清液。在該測定法中，在血清存在下溫育用補體激活抗原包覆的紅細胞。血清含有補體系統(tǒng)的組分，當遇到包覆的紅細胞時，它們通過經(jīng)典途徑激活。膜攻擊復合物(mac)作為末端補體系統(tǒng)的一部分形成，并且mac啟動紅細胞裂解?？梢酝ㄟ^測量上清液中405nm或415nm處的od來量化紅細胞裂解，并且是對mac的活性的直接測量。可以在此系統(tǒng)中測試補體抑制劑，因為如果它們是有效的，則它們將以定量的方式防止紅細胞裂解。為了進行測定法，商業(yè)上獲得即用的溶血系統(tǒng)(virion/seriongmbh,wurzburg,gemany)以及cft緩沖液(virion/seriongmbh,wurzburg,gemany)。根據(jù)制造商的說明書制備cft緩沖液。將溶血系統(tǒng)置于冷室中的滾筒庫上以充分混合紅細胞。為了制備cft血清混合物，將100μl人血清添加到5mlcft緩沖液。將體積50μl中的測試抑制劑的稀釋液添加到圓底96孔板，向每孔田間50μgcft血清混合物，并在移液時小心混合，并將板在37℃溫育30分鐘。陽性對照為edta。陰性對照為無血清或c6缺乏血清。溫育后，將板以2000rpm向下旋轉(zhuǎn)5分鐘(hettich臺式離心機)，并將80μl上清液轉(zhuǎn)移到平底板上以在405或415nm測量。在轉(zhuǎn)移的10分鐘內(nèi)測量od。在溶血測定法中將測試上清液以稀釋液添加，以測定它們是否防止紅細胞裂解。在圖1a中顯示示例性結果，其證明了某些上清液表現(xiàn)出比其它上清液更強的抑制活性。特別地，上清液#6-12表現(xiàn)出比其它上清液更強的抑制效果，上清液#11和#12顯示出最強的抑制效果。也使用大鼠血清作為補體來源在溶血測定法中測試上清液(1:50稀釋)，并且沒有觀察到抑制效果，證明了抗體的抑制活性對人c6是特異性的。macelisa測定法：使用第二種測定法來測定上清液是否能夠阻斷mac形成。在該測定法中，在血清存在下，分別用甘露聚糖或igg作為用于補體的凝集素或經(jīng)典途徑的觸發(fā)劑包覆板中的elisa孔。血清含有補體系統(tǒng)的組分，當它們暴露于包覆的板時，它們通過任一途徑倍激活。膜攻擊復合物(mac)作為末端補體系統(tǒng)的一部分形成，并且mac將沉積在elisa板上。在板上的mac沉積可以通過綴合有hrp的抗體檢測，并通過在色原體和底物存在下的酶反應顯現(xiàn)。該反應產(chǎn)生可以通過測量450或655nm的od量化的顏色。od是對mac形成量的直接測量?？梢栽谠撓到y(tǒng)中測試補體抑制劑，因為如果它們有效，則它們將防止或抑制mac在板上的沉積。在用于測試雜交瘤上清液的第二種測定法中，進行了甘露聚糖激活的補體elisa測定法。簡言之，用甘露聚糖和稀釋的雜交瘤上清液包覆elisa平板，并且添加人血清?？墒褂每贵w檢測在甘露聚糖包覆的平板上形成復合物的補體成分。在此特定的測定法中，檢測c9作為mac形成的指標。如果相對于缺乏上清液，在上清液的存在下檢測到較少的c9，則這指示mac抑制。使用的陽性對照是edta(因為反應依賴于鈣)。為了進行測定法，制備涂覆緩沖液(15mmna2co3,35mmnahco3,15mmnan3,ph9.6)，封閉緩沖液(1mg/mlbsa/has,10mmtris/hcl,ph7.4,145mmnacl,15nmnan3,ph7.4)清洗緩沖液(1xtbs,0.05％tween20,5mmcacl2)和稀釋緩沖液(4mm巴比妥,145mmnacl,2mmcacl2,1mmmgcl2,0.3％bsa,0.02％tween20)。用100μl含有10μg/μl甘露聚糖(sigma，目錄號m7504)的包覆緩沖液包覆平底高結合96孔板的孔，并在4℃溫育過夜。在室溫下用200μl封閉緩沖液將板封閉1小時。將稀釋緩沖液中的人血清(1:100)用圓底板中的上清液(1:50)稀釋，并將50μl每孔添加到平底高結合板中。將板在37℃溫育1小時，然后用清洗緩沖液清洗3次。將抗c5b-9neo(克隆ae11；dako，目錄號m0777)在稀釋緩沖液中以1:100稀釋，每孔添加50μl，并且將板在室溫下溫育1小時，然后用清洗緩沖液清洗3次。將抗小鼠hrp(dako，目錄號p0447)在稀釋緩沖液中以1:2000稀釋，每孔添加50μl，并且將板在室溫溫育30分鐘，然后用清洗緩沖液清洗3次。為了顯現(xiàn)，將50μltmb色原體(tmb:sigmat2885；在dmso中制備10mg/mltmb的儲備溶液)和10μl3％h2o2添加到5mlnaac緩沖液(在1升h2o中的8.2gm乙酸鈉，21gm檸檬酸一水合物)并分配到96孔板。用25μl1mh2so4終止反應，并且用分光光度計在450nm/655nm測量od。在圖1b中顯示該測定法的示例性結果，其證明了兩種上清液#11和#17具有比其它36種上清液顯著更好的抑制能力，上清液#11具有迄今為止所有分析的克隆的最優(yōu)異的抑制能力。由于上清液#11在溶血測定法和macelisa測定法兩者中都表現(xiàn)出最強的抑制效果，選擇該雜交瘤用于進一步表征。由該雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體在本文中稱為7e5。實施例2：7e5單克隆抗體的表征在該實施例中，進行另外的實驗以進一步檢查大鼠抗人c6單克隆抗體7e5的結合和功能特征。交叉反應性：使用人血清和來自獼猴(cyno)的血清進行western印跡。人和cyno血清用于page(10％凝膠)和標準western印跡法。將抗體以1:500稀釋在印跡上溫育1小時。在las3000(fuji)暗盒成像系統(tǒng)中，使用抗大鼠辣根過氧化物酶(hrp)(dako，1:1000)和lumilight(roche)進行檢測。結果指示7e5能識別人和獼猴c6兩者。結合動力學：為了研究7e5與c6結合的動力學，使用了配備有研究級cm5傳感器芯片的biacore2000(gehealthcare)中的表面等離振子共振測量。使用胺偶聯(lián)化學固定配體(c6，113kda)。流動池2的表面用0.1mnhs(n-羥基琥珀酰亞胺)和0.4medc(3-(n,n-二甲基氨基)丙基-n-乙基碳二亞胺)的1:1混合物以流速5μl/分鐘活化7分鐘。將10mm乙酸鈉(ph5.0)中濃度10μg/ml的配體以955ru的密度固定。用7分鐘注射1m乙醇胺(ph8.0)將表面封閉。用來自較早實驗(αvwwf；987uu)的抗體固定流動池1并充當參考表面。為了收集動力學結合數(shù)據(jù)，將10mmhepes，150mmnacl，0.005％p20，ph7.4中的分析物(抗c6抗體，150kda)以30μl/分鐘的流速和于溫度25℃在兩個流動池上注射。注射的濃度隨抗體不同。以1hz的速率收集數(shù)據(jù)。允許復合物分別結合和解離90和300秒。用0.1mhcl的10秒注射再生表面。每個樣品和緩沖液空白的重復注射(以隨機順序)流過兩個表面。使用biaevaluation4.1軟件中可用的全局數(shù)據(jù)分析選項將數(shù)據(jù)擬合到簡單的1:1交互模型。在圖2中顯示biacore動力學結果。代表性實驗的結果也總結在下表1-4中。表1：通過表面等離振子共振測定的7e5結合的動力學ka1.69x104m-1s-1kd4.27x10-6s-1kd2.53x10-10mrmax36rurmax95％表2：對于7e5結合的復合物半衰期kd(s-1)t1/2(秒)t1/2(分鐘)t1/2(小時)4.27x10-6s-11623302705.545.1表3：對于7e5結合至5％解離的時間kd(s-1)時間(分鐘)時間(小時)r(ru)4.27x10-6s-1200.23.334表4：對于7e5結合至95％解離的時間kd(s-1)時間(分鐘)時間(小時)r(ru)4.27x10-6s-111692.9194.927e5的kd計算為2.5x10-10m。這種高親和力主要是由高抗體-抗原復合物半衰期(45小時)引起的。因此，7e5結合非常穩(wěn)定，7e5-c6復合物的半衰期估計為超過40小時。為了測定抗原-抗體復合物是否可以在由fcγ受體結合和細胞攝取后在內(nèi)體和溶酶體中釋放，在低ph值下測試了7e5-c6復合物的靈敏度。由于在溶酶體中ph約為4.8，測試復合物的穩(wěn)定性直至ph＝4。在此biacore實驗中，用具有降低的ph的緩沖液清洗芯片上的7e5-c6復合物。hepes緩沖鹽水((hbs)用于ph7.4、7.0和6.5。10mm乙酸鈉用于ph6.0、5.5、5.0、4.5和4.0。觀察到復合物的穩(wěn)定性對于低ph不敏感。預溫育對溶血測定法的影響：由于biacore實驗揭示了7e5從c6的緩慢釋放是7e5的kd的主要決定因素，研究了添加紅細胞前7e5與補體來源(人血清)的預溫育是否增加了溶血測定法中的抑制效力。在室溫(20℃)將7e5與人血清預溫育30分鐘、90分鐘或180分鐘，之后添加紅細胞，并且在37℃開始反應。結果顯示了將預溫育時間增加直至3小時不導致溶血抑制的進一步增強。這意味著在該反應中由7e5結合c6的動力學使得c6在數(shù)分鐘內(nèi)被有效復合并完全中和。實施例3：7e5單克隆抗體的表位定位使用肽陣列測定人c6中7e5的表位。合成來自c6蛋白序列的連續(xù)重疊的16聚體肽(16個氨基酸長的肽，重疊14個氨基酸)，并且以網(wǎng)格模式在膜上點樣。然后，將膜與7e5抗體一起溫育以檢測抗體識別哪個肽。由7e5識別的主要肽序列是gscqdgrqlewglert(肽418)(seqidno:1)。隨后，進行對所選擇的肽的丙氨酸掃描(其中丙氨酸用于逐個替換氨基酸)以幫助準確定位表位。在本研究中，除了肽418的修飾之外，具有4個氨基酸的肽相對于418移位，肽420(dgrqlewglertrlss)(seqidno:2)及其幾種丙氨酸修飾顯示7e5的結合。因此，推斷形成7e5主要表位的一部分的氨基酸預期在組合肽418和420的該肽序列內(nèi)：gscqdgrqlewglertrlss(seqidno:3)。圖4a顯示了人(seqidno:50)和大鼠c6(seqidno:51)中肽418和周圍區(qū)域的序列。如圖4b中示意性顯示，肽418部分位于c6的第一fim域的末端。為了確定其它抗體是否與7e5抗體結合相同的表位，進行了biacore交叉阻斷實驗，其中c6抗原與芯片偶聯(lián)，隨后流動分析物，其是單獨的單一抗c6抗體(作為對照)或第一抗c6抗體(抗體1)，然后是第二抗c6抗體(抗體2)以確定交叉阻斷。用于確定小鼠單抗27b1是否與大鼠單抗7e5結合相同的表位的交叉阻斷實驗的結果示于圖3a-d中，其中圖3a顯示了用27b1作為抗體1和7e5作為抗體2的結果，圖3b顯示了用7e5作為抗體1和用27b1作為抗體2的結果。圖3c顯示了單獨的27b1的結果，并且圖3d顯示了單獨的7e5的結果。實施例4：7e5單克隆抗體的體內(nèi)效力為了測試7e5是否能夠在活體動物中阻斷c6，使用補充有人c6的c6缺陷型pgr大鼠。使用這種方法，因為7e5對人c6是特異性的，并且不能阻斷大鼠c6。在c6缺乏型大鼠中，可以注射人c6以恢復完全互補系統(tǒng)功能和mac活性，并且可以測量7e5的效果，而不混淆由c6引起的效應。首先，通過測定注射有人c6的兩只大鼠的溶血活性來測試該方法。通過在注射c6后按時間采集幾份血液樣品，估計大鼠中人c6的半衰期約為48小時。給兩只c6缺陷型大鼠iv注射4mg/kg的人c6。在注射c6后10分鐘、24小時和48小時抽取血液樣品。在所有血液樣品凝結后，通過將凝結物向下旋轉(zhuǎn)(eppendorf桌面離心機中的13,000rpm在室溫持續(xù)10分鐘)分離血清。將血清用于實施例1中所述的溶血測定法中以測定mac活性。使用來自野生型pvg大鼠和未處理的c6缺陷型大鼠的血清作為最大和最小溶血活性的參照。使用溶血測定法，大鼠中人c6的半衰期估計為約48小時。在引導實驗中，給一只雌性c6缺陷型pvg大鼠(220克體重)腹腔內(nèi)注射高劑量12mg7e5，并且補充2mg人c6(靜脈內(nèi)注射)。使用用經(jīng)c6抗體包覆的柱的親和純化從人血清中分離人c6。在7e5推注之前24小時給藥1mgc6并且在之后5分鐘給藥1mgc6。對照大鼠(與7e5處理的大鼠相同的體重)僅接受c6注射。在注射7e5后60分鐘抽取用于溶血測定法的血液。結果顯示在圖5中。結果顯示溶血活性在7e5給藥后60分鐘被7e5阻斷，因此證明7e5可以在體內(nèi)阻斷mac形成。在隨后的實驗中，給兩只c6缺陷型雌性大鼠(pvg株)注射1mgc6。在c6注射之前和c6注射之后(iv1mg)采集血液樣品以建立正常和補充的溶血活性。c6注射后10分鐘，7e5以8mgip(腹腔注射)或2mgiv(靜脈注射)給藥。7e5給藥后60分鐘，采集血液樣品以評估7e5對溶血活性的影響。這兩種給藥策略都阻止了血液中的mac活性。然后，在同一只大鼠中iv注射另一份1mgc6。新c6補充后15分鐘內(nèi)的血液采樣僅顯示溶血活性的適度增加，推測溶血活性在兩只大鼠中仍然被游離的循環(huán)7e5抑制。這些上述實驗證明7e5能夠在活的動物中阻斷c6。實施例5：7e5單克隆抗體的測序和重組表達通過標準程序測定7e5單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。vh區(qū)的核苷酸序列如下：gaggtgcagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagcctcaggattctctttcagtgactattacatggcctgggtccgccagggtccaacgaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaacgcaccctatacctgcaaatggacagtctgaggtctgaggacacggccacttattactgttcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:4)vh區(qū)的氨基酸序列如下：evqlvesdgglvqpggslklscvasgfsfsdyymawvrqgptkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnakrtlylqmdslrsedtatyycsrpstealfaywghgtlvtvss(seqidno:5)vhcdr1、cdr和cdr3的氨基酸序列如下：cdr1:dyyma(seqidno:6)cdr2:tinydgsstyyresvkg(seqidno:7)cdr3:pstealfay(seqidno:8)vl區(qū)的核苷酸序列如下：gatgttgtgctgacccagactccatccacattatcggctaccattggacaatcggtctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaggcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtggagtggaggctgaggatttgggaatttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagctgggaccaacctggaactgaaa(seqidno:9)vl區(qū)的氨基酸序列如下：dvvltqtpstlsatigqsvsiscrssqsllndvgntylywylqrpgqspqlliylvsdlgsgvpnrfsgsgsgtdftlkisgveaedlgiyycmqashapytfgagtnlelk(seqidno:10)vlcdr1、cdr和cdr3的氨基酸序列如下：cdr1:rssqsllndvgntyly(seqidno:11)cdr2:lvsdlgs(seqidno:12)cdr3:mqashapyt(seqidno:13)在引入用于克隆和優(yōu)化編碼序列以在生產(chǎn)細胞系(hek-293細胞)中表達的適當限制性位點之后，制備表達盒。將7e5的合成的重鏈和輕鏈可變域克隆到pmqr真核表達載體組(pmqr-higg1和pmqr-higk)中，從而產(chǎn)生人-大鼠嵌合重組抗體。所得的克隆的序列分析指示者兩個序列都是正確克隆的。將攜帶7e5可變域的pmqr真核表達載體轉(zhuǎn)染到hek-293細胞中，并使這些細胞產(chǎn)生重組抗體。生成后，通過捕獲elisa在用過的上清液中檢測到higg1/higk抗體。顯示轉(zhuǎn)染上清液含有0.019mg/ml的重組7e5。實施例6：7e5單克隆抗體的人源化作為基于定點誘變循環(huán)的抗體人源化方法的備選，使用基于如由hwang及其同事(methods.2005.36:35-42)所描述的人和鼠抗體之間的cdr-同源性的人源化方法將大鼠7e5單抗人源化。此方法基于以下原理：如果非人和人抗體具有相似結構的cdr，則人框架也將支持非人cdr，具有良好的親和力保留。在該方法中，基于人cdr與待人源化的抗體的cdr(相同的chothia規(guī)范結構)的結構相似性，從人種系基因的組中選擇人框架序列。產(chǎn)生含有偏離的fr殘基的fab變體序列的噬菌體展示文庫。在親和力驅(qū)動的選擇之后，篩選單個克隆的結合和解離速率，并且確定序列人同一性和同源性。在本工作中應用的將7e5大鼠抗體人源化的方法由以下步驟組成：1-人源化文庫的設計：鑒定最接近的人種系并且鑒定與這些人種系偏離的大鼠vh和vkfr殘基。2-組裝7e5基因文庫(使用重疊寡核苷酸通過pcr合成產(chǎn)生可變重(vh)和輕(vl)鏈編碼基因)。3-將這些基因文庫克隆到含有人恒定重(ch1)和輕(cκ)鏈(文庫構建)的噬菌粒(pcb13-ck1/3)中。4-使用噬菌體和親和力選擇來選擇功能性fab。5-篩選解離速率(biacore)和測序。6-選擇在沒有對hc6的結合損失的情況下具有最高人同一性和同源性的fab。7-生成和純化8種人源化前導物以用于進一步的親和力測定和功能測定法。人源化文庫設計：使用大鼠7e5抗體可變域的核苷酸和氨基酸序列和公共數(shù)據(jù)庫ant工具，確認7e5使用ighv5s45*01,ighd1-6*01,ighj3*01和igkv2s27*01,igkj2-3*01作為種系區(qū)段。還推斷7e5的cdrh1和cdrh2的典型折疊組合為1-3，并且對于7e5的cdrl1和cdrl2為4-1。7e5vh序列與具有cdr1和cdr2的相同的規(guī)范折疊組合1-3的人種系的比較揭示了人種系vh3家族成員1作為最接近的匹配。最接近人jh種系是ighj4。針對這些種系區(qū)段的比對示于圖6a中。7e5重鏈氨基酸序列也顯示在seqidno:5中。人種系vh3_1氨基酸序列也顯示在seqidno:48中。指示fr和cdr，其能夠鑒定偏離人種系的fr殘基。使用類似的分析，確定對于7e5vκ序列，最接近的人種系是人vk2家族成員5。最接近的人jh種系是igkj2和igkj5。針對這些種系區(qū)段的比對示于圖6b中。7e5輕鏈氨基酸序列也顯示在seqidno:10中。人種系vk2_5氨基酸序列也顯示在seqidno:49中。指示fr和cdr，其能夠鑒定偏離人種系的fr殘基。如圖6a和6b中所示，對于7e5vh序列有13個位置并且對于7e5vκ有16個位置，對于所述位置，對于人源化文庫摻入人殘基，而且還有大鼠殘基(在變化對于抗原結合會是有害的情況下)?？紤]到突變位置的數(shù)目和每個位置的變體數(shù)目，覆蓋引入的多樣性的文庫大小對于人源化vh和vκ文庫分別會是8.2x103和9.8x104。人源化7e5fab文庫構建：為了構建最終的人源化7e5fab噬菌體展示文庫，最初構建了兩個不同的亞文庫：1-vh人源化fab亞文庫，其中將人源化7e5vh基因與野生型7e5vκ一起克隆到pcb13-ck3噬菌粒中，所述噬菌粒含有編碼人恒定域ch1和cκ的基因。2-vl人源化fab亞文庫，其中將人源化的7e5vκ基因與野生型7e5vh一起克隆到噬菌粒載體pbb-ck1和pcb13-ck3中，所述噬菌粒載體pbb-ck1和pcb13-ck3含有編碼人恒定域ch1和cκ的基因。由于使用的兩種不同噬菌粒的克隆策略和序列，從pcb13-ck1產(chǎn)生的克隆的輕鏈v域的位置104至107中的殘基將對應于leik(人源化7e5序列)，而在pcb13-ck3中產(chǎn)生的克隆的v域輕鏈將在相同位置中顯示氨基酸lelk(7e5野生型vκ序列)。將兩個所得的亞文庫針對人c6淘選，并回收結合克隆以繼續(xù)最終fab文庫構建，其中重鏈和輕鏈兩者都是人源化的。合成基因組裝：為了構建不同的人源化重鏈和輕鏈亞文庫，通過基因組裝產(chǎn)生人源化的7e5vh和vκ基因(cherry,j.等(2008)jbiochembiophysmethods,70:820-2；stemmer,w.p.等(1995)gene,164:49-53)。人源化7e5vh和vκ亞文庫構建：為了構建7e5vhfab亞文庫，通過基因組裝產(chǎn)生的約400bp的合成vh基因和編碼7e5vκ野生型的dna片段克隆到噬菌粒pcb13-ck3(含有人恒重和κ輕鏈編碼基因)。為了構建7e5vκfab亞文庫，分別經(jīng)由apali/xhoi位點和ncoi/nhei將通過基因組裝產(chǎn)生的約400bp的合成vκ基因和編碼7e5vh野生型的dna片段克隆到噬菌體pcb13-ck1和pcb13-ck3(含有人恒定重和κ輕鏈編碼基因)的等摩爾混合物中。通過電穿孔源自克隆過程的新載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌tg1細胞中。通過lba羧芐青霉素(100μg/ml)，葡萄糖2％上的tg1轉(zhuǎn)化細胞的5μl斑點(spot)計算文庫的大小，并通過菌落pcr測定fab插入物的百分比。亞文庫的大小和插入物百分比總結在表5中。表5：人源化7e5亞文庫獲取的大小和插入物百分比還通過每個文庫的48個克隆的dna序列分析對亞文庫進行qc。使用clc主要工作臺軟件提取氨基酸序列。分析有效的vh和vκ序列以及每個位置的野生型或突變殘基的頻率揭示了成功設計和構建了亞文庫，野生型/突變比率約為50/50(對于vκ基因中的位置103為33/33/33)，并且如設計的那樣獲得fr突變的平均數(shù)目。人源化7e5vh和vκ亞文庫的淘選選擇：從兩個亞文庫制備噬菌體，并用于在包覆的人c6上的第一輪選擇。這輪選擇的目的是清除來自非結合fab的亞文庫，因此不應用嚴格的條件。對于淘選選擇，將5和0μg/ml的人c6在96孔maxisorp板(nunc)中包覆，并用低脂奶粉(pbs中的marvell4％)封閉。在與亞文庫噬菌體溫育2小時和隨后清洗后，在室溫進行胰蛋白酶洗脫(10mg/ml)。通過應用16mm蛋白酶抑制劑absf立即中和蛋白酶活性。將所有噬菌體輸出感染到對數(shù)生長的大腸桿菌tg1細胞中，并且將5μl感染的細菌在瓊脂平板(lbagluc2％carb100μg/ml)上鋪板，用于分析輸出和富集測定。計算富集為從人c6洗脫的噬菌體數(shù)對從無蛋白條件洗脫的噬菌體數(shù)之間的比率。觀察到與人源化7e5vκ和vhfab亞文庫兩者的背景(pbs)相比非常好的富集。最終人源化7e5fab噬菌體展示文庫的構建：通過將從選自7e5vhfab亞文庫的克隆回收的人源化重鏈(vhch)與選自7e5vκfab亞文庫的回收的人源化輕鏈(vκcκ)組合構建最終的人源化7e5fab文庫。所得文庫的大小由lba羧芐青霉素(100μg/ml)，葡萄糖2％上的tg1轉(zhuǎn)化細胞的5μl斑點計算，并通過菌落pcr測定fab插入物的百分比。人源化7e5fab文庫的選擇：為了選擇沒有親和力喪失或甚至具有改善的親和力的人源化變體，當與大鼠野生型7e5抗體相比時，使用生物素化的hc6抗原進行用人源化7e5fab文庫的溶液中噬菌體展示選擇。將人c6生物素化，并通過sds-page、western印跡和elisa使用抗人c6抗體7e5進行qc，以檢測在neutravidin包覆的平板上捕獲的生物素化的c6。進行三個連續(xù)輪次的親和力驅(qū)動的選擇，其中抗原濃度在各輪次間減少，以及噬菌體輸入也從第1輪到第2輪減少。在第二和第三輪選擇中，也在存在過量的非生物素化的c6的情況下溫育用neutravidin捕獲的人c6溫育的噬菌體達2小時或過夜(解離速率選擇)以在幾次清洗后，除去高解離速率結合克隆。作為對照，平行地進行類似的選擇，其中將噬菌體與neutravidin捕獲的人c6和pbs而不是非生物素化的hc6(無解離速率選擇)一起溫育。將所有噬菌體選擇輸出感染到對數(shù)生長的大腸桿菌tg1細胞中，并且將5μl感染的細菌在瓊脂平板(lbagluc2％carb100μg/ml)上鋪板，用于分析產(chǎn)物和富集測定。計算富集為從人c6洗脫的噬菌體數(shù)與從無蛋白條件洗脫的噬菌體數(shù)之間的比率。與背景(pbs)相比，獲得了非常好的富集。從人源化7e5fab文庫中選擇的克隆的結合篩選：將用在第二和第三輪解離速率選擇后獲得的洗脫的噬菌體合并物感染的大腸桿菌tg1的單個菌落在37℃在含有100μl2ty葡萄糖2％羧芐青霉素100μg/ml的兩個96孔板(主板)中培養(yǎng)8小時，在-80℃在20％甘油中貯存并用于后續(xù)測序和周質(zhì)提取物產(chǎn)生。用來自第二輪選擇和第三輪選擇的克隆產(chǎn)生總共兩個主板(mp)。從這些mp產(chǎn)生含有可溶性單克隆fab(周質(zhì)提取物)的細菌提取物。通過添加異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至終濃度為1mm，在od6000.8時誘導單克隆細菌小規(guī)模培養(yǎng)物。然后，通過在pbs中凍融細菌團粒并隨后離心以除去細胞碎片來制備含有fab的周質(zhì)提取物(p.e.)。為了確定所選擇的克隆的靶物結合能力，測試1:5稀釋的p.e.結合到neutravidin包覆的maxisorp板上捕獲的10nm生物素化hc6。從大鼠7e5野生型fab制備的p.e.用作陽性對照?？瞻譸.e.(從mp中未接種的孔制備)用作陰性對照。用與辣根過氧化物酶(hrp)綴合的抗c-myc小鼠抗體檢測p.e.與靶物的結合。對于兩種mp獲得了40％的結合命中率，并且陽性克隆的結合信號(o.d.450nm值)與用親本大鼠7e5fab獲得的信號相當。結合人c6的所選克隆的解離速率篩選和人同一性和同源性的分析：對于陽性結合克隆，使用spr方法測定hc6的解離速率，并且平行地對編碼重鏈和輕鏈可變域的dna測序。為了測試解離速率，使用了biacore3000(gehealthcare)。為此目的，在cm5傳感器芯片(gehealthcarebr-1000-12)上固定乙酸緩沖液ph4.5中50μg/mlhc6至約2000ru。測試再生條件，并使用2x10μl的10mmnaoh和1mnacl進行樣品注射之間的再生。將30μl如上所述制備的p.e.在120μlhbs-ep緩沖液中稀釋，并且自此以30μl/min的流速注射60μl。在400秒期間測量解離，并通過應用1:1langmuir解離擬合模型測定解離速率。平行地，為了分析人同一性和同源性，對編碼顯示與hc6特異性結合的克隆的可變重鏈和輕鏈的dna進行測序。使用clc主要工作臺軟件提取氨基酸序列。將vκ和vh序列相對于參考序列(7e5野生型)分開比對。使用abligner軟件分析所有序列以測定人同一性(在最接近的匹配種系中找到的主鏈殘基的分數(shù))和人同源性(在最接近的匹配種系或相同亞類的其它種系中找到的主鏈殘基的分數(shù))的百分比?？傮w上，elisa和biacore數(shù)據(jù)之間觀察到良好的相關性，以及還有從88-99％變化的良好的人同一性和同源性百分比值。選擇了具有良好結合、解離速率和人同一性以及同源性數(shù)據(jù)的8個克隆的前導組，稱為8g09、7e12、7g09、8f07、7f06、7f11、7e11和7f02。下文顯示了8個人源化克隆的前導組的重鏈和輕鏈可變域的完整核苷酸和氨基酸序列：8g09vh和vl核苷酸序列：8g09vhgaggtgtagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgagactctcctgtgtagcctcaggattcactttcagtgactattacatggcctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaacgcaccctatacctgcaaatggacagtctgagggctgaggacacggccgtttattactgtgcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccaaggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:14)8g09vκgatattgtgctgacccagactccattgacattatcggttacccctggacaatcggtctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaagcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtagagtggaggctgaggatgtgggagtttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagcggggaccagactcgagatcaaa(seqidno:15)7e12vh和vl核苷酸序列：7e12vhgaggtgtagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcactttcagtgactattacatggcctgggtccgccagggtccagggaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaaaacaccctatacctgcaaatgaacagtctgagggctgaggacacggccacttattactgtgcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:16)7e12vκgatgttgtgctgacccagactccatcgacattatcggttacccctggacaaccggcctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaagcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtagagtggaggctgaggatgtgggaatttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggacaggggaccaacctcgagatcaaa(seqidno:17)7g09vh和vl核苷酸序列：7g09vhgaggtgtagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctcaggattcactttcagtgactattacatggcctgggtccgccagggtccaacgaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaaaacaccctatacctgcaaatggacagtctgagggctgaggacacggccgtttattactgtgcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:18)7g09vκgatgttgtgctgacccagactccatcgtcattatcggttacccctggacaatcggcctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaagcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccgacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtagagtggaggctgaggatttgggaatttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggacaggggaccaaactcgagctgaaa(seqidno:19)8f07vh和vl核苷酸序列：8f07vhgaggtgtagctggtggagtctggtggaggcttagtgcagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctcaggattctctttcagtgactattacatggcctgggtccgccagggtccagggaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaaaacaccctatacctgcaaatgaacagtctgaggtctgaggacacggccacttattactgtgcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:20)8f07vκgatgttgtgctgacccagactccattgacattatcggttacccctggacaatcggtctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaagcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccgacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtggagtggaggctgaggatgtgggagtttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagcggggaccaaactcgagatcaaa(seqidno:21)7f06vh和vl核苷酸序列：7f06vhgaggtgtagctggtggagtctggtggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcactttcagggactattacatggcctgggtccgccagggtccagggaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaaaacagcctatacctgcaaatggacagtctgagggctgaggacacggccgtttattactgtgcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:22)7f06vκgatgttgtgctgacccagactccattgacattatcggttacccctggacaaccggtctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaagcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtagagtggaggctgaggatgtgggagtttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagcggggaccagactcgagctgaaa(seqidno:23)7f11vh和vl核苷酸序列：7f11vhgaggtgtagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcactttcagtgactattacatggcctgggtccgccagggtccaacgaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaaaacaccctatacctgcaaatgaacagtctgagggctgaggacacggccgtttattactgttcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:24)7f11vκgatgttgtgctgacccagactccatcgacattatcggttacccctggacaaccggtctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaagcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtggagtggaggctgaggatgtgggagtttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagcggggaccagactcgagatcaaa(seqidno:25)7e11vh和vl核苷酸序列：7e11vhgaggtgcagctggtggagtctggtggaggcttagtgcagcctggagggtccctgagactctcctgtgtagcctcaggattcactttcagtgactattacatggcctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaaaacaccctatacctgcaaatggacagtctgagggctgaggacacggccgtttattactgtgcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccaaggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:26)7e11vκgatattgtgctgacccagactccattgtcattatcggctacccctggacaatcggtctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaggcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccgacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtagagtggaggctgaggatgtgggagtttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagcggggaccaacctcgagatcaaa(seqidno:27)7f02vh和vl核苷酸序列：7f02vhgaggtgcagctggtggagtctggtggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctcaggattcactttcagtgactattacatggcctgggtccgccagggtccagggaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactatcgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaaaacagcctatacctgcaaatgaacagtctgaggtctgaggacacggccgtttattactgtgcaagaccttctacggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca(seqidno:28)7f02vκgatgttgtgatgacccagactccatcgacattatcggctacccctggacaatcggcctccatctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattggtatctacagaagcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctgggatctggggtccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatcagtagagtggaggctgaggatgtgggaatttattactgcatgcaagctagtcatgctccgtacacgtttggagcggggaccagactcgagctgaaa(seqidno:29)8g09vh和vl氨基酸序列：8g09vhevqlvesdgglvqpggslrlscvasgftfsdyymawvrqapgkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnakrtlylqmdslraedtavyycarpstealfaywgqgtlvtvss(seqidno:30)8g09vκdivltqtpltlsvtpgqsvsiscrssqsllndvgntylywylqkpgqspqlliylvsdlgsgvpnrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqashapytfgagtrleik(seqidno:31)7e12vh和vl氨基酸序列：7e12vhevqlvesdgglvqpggslklscaasgftfsdyymawvrqgpgkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnakntlylqmnslraedtatyycarpstealfaywghgtlvtvss(seqidno:32)7e12vκdvvltqtpstlsvtpgqpasiscrssqsllndvgntylywylqkpgqspqlliylvsdlgsgvpnrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgiyycmqashapytfgqgtnleik(seqidno:33)7g09vh和vl氨基酸序列：7g09vhevqlvesdgglvqpggslrlscaasgftfsdyymawvrqgptkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnakntlylqmdslraedtavyycarpstealfaywghgtlvtvss(seqidno:34)7g09vκdivltqtpltlsvtpgqsvsiscrssqsllndvgntylywylqkpgqspqlliylvsdlgsgvpnrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqashapytfgagtrleik(seqidno:35)8f07vh和vl氨基酸序列:8f07vhevqlvesggglvqpggslrlscaasgfsfsdyymawvrqgpgkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnakntlylqmnslrsedtatyycarpstealfaywghgtlvtvss(seqidno:36)8f07vκdvvltqtpltlsvtpgqsvsiscrssqsllndvgntylywylqkpgqspqlliylvsdlgsgvpdrfsgsgsgtdftlkisgveaedvgvyycmqashapytfgagtkleik(seqidno:37)7f06vh和vl氨基酸序列:7f06vhevqlvesggglvqpggslklscaasgftfrdyymawvrqgpgkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnaknslylqmdslraedtavyycarpstealfaywghgtlvtvss(seqidno:38)7f06vκdvvltqtpltlsvtpgqpvsiscrssqsllndvgntylywylqkpgqspqlliylvsdlgsgvpnrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqashapytfgagtrlelk(seqidno:39)7f11vh和vl氨基酸序列：7f11vhevqlvesdgglvqpggslklscaasgftfsdyymawvrqgptkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnakntlylqmnslraedtavyycsrpstealfaywghgtlvtvss(seqidno:40)7f11vκdvvltqtpstlsvtpgqpvsiscrssqsllndvgntylywylqkpgqspqlliylvsdlgsgvpnrfsgsgsgtdftlkisgveaedvgvyycmqashapytfgagtrleik(seqidno:41)7e11vh和vl氨基酸序列:7e11vhevqlvesggglvqpggslrlscvasgftfsdyymawvrqapgkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnakntlylqmdslraedtavyycarpstealfaywgqgtlvtvss(seqidno:42)7e11vκdivltqtplslsatpgqsvsiscrssqsllndvgntylywylqrpgqspqlliylvsdlgsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycmqashapytfgagtnleik(seqidno:43)7f02vh和vl氨基酸序列:7f02vhevqlvesggglvqpggslklscaasgftfsdyymawvrqgpgkglewvatinydgsstyyresvkgrftisrdnaknslylqmnslrsedtavyycarpstealfaywghgtlvtvss(seqidno:44)7f02vκdvvmtqtpstlsatpgqsasiscrssqsllndvgntylywylqkpgqspqlliylvsdlgsgvpnrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgiyycmqashapytfgagtrlelk(seqidno:45)圖8a中顯示了大鼠7e5重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人源化7e5變體8g09,7e12,7g09,8f07,7f06,7f11,7e11和7f02的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的比對，其中標示了cdr1、2和3。圖8b中顯示了大鼠7e5輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與人源化7e5變體8g09,7e12,7g09,8f07,7f06,7f11,7e11和7f02的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的比對，其中標示了cdr1、2和3。大鼠7e5抗體的8種人源化變體的重鏈cdr1、2和3序列與大鼠7e5單抗中的重鏈cdr1、2和3序列(其氨基酸序列分別顯示于seqidno:6、7和8中)相同。同樣地，大鼠7e5抗體的8種人源化變體的輕鏈cdr1、2和3序列與大鼠7e5單抗中的輕鏈cdr1、2和3序列(其氨基酸序列分別顯示在seqidno:11、12和13中)相同。fab表達、純化和qc：為了在進一步測定法(即，補體介導的預致敏紅細胞裂解測定法、親和力測定、熔解溫度和聚集行為測定法)中表征一些7e5人源化變體，生成可溶性fab，并且從上文描述的8個克隆的前導組中純化。將所有8個人源化克隆加7e5野生型對照的fab基因通過sfii/noti消化克隆到pcb4表達載體(非常類似于pcb13但不具有基因3編碼序列)，并通過熱休克轉(zhuǎn)化到tg1大腸桿菌菌株中。使用clc主要工作臺軟件確認序列。在補充有0.1％葡萄糖和100μg/ml羧芐青霉素的800ml2xyt中進行含有來自pcb4-克隆的7e5人源化變體以及7e5野生型的可溶性fab的p.e.生成。在od6000.5-0.8時用至終濃度1mm的iptg誘導后，將培養(yǎng)物在24℃溫育至少20小時。用talon金屬親和樹脂純化可溶性fab。當在sds-page上運行500ng所得純化產(chǎn)物時，觀察到除了fab特異性條帶(在非還原和還原條件下分別為50kda和約25kda)之外的幾個額外條帶。為了進一步純化這些樣品，根據(jù)制造商的說明書使用了來自lifetechnologies的樹脂(captureselecttm親和樹脂igg-ch1，目錄#194320005)，其含有特異性結合人ch1域的vhh。通過使用微體積分光光度計測量od280nm并假定ε＝1.53的摩爾消光系數(shù)來估計所得到的純化蛋白質(zhì)的濃度。純化樣品的sds-page分析顯示高水平的純度。在elisa中證實了純化的fab的功能性，其中檢查了這些fab的連續(xù)稀釋液對在neutravidin包覆的maxisorp板上捕獲的10nm生物素化hc6的結合。所有8種純化的fab表現(xiàn)出對hc6的有效結合。biacore分析：為了測定7e5的人源化是否改變所得人源化抗體的結合特異性或活性，與野生型大鼠7e5單抗和小鼠27b1單抗相比對8種選擇的人源化fab(7e12,7e11,7f2,7f6,7f11,7g9,8f7和8f9)進行biacore親和力分析。在圖9中顯示了結果。結果指示7e5的人源化不改變抗體的特異性或活性。實施例7：人源化的抗c6抗體的“混合和匹配”表征在此實驗中，將來自所選擇的人源化抗c6抗體的一組人源化vh鏈和人源化vl鏈以各種組合在哺乳動物細胞中以全長抗體表達，并且評估其功能活性。使用的人源化vh鏈是實施例6中描述的8種vh鏈(8g09,7e12,7g09,8f07,7f06,7f11,7e11和7f02)，以及第9鏈7c02，其氨基酸序列顯示于seqidno:46。圖8a中顯示了這9條鏈的比對。使用的人源化vl鏈是實施例6中描述的8種vh鏈(8g09,7e12,7g09,8f07,7f06,7f11,7e11和7f02)，以及第9鏈7g08，其氨基酸序列顯示于seqidno:47。圖8b中顯示了這9條鏈的比對。將重鏈和輕鏈核苷酸序列克隆到表達載體中以創(chuàng)建具有穩(wěn)定的igg4(s228p)恒定區(qū)的全長鏈的編碼序列。在cho宿主細胞中以每種可能的組合成對共表達9種重鏈和9條輕鏈。因此，評估了9種重鏈和9種輕鏈的所有81種可能的“混合和匹配”組合。在溶血測定法和macelisa中各種測試了81對。對于每個測定法，使用4μg來自cho上清液的人源化7e5單抗。溶血測定法的結果示于圖7a中。macelisa的結果示于圖7b。結果證明了9種vh和9vl鏈的所有81種可能的“混合和配對”組合在這兩種測定法中都表現(xiàn)出強烈的抑制活性。實施例8：用于測試c6抗體對神經(jīng)再生的影響的動物模型使用神經(jīng)擠壓模型(坐骨神經(jīng)擠壓)測試抗人c6單克隆抗體(如大鼠7e5或人源化7e5)對補充有人c6的c6敲除大鼠(pvc)中感覺功能恢復的影響。神經(jīng)擠壓是周圍神經(jīng)損傷的一種模型。參見wo2010/005310(pct/nl2009/050418)；和dejonge等(2004)hummolgenet.13(3):295-302。為了治療，用人c6或?qū)φ?pbs)補充c6-/-大鼠(pvg，6-8周)。在擠壓損傷前一天(第-1天)以及在第0-6天每天一次在pbs中以4mg/kg的劑量在c6-/-大鼠中靜脈內(nèi)施用c6。在擠壓前10分鐘(第0天)(4mg/大鼠腹膜內(nèi)注射)開始，用抗人c6單抗處理補充有c6的大鼠和對照組。在神經(jīng)擠壓前5分鐘再次用抗人c6單抗(4mg/大鼠ip(腹腔注射))處理pvg大鼠。在第1-6天(4mg/大鼠腹腔注射)給予隨后的抗人c6單抗劑量。對照動物接受相同的神經(jīng)擠壓，但未用抗體處理。在擠壓后72小時處死動物的亞組以研究神經(jīng)組織學。選擇72小時，因為wallerian變性在野生型動物中此時是最大的，并且該時間點對于評估治療效力是信息量非常大的。如下進行神經(jīng)擠壓。所有手術程序均在深度異氟烷麻醉(2.5體積％異氟烷，1l/分鐘o2和1l/分鐘n2o)下無菌進行。將左大腿剃光，并且通過大腿上部中的切口暴露坐骨神經(jīng)。使用光滑的彎曲鑷子(no.7)將神經(jīng)在坐骨切口的水平上擠壓三個10秒時段，導致神經(jīng)上的擠壓區(qū)域的完全半透明的外觀。使用右腿作為內(nèi)部對照。然后，用縫合線閉合肌肉和皮膚。下文在表6中顯示了用重組抗人c6單抗7e5(12mg/kg)處理的實驗設置：表6：用于神經(jīng)擠壓實驗的實驗設置在損傷后3天時，對所有動物心臟內(nèi)灌注哌嗪-n-n'-雙(2-乙磺酸)(pipes)緩沖液(ph7.6)中的4％多聚甲醛。從每只動物中取出左和右坐骨神經(jīng)，并且距擠壓部位以遠端收集一段5mm長度。將每個區(qū)段常規(guī)加工成石蠟，用于免疫組織化學。將7微米厚的石蠟切片安裝在superfrostplus玻璃載玻片(knittelglass,germany)上。將切片脫蠟并再水合。在10mm檸檬酸鈉緩沖液(ph6.0)中通過熱誘導的抗原恢復暴露表位。使用pbs中的10％正常山羊血清(dako,glostrup,denmark)將抗體的非特異性結合在室溫下封閉20分鐘。將一抗在正?？贵w稀釋劑(immunologic,duiven,thenetherlands)中稀釋，并在室溫溫育1小時。通過在1％牛血清白蛋白中以1:200稀釋的來自sigma-aldrich(st.louis,mo)的山羊抗兔熒光素異硫氰酸酯(fitc)綴合的或綿羊抗小鼠cy3綴合的igg溫育切片進行檢測。當指定時，將載玻片用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)(sigma-aldrich)復染色，并安裝有vectashield安裝介質(zhì)(vectorlaboratories,burlingame,ca)。用附接到熒光顯微鏡(vanox,ahbt3；olympus,thenetherlands)的數(shù)碼相機(dp12；olympus,zoeterwoude,thenetherlands)捕捉圖像。圖10中顯示了結果。使用用于檢測mac的抗c9、用于檢測軸突的抗泛神經(jīng)絲(smi312)、用于檢測髓磷脂的抗髓磷脂堿性蛋白(mbp)和用于檢測吞噬細胞(巨噬細胞)的抗溶酶體膜(cd68)染色細胞。小圖a顯示未受損傷的坐骨神經(jīng)的結果，顯示缺乏mac、強軸突染色、環(huán)形髓磷脂染色和無活化的巨噬細胞。小圖b顯示損傷后的結果，其中具有正常補體活性的大鼠顯示mac沉積、軸突和髓磷脂的損失以及巨噬細胞的流入。小圖c顯示用抗c6處理c6重建大鼠后的結果，證明了抗體完全阻斷mac形成，抑制軸突和髓磷脂破壞并抑制巨噬細胞的流入。小圖d顯示未重構的c6-/-大鼠的結果，顯示缺乏mac沉積和快速神經(jīng)變性。因此，神經(jīng)擠壓實驗的結果證明了用7e5抗c6抗體的體內(nèi)處理成功阻斷mac形成，并且抑制了軸突和髓磷脂破壞并減少了巨噬細胞流入，從而證明了周圍神經(jīng)損傷的動物模型中抗體的體內(nèi)有效性。等同方案本領域技術人員將認識到或僅僅使用常規(guī)實驗便確定本文所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等同方案。此類等同方案意圖由所附權利要求書涵蓋。序列表概述序列表<110>f?巴斯(baas,frank)m?a?萬戴克(vandijk,marca.)<120>結合人c6的抗體及其用途<130>rgj-005pc<150>us62/094,649<151>2014-12-19<160>53<170>patentinversion3.5<210>1<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：肽418<400>1glysercysglnaspglyargglnleuglutrpglyleugluargthr151015<210>2<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：肽420<400>2aspglyargglnleuglutrpglyleugluargthrargleuserser151015<210>3<211>20<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：肽418/420<400>3glysercysglnaspglyargglnleuglutrpglyleugluargthr151015argleuserser20<210>4<211>354<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vh核苷酸序列<400>4gaggtgcagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgaaactc60tcctgtgtagcctcaggattctctttcagtgactattacatggcctgggtccgccagggt120ccaacgaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactat180cgagagtccgtgaagggccgattcactatctccagagataatgcgaaacgcaccctatac240ctgcaaatggacagtctgaggtctgaggacacggccacttattactgttcaagaccttct300acggaggccctgtttgcttactggggccacggcactctggtcactgtctcctca354<210>5<211>118<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vh氨基酸序列<400>5gluvalglnleuvalgluseraspglyglyleuvalglnproglygly151015serleulysleusercysvalalaserglypheserpheserasptyr202530tyrmetalatrpvalargglnglyprothrlysglyleuglutrpval354045alathrileasntyraspglyserserthrtyrtyrarggluserval505560lysglyargphethrileserargaspasnalalysargthrleutyr65707580leuglnmetaspserleuargsergluaspthralathrtyrtyrcys859095serargproserthrglualaleuphealatyrtrpglyhisglythr100105110leuvalthrvalserser115<210>6<211>5<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vhcdr1氨基酸序列<400>6asptyrtyrmetala15<210>7<211>17<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vhcdr2氨基酸序列<400>7thrileasntyraspglyserserthrtyrtyrarggluservallys151015gly<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vhcdr3氨基酸序列<400>8proserthrglualaleuphealatyr15<210>9<211>336<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vl核苷酸序列<400>9gatgttgtgctgacccagactccatccacattatcggctaccattggacaatcggtctcc60atctcttgcaggtcaagtcagagtctcttaaatgatgttggaaacacctatttatattgg120tatctacagaggcctggccaatctccacagcttctaatttatttggtctccgacctggga180tctggggtccccaacaggttcagtggcagtgggtcaggaacagatttcacactcaaaatc240agtggagtggaggctgaggatttgggaatttattactgcatgcaagctagtcatgctccg300tacacgtttggagctgggaccaacctggaactgaaa336<210>10<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vl氨基酸序列<400>10aspvalvalleuthrglnthrproserthrleuseralathrilegly151015glnservalserilesercysargserserglnserleuleuasnasp202530valglyasnthrtyrleutyrtrptyrleuglnargproglyglnser354045proglnleuleuiletyrleuvalseraspleuglyserglyvalpro505560asnargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile65707580serglyvalglualagluaspleuglyiletyrtyrcysmetglnala859095serhisalaprotyrthrpheglyalaglythrasnleugluleulys100105110<210>11<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vlcdr1氨基酸序列<400>11argserserglnserleuleuasnaspvalglyasnthrtyrleutyr151015<210>12<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vlcdr2氨基酸序列<400>12leuvalseraspleuglyser15<210>13<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成的：7e5vlcdr3氨基酸序列<400>13metglnalaserhisalaprotyrthr15<210>14<211>354<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的：8g09vh核苷酸序列<400>14gaggtgtagctggtggagtctgatggaggcttagtgcagcctggagggtccctgagactc60tcctgtgtagcctcaggattcactttcagtgactattacatggcctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtcgcaaccattaattatgatggtagtagtacttactat180cgagagtccgtgaagggcc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